工业微生物诱变育种(1)

1、 微生物的微生物的诱变育种诱变育种是以人工诱变手段诱是以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并且找出发产量高、性状优良的突变株，并且找出发挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使其在最适的环境条件下合成有效产物。其在最适的环境条件下合成有效产物。 工业微生物育种过程分为工业微生物育种过程分为三个阶段三个阶段: :1 1、菌种基因型改变；、菌种基因型改变；2 2、筛选菌种，确认并分离出具有目的基因、筛选菌种，确认并

2、分离出具有目的基因型或表型的变异株；型或表型的变异株；3 3、产量评估，全面考察此变异株在工业化、产量评估，全面考察此变异株在工业化生产上的接受性。生产上的接受性。理想的工业用菌株必须具备：理想的工业用菌株必须具备：1 1、遗传性状稳定、遗传性状稳定2 2、纯净无污染、纯净无污染3 3、能产生许多繁殖单位、能产生许多繁殖单位4 4、生长迅速，能在较短的时间内生产所要的产物、生长迅速，能在较短的时间内生产所要的产物5 5、可以长期保存、可以长期保存6 6、能经过诱变产生变异和遗传、能经过诱变产生变异和遗传7 7、生产能力具再现性、生产能力具再现性8 8、具有高产量高收效、具有高产量高收效诱变育种

3、的作用：诱变育种的作用：1 1、提高有效产物的产量、提高有效产物的产量2 2、改善菌种特性、提高产品质量、改善菌种特性、提高产品质量3 3、简化工艺条件、简化工艺条件4 4、开发新品种、开发新品种 第一节第一节 诱变育种的试验设计和准备诱变育种的试验设计和准备 工作工作 变异对微生物本身来说使其代谢向着异常变异对微生物本身来说使其代谢向着异常方向发展，必然引起菌体基本代谢失调，此时方向发展，必然引起菌体基本代谢失调，此时菌体虽然具有生活能力，但细胞的某些功能却菌体虽然具有生活能力，但细胞的某些功能却显著地降低了。显著地降低了。 高产突变型高产突变型是一种数量性状的遗传变异，是一种数量性状的遗传

4、变异，是由多基因决定的。结构基因、调节基因、渗是由多基因决定的。结构基因、调节基因、渗透基因、辅助基因等，这些基因不可能通过一透基因、辅助基因等，这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变。次诱变全部引起突变。 诱变育种诱变育种工作包括工作包括诱发突变诱发突变、突变株的筛选突变株的筛选和和高高产突变株最佳环境条件的调整产突变株最佳环境条件的调整。 诱发突变诱发突变包括包括出发菌株出发菌株、诱变剂诱变剂及其及其剂量的选剂量的选择择、影响诱变效果的因素影响诱变效果的因素。 突变株的筛选突变株的筛选包括包括筛选培养基和培养条件筛选培养基和培养条件及及选选择一个简便、快速、有效的筛选方法择一个简便、快速、

5、有效的筛选方法。 环境条件调整环境条件调整是是突变株的最佳培养条件改变。突变株的最佳培养条件改变。 具体要选育怎样的菌种，在诱变育种前，具体要选育怎样的菌种，在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和全面的了解。全面的了解。 诱变育种工作量大，周期长，对一般周期诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为为7-10d7-10d的抗生素菌种来说，一代诱变需的抗生素菌种来说，一代诱变需2-32-3个个月。月。1诱变育种诱变育种前期准备前期准备23456一、诱变前对出发菌株的了解一、诱变前对出发菌株的了解1 1、区分不同菌落类型区分不同菌落类型 一般情况

6、下在同一种培养基和培养条件下往往会一般情况下在同一种培养基和培养条件下往往会出现多种形态类型的菌落（约有出现多种形态类型的菌落（约有2 25 5种），不同类种），不同类型的菌落其代谢产物的生产能力有较大的差异。型的菌落其代谢产物的生产能力有较大的差异。2 2、出现不同菌落的原因出现不同菌落的原因 遗传因素决定；遗传因素决定； 常因为培养基组成或培养条件等的改变，引起菌常因为培养基组成或培养条件等的改变，引起菌落形态的变化落形态的变化 。 二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系系1 1、考查菌种的生活史，了解它们的形态、考查菌种的生活史，了解它们的形态、生

7、理，生化等生物学特性，以及这些特性生理，生化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系。与代谢产物合成的关系。2 2、菌种的某些生物学特性与产量合成的相、菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性关性 。 三、了解影响菌种生长发育的主要因素三、了解影响菌种生长发育的主要因素1 1、培养基、培养基2 2、培养基斜面制备技术、培养基斜面制备技术 3 3、移种的密度、移种的密度4 4、温度、温度5 5、湿度、湿度6 6、药品和原材料质量、药品和原材料质量四、了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合四、了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养条件的关系。成过程中与培养条件的关系。五、建立一个准确

8、、简便、快速检测产物的方五、建立一个准确、简便、快速检测产物的方法法六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件诱变育种的步骤和方法包括：出发菌株的选择；单孢子（或单细胞）菌悬液的制备；诱变剂及诱变剂量的选择；诱变的处理方法；以及菌种的纯化分离等。一、出发菌株一、出发菌株1、对一般出发菌株的要求、对一般出发菌株的要求2 2、选择具有一定生产能力或某种特牲的菌株作为、选择具有一定生产能力或某种特牲的菌株作为出发菌株出发菌株3 3、选择纯种作出发菌株、选择纯种作出发菌株 诱变中要选用单倍体、单核或少核的细胞为出诱变中要选用单倍体、单核或少核的细胞为出发菌株。发菌株。

9、 4 4、选择出发菌株应考虑其稳定性、选择出发菌株应考虑其稳定性5 5、连续诱变育种如何选择出发菌株、连续诱变育种如何选择出发菌株 “增变菌株增变菌株” - -缺乏缺乏DNADNA修复机制修复机制 6 6、选择出发菌株的其他因素、选择出发菌株的其他因素7 7、采用多出发菌株、采用多出发菌株8 8、菌种代谢特点、菌种代谢特点 二、出发菌株的纯化二、出发菌株的纯化纯种分离方法纯种分离方法: :常用常用划线分离法划线分离法和和稀释分离法稀释分离法。显微镜操纵器分离单孢子显微镜操纵器分离单孢子 三、单孢子（或单细胞）悬液的制备三、单孢子（或单细胞）悬液的制备1 1、供试菌株的孢子或菌株要年轻、健壮、供

10、试菌株的孢子或菌株要年轻、健壮。对数期对数期 霉菌孢子浓度约为霉菌孢子浓度约为10106 6/ml/ml，放线菌孢子约为，放线菌孢子约为10106 610107 7/ml/ml。 菌悬液的孢子或细菌数可用平皿计数，血球计数器计菌悬液的孢子或细菌数可用平皿计数，血球计数器计数或光密度法测定数或光密度法测定 。制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制理时，应采用相应的缓冲液配制 。2 2、菌悬液的制备方法、菌悬液的制备方法 细菌：细菌：最好在诱变处理前进行振荡预培养，这不最好在诱变处理前进行振荡预培养，这不仅使菌体分散

11、，得到单个细胞，还可利用温度和碳仅使菌体分散，得到单个细胞，还可利用温度和碳源控制其同步生长，取得年轻的、生理活性一致的源控制其同步生长，取得年轻的、生理活性一致的细胞；细胞； 孢孢 子：子：在试验中应尽量采用成熟而新鲜的在试验中应尽量采用成熟而新鲜的孢子，并且置于液体培养基中振荡培养到孢孢子，并且置于液体培养基中振荡培养到孢子刚刚萌发，即芽长相当孢子直径的子刚刚萌发，即芽长相当孢子直径的0.50.51 1倍、离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液制成倍、离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液制成孢子悬液，用血球计数法进行计数，调整菌孢子悬液，用血球计数法进行计数，调整菌体浓度。体浓度。不产孢子的菌丝体不产孢

12、子的菌丝体进行诱变处理进行诱变处理, ,有三种方法有三种方法: :第一、菌丝尖端法；第一、菌丝尖端法；第二、处理单菌落周围尖端菌丝；第二、处理单菌落周围尖端菌丝；第三、混合处理法。第三、混合处理法。 3 3、制备原主质体作为诱变材料、制备原主质体作为诱变材料（1 1）在丝状真菌中）在丝状真菌中（2 2）细胞具有细胞壁）细胞具有细胞壁（3 3）不产生孢子丝状菌）不产生孢子丝状菌四、诱变剂及诱变剂量四、诱变剂及诱变剂量（一）诱变剂种类的选择（一）诱变剂种类的选择 实践证明并非所有的诱变剂对某个出发菌株都实践证明并非所有的诱变剂对某个出发菌株都是有效的。一种诱变剂对是有效的。一种诱变剂对A A菌株有

13、较高的诱变效应；菌株有较高的诱变效应；对对B B菌株则可能相反。不同微生物对同一种诱变剂菌株则可能相反。不同微生物对同一种诱变剂敏感性有很大区别。敏感性有很大区别。1 1、根据诱变剂的诱变机制选择诱变剂、根据诱变剂的诱变机制选择诱变剂 选择诱变剂时要注意选择专一性比较强的诱选择诱变剂时要注意选择专一性比较强的诱变剂。变剂。 2 2根据菌种特性和遗传稳定性选择诱变剂根据菌种特性和遗传稳定性选择诱变剂3参考出发菌株原有的诱变系选择诱变剂参考出发菌株原有的诱变系选择诱变剂（二）最适诱变剂量的选择（二）最适诱变剂量的选择 由于各种微生物间遗传特性的差异，不同微由于各种微生物间遗传特性的差异，不同微生物

14、或同一种微生物的各个菌种对同一种诱变剂生物或同一种微生物的各个菌种对同一种诱变剂的最适剂量是有区别的。的最适剂量是有区别的。 在实际育种工作中，具体到某个菌种对某种在实际育种工作中，具体到某个菌种对某种诱变剂最适剂量的确定，作突变剂量曲线是比较诱变剂最适剂量的确定，作突变剂量曲线是比较可靠的。可靠的。 在判断诱变剂量时，采用抗药性突变是比较可在判断诱变剂量时，采用抗药性突变是比较可靠的。靠的。 剂量的大小常以致死率和变异率来确定剂量的大小常以致死率和变异率来确定。 五、诱变剂的处理方式五、诱变剂的处理方式可分为可分为单因子处理单因子处理和和复合因子复合因子处理。处理。 单因子处理单因子处理，是

15、采用单一诱变剂处理，一般认为单，是采用单一诱变剂处理，一般认为单因子不如复合因子处理效果好，这己经被很多事实因子不如复合因子处理效果好，这己经被很多事实所证实。所证实。 但当一种诱变剂对某个菌株确实是有效的诱变但当一种诱变剂对某个菌株确实是有效的诱变因子，那么单因子处理同样能够引起基因突变，效因子，那么单因子处理同样能够引起基因突变，效果也不错果也不错单一诱变剂处理，还可以减少菌种遗传单一诱变剂处理，还可以减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工作趋向简单化作趋向简单化。当然单因子处理，一般情况突变率。当然单因子处理，一般情况突变率比

16、复合因子要低，而且突变类型也比较少。比复合因子要低，而且突变类型也比较少。 复合因子处理复合因子处理是指两种以上诱变因子共同诱发菌是指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。体突变。又可以分为以下处理方式：又可以分为以下处理方式：1 1、两种以上因子同时处理、两种以上因子同时处理2 2、不同诱变剂交替处理、不同诱变剂交替处理 通常以化学因子和物理因子交替进行效果较通常以化学因子和物理因子交替进行效果较好。好。3 3、同一种诱变剂连续重复使用、同一种诱变剂连续重复使用 经过一种诱变剂处理后的菌悬液，培养数小时经过一种诱变剂处理后的菌悬液，培养数小时之后（细菌或酵母），使细胞分裂之后（细菌或酵母），使细

17、胞分裂1-21-2代，接着再代，接着再处理，有时还可反复多次，最后进行分离筛选。诱处理，有时还可反复多次，最后进行分离筛选。诱发能力强的、对基因作用较为广谱的诱变剂可连续发能力强的、对基因作用较为广谱的诱变剂可连续重复使用，有益于变异乎的提高。但是单因子连续重复使用，有益于变异乎的提高。但是单因子连续使用代数不能过多，否则也会出现使用代数不能过多，否则也会出现“钝化钝化”现象。现象。4 4、紫外线光复活交替处理、紫外线光复活交替处理 经紫外线照射后的菌体或菌悬液，暴露在日经紫外线照射后的菌体或菌悬液，暴露在日光中一定时间，接着用剂量更大的紫外线继续光中一定时间，接着用剂量更大的紫外线继续照射，

18、然后再让其光照复活，经多次紫外线照照射，然后再让其光照复活，经多次紫外线照射和光照复活交替，可以增加变异率，提高变射和光照复活交替，可以增加变异率，提高变异幅度。异幅度。5 5、诱变剂处理时间与诱变效应的关系、诱变剂处理时间与诱变效应的关系 在头孢菌素在头孢菌素C C产生菌选育中用甲基磺酸乙产生菌选育中用甲基磺酸乙酯低浓度、长时间处理与高浓度、短时间处理酯低浓度、长时间处理与高浓度、短时间处理的诱变效应是不同的，在致死率大致相同的情的诱变效应是不同的，在致死率大致相同的情况下，前者比后者不仅正突变率高，而且提高况下，前者比后者不仅正突变率高，而且提高的幅度也大的幅度也大。 处理具体方法处理具体

19、方法1 1、直接处理方式，将菌悬液用物理、化学因子处理，、直接处理方式，将菌悬液用物理、化学因子处理，然后分离，直接处理是最常用的方式。然后分离，直接处理是最常用的方式。2 2、生长过程处理，适用于诱变作用强的而杀菌率较、生长过程处理，适用于诱变作用强的而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过程中只对低的诱变剂，或在分裂过程中只对DNADNA起作用的诱起作用的诱变剂，如变剂，如NTGNTG、秋本仙碱等、秋本仙碱等。 六、影响突变率的因素六、影响突变率的因素（一）菌种遗传特性不同（一）菌种遗传特性不同（二）菌体细胞壁结构（二）菌体细胞壁结构 丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱丝状菌孢子壁的厚度及表面

20、的蜡质会阻碍诱变剂渗人细胞，减弱与变剂渗人细胞，减弱与DNADNA的作用。一般加的作用。一般加大诱变剂量，效果会好一些。细胞壁含有大诱变剂量，效果会好一些。细胞壁含有蜡质的微生物，常用一定浓度的洗衣粉、蜡质的微生物，常用一定浓度的洗衣粉、脂肪酶处理，除去蜡质，提高诱变效果。脂肪酶处理，除去蜡质，提高诱变效果。（三）环境条件的影响（三）环境条件的影响1 1、诱变前预培养和诱变后培养、诱变前预培养和诱变后培养 出发菌株不管在诱变前或诱变后进行培养时，出发菌株不管在诱变前或诱变后进行培养时，营养丰富的培养基中出现突变株的数量总是比营养营养丰富的培养基中出现突变株的数量总是比营养贫乏的培养基中多。贫乏

21、的培养基中多。菌株菌株在诱变前通常进行在诱变前通常进行预培养预培养。 后培养后培养是指诱变后的菌悬液不直接分离于平板，是指诱变后的菌悬液不直接分离于平板，而是立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。而是立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。 诱变处理后保存于冰箱中的菌体悬液成分会影诱变处理后保存于冰箱中的菌体悬液成分会影响突变体的成活率，应加一些使正突变个体和总菌响突变体的成活率，应加一些使正突变个体和总菌数的死亡率减低的物质，如酪素水解蛋白、色氨酸数的死亡率减低的物质，如酪素水解蛋白、色氨酸等。等。 2 2、温度、温度、pHpH值、氧气等外界条件对诱变效应的值、氧气等外界条件对诱变效应的影响影

22、响3 3、平皿密度效应、平皿密度效应 对抗性突变株或营养缺陷突变株，对抗性突变株或营养缺陷突变株，常常用选择性培养基进行筛选。常常用选择性培养基进行筛选。 对产量突变来说对产量突变来说，由于高产菌株，由于高产菌株和负变菌株都能在同一个培养基上生长，和负变菌株都能在同一个培养基上生长，难以采用选择性培养法进行筛选。难以采用选择性培养法进行筛选。 筛选突变株，首先根据筛选目的进行。筛选突变株，首先根据筛选目的进行。由于微生物正突变概率极小，仅由于微生物正突变概率极小，仅0.050.050.2%0.2%，产量提高，产量提高1010以上突变株也以上突变株也只有只有1/3001/300，所以挑选的菌落愈

23、多，概率，所以挑选的菌落愈多，概率就愈高。就愈高。投产率投产率多数不宜投产多数不宜投产少数适宜投产少数适宜投产大多死亡大多死亡少数存活少数存活存活率存活率多数未变多数未变少数突变少数突变突变率突变率多数负变多数负变少数正变少数正变正变率正变率多数幅度小多数幅度小少数幅度大少数幅度大高产率高产率出发菌株出发菌株诱诱变变一、诱变育种的基本环节一、诱变育种的基本环节二、筛选的程序二、筛选的程序1 1、常规筛选程序、常规筛选程序 这是传统选育中常用的方注，挑选的菌落这是传统选育中常用的方注，挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定。直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定。2 2、简便法筛选程序、简便法

24、筛选程序 在常规筛选法甚础上进一步改进：一方面在常规筛选法甚础上进一步改进：一方面分离在平皿上的菌落采用琼脂块法，每代诱变处理分离在平皿上的菌落采用琼脂块法，每代诱变处理后打后打1000100030003000块琼脂菌落，甚至更多、另一方面，块琼脂菌落，甚至更多、另一方面，初筛摇瓶发酵液中产物分析，采用简便、快速的琼初筛摇瓶发酵液中产物分析，采用简便、快速的琼脂平板测定法脂平板测定法或其他简便方法。或其他简便方法。p109p109 常规筛选常规筛选一个出一个出发菌株发菌株诱变剂诱变剂处理处理选出选出200200个单个单 孢子菌菌株孢子菌菌株初筛初筛（每株（每株1 1瓶）瓶）选出选出5050株株

25、复筛复筛（每株（每株4 4瓶）瓶）选出选出5 5 株株第一轮第一轮第二轮第二轮五个出发菌株五个出发菌株初筛初筛（每株（每株1 1瓶）瓶）选出选出5050株株复筛复筛（每株（每株4 4瓶）瓶）选出选出5 5 株株4040株株4040株株4040株株4040株株4040株株诱变剂诱变剂处理处理三、分离和筛选三、分离和筛选 突变类型：形态突变型和生化突变型突变类型：形态突变型和生化突变型 多级水平筛选多级水平筛选就是就是让诱变后的微生物群体相继通让诱变后的微生物群体相继通过一系列的筛选，每级只取一定的百分数的变异株，过一系列的筛选，每级只取一定的百分数的变异株，使被筛选的菌株逐步浓缩使被筛选的菌株逐

26、步浓缩。 多级水平筛选多级水平筛选中经过平板筛选。留取中经过平板筛选。留取5-10%5-10%，约挑，约挑选选200200株；第二阶段是摇瓶初筛，选取株；第二阶段是摇瓶初筛，选取2525-30-30，第，第三阶段摇瓶复筛，选出三阶段摇瓶复筛，选出1-31-3株高产变株。有条件再进行株高产变株。有条件再进行小型发酵罐试验。小型发酵罐试验。（一）随机筛选（一）随机筛选 也称摇瓶筛选。主要是随机挑选的平皿菌落也称摇瓶筛选。主要是随机挑选的平皿菌落进行摇瓶筛选。初筛挑选菌落起码要进行摇瓶筛选。初筛挑选菌落起码要200200个。个。（二）平板菌落预筛（二）平板菌落预筛1 1、根据形态筛选变株、根据形态筛

27、选变株2 2、根据平皿生化反应筛选突变株、根据平皿生化反应筛选突变株透明圈、显色圈、抑制圈及混浊圈等生化反应来筛透明圈、显色圈、抑制圈及混浊圈等生化反应来筛选。选。3 3、采用冷敏感菌筛选抗生素突变株、采用冷敏感菌筛选抗生素突变株4 4、浓度梯度法、浓度梯度法5 5、应用复印技术快速筛选突变体、应用复印技术快速筛选突变体6 6、琼脂块大通量筛选变株、琼脂块大通量筛选变株 四、摇瓶液体培养四、摇瓶液体培养 常规随机筛选的全过程，都要通过摇瓶培常规随机筛选的全过程，都要通过摇瓶培养，而平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后，养，而平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后，弃去大量低产菌株，被挑选的菌落移入试管斜

28、弃去大量低产菌株，被挑选的菌落移入试管斜面，然后再进行摇瓶液体培养；才能逐步地筛面，然后再进行摇瓶液体培养；才能逐步地筛选出高产菌株。选出高产菌株。 五、产物活性测定五、产物活性测定1 1、琼脂平板活性圈法、琼脂平板活性圈法2 2、滤纸片法、滤纸片法3 3、琼脂薄层纸片法、琼脂薄层纸片法 筛选菌种为一种重复性和计量性的工作，筛选菌种为一种重复性和计量性的工作，所以必须应用统计所以必须应用统计方法。区别并肯定其产量上方法。区别并肯定其产量上的差异。以便的差异。以便进行下轮育种的评估。进行下轮育种的评估。 六、摇瓶数据的调整和有关菌株六、摇瓶数据的调整和有关菌株特性的观察分析特性的观察分析 对摇瓶

29、发酵液的测试数据要尽量应用生物学对摇瓶发酵液的测试数据要尽量应用生物学统计方法来处理，以便从复杂的差异中，去伪统计方法来处理，以便从复杂的差异中，去伪存真，由此及彼，抓住本质，找出其中真正的存真，由此及彼，抓住本质，找出其中真正的规律性。规律性。七、培养基和培养条件的调整七、培养基和培养条件的调整 培养基和培养条件的调整，常采用正培养基和培养条件的调整，常采用正交法和二次旋转均匀设计。交法和二次旋转均匀设计。八、变种的特性研究与鉴定八、变种的特性研究与鉴定 要研究菌种的纯度、遗传稳定性、菌落类型、群要研究菌种的纯度、遗传稳定性、菌落类型、群体的形态、生活能力、产孢子多少，保藏培养基及保体的形态

30、、生活能力、产孢子多少，保藏培养基及保藏方法、菌种碳、氮源利用情况、菌丝生长速度、菌藏方法、菌种碳、氮源利用情况、菌丝生长速度、菌丝量、发酵液粘度、过滤难易状况；注意考察菌种抗丝量、发酵液粘度、过滤难易状况；注意考察菌种抗生素的组分变化，色素等质量问题；研究最适移种期、生素的组分变化，色素等质量问题；研究最适移种期、移种量、通气搅拌、温度、移种量、通气搅拌、温度、pHpH等。等。 优良菌株选育后，还应该从分子水平进一步优良菌株选育后，还应该从分子水平进一步对变株的生理生化特性加以鉴定以全面了解菌株各种对变株的生理生化特性加以鉴定以全面了解菌株各种属性这是考核菌株突变的重要指标，也是为菌株进属性

31、这是考核菌株突变的重要指标，也是为菌株进一步的研究和应用提供有指导意义的参考数据一步的研究和应用提供有指导意义的参考数据。九、诱变育种实例九、诱变育种实例（一）碱性脂肪酶高产变株FS1884的选育1原生质体作为诱变材料2采用定向控制的理性筛选抗阻遏和解除反馈抑制筛选模型3初筛来用大通量的琼脂块法4结合饰变育种1 1原生质体作为诱变材料原生质体作为诱变材料 制备原生质体，用制备原生质体，用0.60.6纤维素酶纤维素酶+0.6%+0.6%蜗牛酶处蜗牛酶处理理3h3h， 0.60.6 NaCINaCI0.3%CaCl20.3%CaCl2作稳定剂，可获得原作稳定剂，可获得原生质体。采用麸皮琼脂粉作为再

32、生培养基。生质体。采用麸皮琼脂粉作为再生培养基。 将菌体制备成原生质体后，用将菌体制备成原生质体后，用UVUV、和、和He-NeHe-Ne，激光，激光进行诱变。经筛选发现，原生质体对诱变剂的敏感性进行诱变。经筛选发现，原生质体对诱变剂的敏感性要比孢子大得多。要比孢子大得多。 2 2采用定向控制的理性筛选采用定向控制的理性筛选抗阻遏和解除反馈抗阻遏和解除反馈抑制筛选模型抑制筛选模型 脂肪酶和其他水解酶类同样受终点产物或分解代谢产物阻遏的调节，琥珀酸钠是脂肪酶的产物类似物，是该酶合成的阻遏物结构类似物，因此可以用琥珀酸钠来筛选抗阻遏突变株。筛选高渗透性菌株以解除胞内产物反馈抑制作用，达到提高酶产量

33、的目的。 制霉菌素能抑制真菌细胞膜麦角固醇的合成，引起胞膜透性的改变，可以用它筛选高渗透型突变株。将琥珀酸钠和制霉菌素分别以一定浓度加人到分离平板、有抗性的菌落陆续长出，这样大幅度的浓缩了所需要筛选的菌株，加速育种的进度,从75U/ml逐步提高到7800U/m。3 3初筛来用大通量的琼脂块法初筛来用大通量的琼脂块法 把琼脂块的菌落培养到产酶高峰期，然后移至油把琼脂块的菌落培养到产酶高峰期，然后移至油脂乳化液作为底物的鉴定平板上；在一定温度下培脂乳化液作为底物的鉴定平板上；在一定温度下培育后，根据透明圈出观快慢、大小及清晰度来决定育后，根据透明圈出观快慢、大小及清晰度来决定取舍。每代诱变后可挑取

34、菌落取舍。每代诱变后可挑取菌落l000l000一一30003000株，在初株，在初筛阶段可淘汰约筛阶段可淘汰约95%95%低产菌株，这样大大提高了筛低产菌株，这样大大提高了筛选的工作效率选的工作效率。第四节第四节 营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型：营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养物野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养物质的能力，只有在基本培养基中补充所缺少的营养因子才质的能力，只有在基本培养基中补充所缺少的营养因子才能生长。能生长。营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选方法营养缺陷型突变株的筛选方法诱变诱变检

35、出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）（菌丝过滤法）（菌丝过滤法）（高温杀菌法）（高温杀菌法）点植对照法点植对照法夹层培养法夹层培养法限量补充培养法限量补充培养法逐个检出法逐个检出法影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法 2020种氨基酸的排列编组种氨基酸的排列编组第五节第五节 温敏突变株的筛选温敏突变株的筛选温敏突变株（温敏突变株（temperature-sensitive mutant,TS,TS突变株）突变株）：在许可的温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别，在在许可的温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别，在

36、非许可的温度条件下不能生长或微弱生长，表型和野生型不非许可的温度条件下不能生长或微弱生长，表型和野生型不同。同。一一 温敏突变株的特性温敏突变株的特性1 1、主要是必须基因的突变、主要是必须基因的突变2 2、错义突变或移码突变、错义突变或移码突变二二 温敏突变株的筛选方法温敏突变株的筛选方法1 1、诱发、诱发 抗生素法抗生素法2 2、富集、富集 过滤或离心法过滤或离心法 H3- H3-前体法前体法3 3、分离筛选、分离筛选常规法和特殊分离筛选常规法和特殊分离筛选三三 温敏突变株在发酵工业中的应用温敏突变株在发酵工业中的应用1 1、TSTS突变株在谷氨酸的发酵中的应用突变株在谷氨酸的发酵中的应用

37、2 2、TSTS突变株在丝氨酸发酵中的应用突变株在丝氨酸发酵中的应用3 3、微生物单细胞蛋白的生产、微生物单细胞蛋白的生产一、烈性噬菌体及其效价的测定一、烈性噬菌体及其效价的测定 一般情况下每种噬菌体所形成噬菌斑的形态是相对一般情况下每种噬菌体所形成噬菌斑的形态是相对稳定的，但有时也随着寄主生理状态、菌龄及培养条稳定的，但有时也随着寄主生理状态、菌龄及培养条件不同而变化。噬菌斑的这些形态特征可以作为鉴定件不同而变化。噬菌斑的这些形态特征可以作为鉴定指标，也可利用其进行纯种分离和计数。指标，也可利用其进行纯种分离和计数。每毫升试样每毫升试样中所含有的侵染性的噬菌体粒子数称为效价，中所含有的侵染性的噬菌体粒子数称为效价，以下是以下是几种噬菌体的分离和效价测定方法。几种噬菌体的分离和效价测定方法。1 1重层琼脂法重层琼脂法2 2单层平板法单层平板法3 3快速测定法快速测定法4 4斑点试验法斑点试验法 微生物中溶源菌广泛存在于细菌中，在发酵生产中微生物中溶源菌广泛存在