项目六微生物分布测定技术

1、一、微生物在自然界中的分布一、微生物在自然界中的分布1.1.土壤土壤主要为细菌、放线菌、真菌、病毒。10-20cm处较多。2.2.水水病原菌主要有：伤寒沙门菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌，主要来自于病人、病畜的粪便。常用粪便含量较多的大肠埃希菌大肠埃希菌来作为判断指标。3.3.空气空气1.定义定义 正常条件下、寄居在人体体表或与外界相通的腔道中，对人体无害的微生物叫做正常菌群。 肠道、口腔、阴道和皮肤量最多，称为四大“菌库”。人体正常菌群数量大约为1200g。二、人体正常菌群二、人体正常菌群 口腔、呼吸道、外耳道、鼻咽、眼结膜、肠道、泌尿生殖道等结肠腔内正常菌群（电镜扫描图）2.生理作用生理作用生物拮

2、抗生物拮抗a.竞争黏附（占位性保护）作用 竞争上皮细胞表面受体，形成生物膜，使外来菌不能入侵机体，发挥屏障和占位性保护作用B.产生有害代谢产物抑制外来菌：酸类、H2O2 C.竞争营养物质指微生物之间的互相抵制、互相排指微生物之间的互相抵制、互相排斥、甚至互相残杀的斗争斥、甚至互相残杀的斗争营养作用营养作用正常菌群参与机体的物质代谢、营养物质转化及合成，如：大肠杆菌能合成b族维生素 免疫作用免疫作用抗衰老作用抗衰老作用正常菌群作为抗原：促进机体免疫器官发育；刺激免疫系统产生免疫应答，产生免疫效应物质通过产生SOD，清除O2-，保护组织细胞，如：双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌等抑癌作用抑癌作用自身产生的

3、多种酶类，使致癌物转化为无害物质激活巨噬细胞等发挥免疫功能，抑制肿瘤洁净度等级10万级到30万级三、制药设备、原料、人员等要求（三、制药设备、原料、人员等要求（P94）洁净度级别 尘埃最大允许数尘埃最大允许数/ /立方米立方米 微生物最大允许数微生物最大允许数 0.5um 5um 浮游菌个/立方米 沉降菌个/皿.30min 100 3500 0 5 1 10000 350,000 2,000 100 3 100000 3,500,000 20,000 500 10 300000 10,500,000 61,800 NANA 15 NA：阿伏伽德罗常数：6.02*1023（一）生长量测定法（一）

4、生长量测定法四、微生物测定技术四、微生物测定技术体积测量法（测菌丝浓度法）体积测量法（测菌丝浓度法）通过测量一定体积培养液中所含菌丝的量来反应微生物生长情况。0101方法：方法：取一定量的待测培养液（如10ml）放在有刻度的离心管中，设置一定的离心时间和转速，离心后，倒出上清液，测出上清液体积V，则菌丝浓度为（10-V）/10。特点：特点：大规模工业发酵常用指标，简单、快速、粗放。称干重法称干重法离心、清水洗涤后，再真空干燥称重。适合于丝状微生物生长量的测定。特点：繁琐0202比浊法比浊法细菌培养过程中、由于原生质含量增加会引起培养物浑浊度增加。可直接用眼睛观察或者分光光度计测定其浓度。030

5、3菌丝长度测定法菌丝长度测定法适用于丝状真菌和部分放线菌。方法方法：测定培养基上菌丝长度；在有刻度的玻璃管内接种微生物让其生长测量菌丝长度。0404特点特点不能反映菌丝总量不能计算菌落厚度和培养集中的菌丝操作方便、不易污染1.1.血球计数板法（简便、快速血球计数板法（简便、快速 P89P89） 将适当稀释的样品注入血球板的计数室中。由于计数室的容积是已知的（0.1mm3），计算一定微小体积内的菌数，即可计算出每克或每毫升样品中的菌数。（二）微生物计数法（二）微生物计数法菌体细胞数（菌体细胞数（cfu/ml）=小格内平均菌体细胞数小格内平均菌体细胞数400104稀释倍数稀释倍数计数室规格1. 1

6、6中格，25小格；2. 25中格，16小格。10的四次方是把0.1立方毫米换算为1毫升.103 mm=1 ml平皿菌落总数测定法是最常用的一种活菌计数法。菌落总数不等于细菌总数。每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞2.平板菌落计数法平板菌落计数法（1 1）平板菌落计数法程序）平板菌落计数法程序菌落计数选择23个适当稀释度悬液各1ml，加入无菌空培养皿内，每个稀释度做23个培养皿用生理盐水进行无菌稀释，做成几个适当稀释倍数的悬液每个培养皿中倾注约15ml熔化并冷却到46 左右的平板计数琼脂培养基，冷却后，于37培养48h 被检样品报告结果（2）观察工具）

7、观察工具v肉眼观察（直接、放大镜）v利用自动影像分析菌落计数仪（3）注意事项）注意事项A到达规定培养时间立即计数。B菌落计数的规则C当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计C菌落数的报告单位：cfu/ml；cfu/g。100cfu以内时 按四舍五入修约，以整数报告；100时 第三位数四舍五入修约，取前两 位数字，后面用0代替位数，也可用10的指数形式来表示。 例：205043210000 or 2.110510-1均数10-2均数描 述最终结果25536均在30300间则按计数公式多不可计345各平板均300，取稀释度最高者报告，余计为多不可数122均小于30则取稀释度最低者报告33029所有平板均不在30300CFU且一部分300者以最接近30或300者报告00所有平板均无菌落则记为 1乘以最低稀释倍数报告（4）结果表述2.61033.51041.21022.9103 110即 10A A薄膜过滤计数法薄膜过滤计数法将样品通过薄膜，使菌体被阻止在滤膜上，取下滤膜进行培养，计算菌落数。C C染色计数法染色计数法D D试纸剂法试纸剂法形式有小型厚滤纸片、琼脂片。方法方法：滤纸片和琼脂片上有培养基和指示