WesternBlot技术原理及常见问题分析-2014

1、东胜创新东胜创新 科学仪器科学仪器部部2014.7Western Blot 简介： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。p 高分辨率的电泳技术高分辨率的电泳技术p 特异敏感的抗原

2、特异敏感的抗原- -抗体反应抗体反应p 1-5ng1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白q目的蛋白的表达特性分析q目的蛋白与其它蛋白的互作q目的蛋白的组织定位q目的蛋白的表达量分析两种蛋白（两种蛋白（47kDa47kDa和和55kDa)55kDa)的诱导表达分析的诱导表达分析 诱导剂：诱导剂：Q23Q23和和Q70Q70 温度：温度：3333和和3939 时间：时间：7 7天、天、1414天、天、2121天天示例示例2 2示例示例1 1proAproBIP: anti-proBNo IPWB: anti-proBWB: anti-proAproAIgGproBl蛋白样品的制备蛋白样品的制备

3、SDS-PAGESDS-PAGE转膜转膜封闭封闭一抗杂交一抗杂交二抗杂交二抗杂交底物显色底物显色 2SDS-PAGE上样缓冲液：上样缓冲液：DTT可临用前以可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。冻存。 按按1:1比例与蛋白质样品混合，比例与蛋白质样品混合，95100加热加热515min，冰上冷却后再上样，上样量一般为冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25l，总蛋白量，总蛋白量2050g。1M Tris-HCl(pH6.8)10 ml1M DTT20 mlSDS4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100ml 100mM

4、 Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰溴酚兰 20%甘油甘油 ddH2OSDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠 )：阴离子去污剂阴离子去污剂 变性剂变性剂氨基酸侧链与氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。胶束。蛋白质蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子

5、线性化。性化。q 不连续的电泳缓冲体系。q SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶成分凝胶成分M丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺 神经毒素！MSDSM配胶的Tris缓冲液MTEMED 神经毒素！M过硫酸铵(AP） 神经毒素！MTris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方及分离胶配方表：表：http:/ 灌制分离胶灌制分离胶 隔绝空气隔绝空气d

6、dH2O0.1%SDS:8%灌制浓缩胶灌制浓缩胶 插入梳子插入梳子 浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品加样槽加样槽蛋白质分蛋白质分子的迁移子的迁移方向方向 1 2 3 M电泳之后凝胶染色扫胶电泳之后凝胶染色扫胶注意：注意：做做western blot通常用预通常用预染染Marker！转膜 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法毛细管印迹法和电泳印迹法。 常用的电泳转移方法有湿转和半干转湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。 最常用于最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸的转移膜

7、主要是硝酸纤维素（纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟）膜和聚偏二氟乙烯乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，）膜，此外也有用尼龙膜、此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似膜的特点相似,主要用于主要用于核酸杂交。核酸杂交。 各种膜的详细特点介绍：各种膜的详细特点介绍： http:/ 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。 S 作用：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使

8、非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。S 封闭剂： 5%脱脂奶粉或BSA，或3%明胶溶于TBST Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）室温孵育室温孵育1h1h或或44过夜过夜注：注：Tween-20Tween-20的作用：减少非特的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。结合。一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育1.把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。2.用TBST漂洗膜3-5次，每次5-10min。3.加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，

9、于室温孵育1-2小时或4过夜。 4.用TBST漂洗膜3次，每次5-10min。5.最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。6.加入显色底物进行显色反应。加入一抗，室温孵育1-2小时或4过夜洗膜洗膜加入二抗，室温孵育1-2小时或4过夜洗膜洗膜显色显色125I标记的抗体X-光片压片显色 荧光基团标记的抗体凝胶成像仪 酶标抗体酶标抗体 ：如：如HRPHRP（辣根过氧化物酶）、（辣根过氧化物酶）、APAP（碱性磷酸酶）（碱性磷酸酶）等等成像方法成像方法：加酶的底物：加酶的底物产生产生化学发光化学发光反应反应HRP（辣根过氧化酶（辣根过氧化酶)AP（碱性磷酸酶）（碱性磷酸酶）大小大小40Kd140Kd最

10、佳酶活性最佳酶活性PH：57PH：810酶活和二抗特异性酶活和二抗特异性好于好于AP抑制剂抑制剂氰化物，氰化物，硫化物硫化物叠氮钠叠氮钠氰化物，氰化物，砷酸盐，有机磷，砷酸盐，有机磷，二价阳离子螯合剂二价阳离子螯合剂稳定性稳定性零度以下稳定零度以下稳定零度以下不稳定零度以下不稳定底物底物很多很多部分部分动力学特性动力学特性快速快速慢慢价格价格便宜便宜昂贵昂贵发光底物发光底物 ECL显色底物显色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP两种常用检测酶系统的比较两种常用检测酶系统的比较u 显色反应显色反应：HRPHRP敏感物敏感物TMBTMB，CNCN，DABDAB等底物等底物 优

11、点：方便、便宜，直接成像优点：方便、便宜，直接成像 缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、缺点：有毒、灵敏度较低、背景高、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测不能重新剥离检测辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）标记）标记 化学发光示意图化学发光示意图 碱式磷酸酶（碱式磷酸酶（AP）标记）标记 化学发光示意图化学发光示意图u 化学发光化学发光显色显色：目前使用最多的方法目前使用最多的方法 标标HRPHRP二抗加二抗加ECLECL底物化学发光反应底物化学发光反应 优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、优点：灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、 特异

12、性高、可重新剥离检测特异性高、可重新剥离检测灵敏度：灵敏度：MicroChemi 胶片曝光胶片曝光 压片压片 vs. CCD成像成像暗室压片MicroChemi CCD成像成像价格便宜，但需要不断投入比较贵，但只需一次投入有毒？有毒？有毒，污染环境无毒无毒，环保 操作复杂，需要技术经验简便易学，且可连续曝光不同时间成像质量压片后需要二次成像，图像质量损失严重一次性无损拍照，永久保存一次性无损拍照，永久保存成像后处理不可可后期调节对比度至理想状态是否能直接叠加Marker否，需要比对划线是，快速直接叠加动态范围动态范围比较小宽，可达到宽，可达到4.6个数量级个数量级是否可以定量分析是否可以定量分

13、析否是是，仪器自带图像分析软件显显影影液液定定影影液液(1)(1)压片压片(2)(2)显影显影(3)(3)定影定影(4)(4)晾干晾干(5)(5)存储存储1 1小时小时-1 -1天天1-101-10分钟分钟暗室操作过程暗室操作过程压片实例压片实例压片压片：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶片位置在：无法准确获得目的条带的大小，只能固定胶片位置在胶片上标出胶片上标出Marker的大概位置的大概位置CCD成像成像 动态范围大，能直接叠加动态范围大，能直接叠加Marker，便于后期图像的处理及分析，便于后期图像的处理及分析Marker直接叠加在化学发光图像上直接叠加在化学发光图像上 Wester

14、n Blot化学发光成像化学发光成像 特推荐东胜创新经营特推荐东胜创新经营DNR公司公司MicroChemi化学发光化学发光检测系统，灵敏度高，操作简便功能齐全，价格实惠检测系统，灵敏度高，操作简便功能齐全，价格实惠 产品产品特点：特点：l高灵敏度：高灵敏度：超亮大光圈镜头、大尺寸科学级超亮大光圈镜头、大尺寸科学级CCD、-60低温制冷三重配置为检测化学发光信号低温制冷三重配置为检测化学发光信号带来高灵敏度、高质量的成像效果带来高灵敏度、高质量的成像效果l一键拍照：一键拍照：整个拍照过程只需点击一个按钮，整个拍照过程只需点击一个按钮，即可获得精准高质图像即可获得精准高质图像l快速叠加快速叠加M

15、arker：落射白光实现样品与落射白光实现样品与Marker的准确定位，方便快速在的准确定位，方便快速在Western的图像上直的图像上直接叠加接叠加Marker l可清洗的样品盘：可清洗的样品盘：可完全抽出清洗，避免样可完全抽出清洗，避免样品间的交叉污染和实验台面的污染，延长仪器的使用品间的交叉污染和实验台面的污染，延长仪器的使用寿命寿命其他成像方法示例其他成像方法示例Western Blot结果分析 目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 分析软件如分析软件如GelQuant等等？ 转移到膜上的蛋白很少1.1.蛋白分子量蛋白分子量 10KD10K

16、D2.2.蛋白的等电点蛋白的等电点 93.3.SDSSDS浓度不合适浓度不合适4.4.凝胶太厚凝胶太厚 原因原因对对策策1.1.蛋白分子量蛋白分子量10KD10KD时，减时，减少转膜时间；使用小孔径少转膜时间；使用小孔径的膜的膜2.2.更换高更换高pHpH值值BufferBuffer3.3.在阴极在阴极bufferbuffer中加入中加入0.005 - 0.01% SDS 0.005 - 0.01% SDS 可提可提高转膜效率高转膜效率4.4.延长转膜时间延长转膜时间1.1.膜没有均匀浸湿膜没有均匀浸湿2.2.膜或者缓冲液污染膜或者缓冲液污染3.3.封闭不充分封闭不充分4.4.抗体与封闭剂出现

17、交抗体与封闭剂出现交叉反应叉反应5.5.抗体浓度过高抗体浓度过高 原因原因对对策策1.1.PVDFPVDF膜转膜前用膜转膜前用100%100%甲醇将膜甲醇将膜完全浸湿，转膜前用缓冲液浸完全浸湿，转膜前用缓冲液浸泡泡10min10min2.2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液更换新鲜转膜缓冲液3.3.更换封闭剂或延长封闭时间更换封闭剂或延长封闭时间4.4.检测一抗、二抗与封闭剂是否检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应有交叉反应 如有，更换封闭剂或抗体如有，更换封闭剂或抗体5.5.做预实验检测确定一抗、二抗做预实验检测确定一抗、二抗的最佳工作浓度的最佳工作浓度背景太高杂交信号很弱或没有1.1.抗体不适合于抗体不适合于western blot 2.抗体浓度太低浓度太低3.3.抗体保存不当抗体保存不当4.4.抗原不充足抗原不充足5.5.膜的漂洗过度膜的漂洗过度6.6.转膜不充分转膜不充分 原因原因对对策策1.1.设置阳性对照和内参蛋白设置阳性对照和内参蛋白2.2.加大抗体浓度加大抗体浓度3.3.抗体长期