镍与多基因致癌作用试析论文

1、镍与多基因致癌作用试析论文 镍是人类生产、生活中的重要金属和人体必需微量元素，同时也是一种多系统、多器官、多细胞毒物。镍化合物已被确认为人类确证致癌物。许多报道认为：镍进入细胞后主要通过自由基作用、DNA-蛋白质交联及碱基甲基化等遗传、非遗传方式致癌1-5。我们就镍致癌过程中的多基因变异研究进行回顾，为镍的分子致癌机制研究提供参考。 一、镍与原癌基因的激活 就其本质而言，原癌基因是一类编码关键性调控蛋白的正常细胞基因，对细胞的正常生长有极其重要的作用。当其发生突变或异常表达时，就成为导致细胞恶变的癌基因6。在镍的致癌机制中，研究最多的是c-myc、c-ras、c-jun、c-fos癌基因和NF

2、B蛋白基因。 1.myc基因：myc基因表达DNA结合蛋白，分布于核内，参与RNA的加工、细胞周期调节及细胞分化。正常细胞中通常myc只在细胞分裂早期增加，而在许多癌细胞中均见到其异常表达。Sunderman等7在雄性Fisher-344大鼠单侧肾脏注射20mgNi3S2后，观察到肾癌及多种肉瘤，肿瘤细胞中染色体畸变多见，DNA斑点杂交和图像分析表明：N-myc基因表达明显增强，超出正常细胞6倍。说明Ni3S2明显诱导myc原癌基因的扩增。 2.ras癌基因：ras癌基因由4个外显子组成，编码p21蛋白，它定位于细胞膜内侧，其功能与G蛋白类似，是细胞内重要的信息传导分子。多数癌细胞ras通道被

3、不正常激活。Haugen8及Kawanishi等9先后发现镍致癌与ras癌基因有关。Kathleen等10用硫化镍和硫化亚镍诱发大鼠肾肉瘤后，用PCR方法在肾肉瘤细胞中发现k-ras基因的第12密码子存在GGTGTT的颠换，而其他密码子未发现突变现象。说明ras基因的第12密码子是镍的选择性攻击位点，ras原癌基因由于点突变而激活。此外，还发现ras基因被不正常激活后，肿瘤发生的潜伏期缩短，这与ras表达蛋白的功能有关。因为p21蛋白是调控细胞生长的重要分子，ras过度表达，细胞生长加速，故潜伏期变短。 3.AP-1(fos/jun)癌基因：c-fos和c-jun癌基因表达产物为核转录因子，是

4、信息通路的核内部分。DNA的转录和蛋白质的表达均与之有关。AP-1癌基因是c-fos和c-jun癌基因的杂合二聚体复合物，也具有上述性质11，许多肿瘤与之激活有关。Konstantin等12发现镍诱导c-fos和c-jun基因的表达。他们用氯化镍持续染毒BALB/c3T3细胞，结果该细胞株获得了对浓度高达200mol/L镍的抵抗力(故称B200细胞)。作者研究了镍对B200细胞和野生型3T3细胞AP-1的DNA结合活力，结果发现野生型3T3细胞AP-1的DNA结合力比B200细胞强。由于AP-1基因是c-fos和c-jun的二聚体，故作者随后用Northernblot法分析了c-fos和c-j

5、un的表达，取得了与上述一致的结果。c-jun和c-fos在野生型3T3细胞中表达要强，而B200细胞表达很低。说明镍能诱导转录因子AP-1(jun/fos)的表达。 4.NFB蛋白基因：NFB蛋白是结合于增强子的调控蛋白，参与多种细胞因子的活化。镍能诱导该调控蛋白的表达。Konstantin等12在比较B200细胞和野生型3T3细胞对镍的不同反应的实验中发现镍对NFB蛋白有诱导作用。 二、镍与抑癌基因的失活 抑癌基因与癌基因是一对矛盾的统一体，控制着细胞的生长和分化。在正常细胞中，抑癌基因通常处于一定程度的表达；而在肿瘤细胞中，抑癌基因经常丢失或失活。镍的致癌过程与Rb和p53等多种抑癌基因

6、的失活密切相关。 1.p53基因：在镍诱发的人肾上皮恶性转化细胞中，Haugen等13观察到p53基因的第238个密码子上有TC的颠换突变，即TGTCGT(CysArg)。Mahle等14用镍转化人肾上皮细胞，用p144D6、pYNZ22.1和pYNH37.3探针发现恶变细胞17号染色体短臂(17p)缺失。由于p53基因定位于17号染色体短臂，且p53基因变异常伴17号染色体缺失，故用PCR扩增p53基因，DNA测序发现了其238位密码子TC的突变。Harty等15对职业接触镍化合物的肺癌患者病理标本进行基因分析，发现p53基因的58外显子存在着GCTA型颠换突变。 2.Rb基因：Rb基因最早

7、在视网膜母细胞瘤的患者中发现缺失，随后发现它有重要的抑癌功能。镍的致癌作用也与Rb基因的变化有关。Lin等16用晶体硫化镍处理人成骨细胞(HOS)，使HOS细胞发生恶性转化。他们发现：恶变细胞中Rb蛋白(pRb)不能进行磷酸化，不能与SV40大T抗原形成复合物，而只能次磷酸化；当通过Rb表达载体将正常Rb基因转入镍转化的HOS细胞后，该细胞又具有正常表型，呈现接触抑制，且表达的pRb能被磷酸化。说明镍转化细胞中Rb基因失活了。 3.衰老基因：Catherine等17发现镍转化的中国仓鼠细胞X染色体长臂(xq)发生完全丢失，细胞获得不死性，并可在裸鼠身上致瘤。将正常细胞的X染色体经微细胞融合技术

8、转入转化细胞后，这些细胞出现死亡。由于X染色体上存在多个衰老基因，推测是镍引起X染色体上衰老基因的失活。Deborah等18则在镍转化的叙利亚仓鼠皮肤细胞(SHD)里发现衰老基因的失活，观察到是X染色体上的亚显微间隙基因缺失(sub-microscopicinterstitialgeneticdeletion)所致。 4.血小板反应蛋白(thrombospondin)基因：血小板反应蛋白是一种可接受促分裂原的钙结合蛋白，对血栓块有稳定作用。它在肿瘤发生学上的意义在于能够阻止肿瘤，具有抑制作用，故被认为也是抑癌基因19。Salnikow等20发现镍转化细胞中有一与血小板反应蛋白基因高度同源的DN

9、A片断丢失，血小板反应蛋白基因在镍转化细胞中呈低表达。单克隆抗体证明该表达蛋白存在于正常细胞，而在转化细胞中大大减少，说明血小板反应蛋白基因被抑制或失活。 三、镍致原癌基因激活和抑癌基因失活的机制 一般说来，原癌基因和抑癌基因在正常细胞中都只处于低水平的表达，只有在生长信号的刺激下，进入增殖时，癌基因才被激活，表达增强。例如ras基因被激活后，细胞明显增殖，而此时p53基因、Rb基因等抑癌基因表达也增强，对细胞的生长起负调控作用，待细胞生长停止后又复下降。但是如果原癌基因非正常表达增强或抑癌基因非正常失活，结果诱导细胞持续增生或恶变。已知镍引起多种原癌基因激活及抑癌基因失活。据分析，导致这一变

10、化的机制主要有点突变、缺失、扩增、DNA甲基化、染色体浓缩等方式。 1.点突变：以ras癌基因为例，在镍诱导的恶性转化细胞中，多次观察到镍选择性地引起H-ras或K-ras癌基因的第12密码子GT的突变9，10，即从GCT变为GTT，相应的编码氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸，单个碱基的变化使该基因处于激活状态，ras基因表达增强。同时，氨基酸的变化改变了编码蛋白p21的构象，使GAP(GTP酶结合蛋白)不能识别和激活p21的GTP酶，于是p21-GTP复合物不能水解成p21-GDP，p21处于持续活化状态，使细胞持续增殖21。 抑癌基因的失活也可以通过碱基点突变发生。p53抑癌基因就是如此。在镍诱导

11、恶变细胞和镍工肺癌细胞中均可见到该基因的点突变。例如：人肾上皮细胞受镍转化后，其p53基因的第238密码子上发生TC的颠换，即由TGTCGT13，14；镍工肺癌细胞可见GCTA的突变15。这些细胞的p53基因不能表达或表达极为低下。 2.丢失：基因丢失是基因失活的主要方式之一。在肠癌、肺癌等细胞常发生APC、Rb、p53、p16等抑癌基因的丢失。在镍恶性转化细胞中，也常观察到染色体缺失现象，例如17p，xq等部分缺失14，17，18，它们与p53及衰老基因的丢失有关。 3.基因扩增：基因扩增常常是癌基因激活及高表达的原因，染色体均染区(HSR)的出现被视为基因扩增的可见证据22。在镍所致肾肉瘤

12、细胞及转化细胞中就见到染色体均染区。同时，N-myc基因表达比正常细胞高6倍以上7，与人HL-60细胞N-myc基因扩增时见到的细胞遗传学变化一致。 4.碱基甲基化及染色质浓缩：基因的甲基化状态是调节基因表达的重要方式。DNA甲基化和染色体浓缩后造成的空间障碍，既不利于DNA的解链和解旋，又不利于转录因子与模板的结合，故基因表达失活或低下。一般而言，甲基化的基因常不表现活性，而表达的基因常处于非甲基化或低甲基化状态23。镍可以通过碱基甲基化而影响基因的表达。例如，镍转化的中国仓鼠细胞的X染色体长臂缺失，呈永生性。当往培养液中加入去甲基剂5-氮胞苷后，细胞逐渐衰老而死亡17。说明DNA甲基化是关

13、闭衰老基因的原因。此外，由于镍与异染色质的H1组蛋白有特异性亲和力，能诱导染色质浓缩和甲基化。Lee等24证实镍通过这种方式导致G12细胞的gpt基因关闭。他们观察到：在镍处理的培养细胞和游离核中，均可见到gpt基因特殊序列上DNA甲基化和染色质浓缩，相关基因gpt表达失活。若激活gpt基因表达，则DNA甲基化和染色质浓缩现象消失。 5.锌指(zincfinger)结构的改变：镍改变癌基因的表达可能与锌指蛋白有关。锌指蛋白是基因转录中反式作用因子结构上的DNA识别或结合结构域，包括锌指、锌扭(twist)和锌簇(cluster)。其共同特点是通过螺旋结合于DNA双螺旋结构的主沟中，参与基因转录

14、，其活性依赖于锌离子25。锌指结构富含半胱氨酸和组氨酸。由于镍对半胱氨酸和组氨酸具有特殊的亲和力，且与锌同属二价离子，故能与锌竞争性结合氨基酸残基，使锌指变为“镍指”，结果该结构发生扭曲，不能折叠，失去原有的立体结构，不能识别DNA特异位点，不能与之结合26。这可能是导致一些镍转化细胞中原癌基因失活不能表达的原因。此外，Sarker等27也发现镍能取代锌指结构中的锌，不过作者认为镍取代锌是为了与DNA结合，并通过产生自由基等损伤DNA，从而诱发肿瘤。从空间构象上来说，前者更有说服力。 四、多基因变异与镍致癌的关系 从以上研究可见，镍不但激活原癌基因如c-ras、c-myc、c-fos、c-ju

15、n等的表达，而且能抑制抑癌基因如p53、Rb、衰老基因等的表达。它们在镍致癌过程中如何起作用呢? 已经知道细胞的增殖遵循细胞周期，即从G1SG2MG1。在细胞周期中至少存在两个重要的“生长控制点”(checkpoints)，一是G1S转变期；一是G2M转变期。这两控制点都由一些重要癌基因蛋白调控。它们不仅能监控细胞数量的增加，而且能监视DNA损伤情况，阻止DNA损伤的细胞进入分裂期。例如：c-myc基因的表达能使细胞获得通过生长控制点的能力，而c-ras的表达则加强c-myc的这种作用。p53蛋白能使DNA损伤细胞停留在G1期，不进入复制。在正常细胞中，癌基因的表达受细胞生长的调节，也是周期性

16、的。但肿瘤细胞中，基因表达程度和次序发生紊乱，不再具有周期特异性。例如：在苯并(a)芘转化细胞中，c-myc持续性高表达，不具周期性，故细胞持续增殖。再如p53等抑癌基因失活，则损伤细胞仍可复制、增殖。镍诱导染色体畸变和DNA损伤已从许多方面得到了证实，而且由于多方面的作用，镍能引起原癌基因的激活和抑癌基因的失活。这样，一方面使得受损细胞能越过第一生长控制点(G1S)，同时由于p53、Rb等监控基因的失活，具有DNA损伤的细胞也进入分裂期(G2M)，使细胞癌变成为可能，并且在原癌基因大量表达的情况下，肿瘤的演变加速。 五、结语 综上所述，镍引起培养细胞的恶性转化和镍工肺癌的过程是一个多基因参与

17、和多基因变异的过程。这些研究为进一步寻找与镍致癌相关的基因提供了依据。已经发现的癌变相关基因就有100多种，而在镍致癌的研究中，前后发现的相关基因也不过10来种。很显然，就镍诱发的染色体、DNA损伤的复杂、多样性来看，与镍致癌相关的基因远不只上述几个，还有更多的基因有待研究。 参考文献 1HuangX,ZhuangZ,Frenkelk,etal.TheRoleofnickelandnickel-mediatedreactiveoxygenspeciesinthemechanismofnickelcarcinogenesis.EnvironHealthPerspect,1994,102:281-

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