5.2 多聚酶链式反应扩增DNA片段 课件 （32张PPT）

1、资料一资料一：刑侦破案杀手锏法医DNA鉴定技术，需要用到大量凶手DNA。资料二资料二：肝炎病毒感染初期症状并不明显，抽取的血液中病毒含量也很少，在检测技术比较落后的时期常常造成误诊。资料三资料三：新型冠状病毒(2019-nCoV)抗体检测、新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测。新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒是用于快速进行体外定性检测新型冠状病毒(RdRp基因、N基因、E基因)的医疗检测用品。它的工作原理是通过提它的工作原理是通过提取病人样本中的取病人样本中的RNA，进行反转录聚合酶链反应，进行反转录聚合酶链反应(RT-PCR)，通过扩增反应将样本通过扩增反应将样本中微量

2、的病毒信息进行放大中微量的病毒信息进行放大，最后以荧光的方式读取信号。如果，最后以荧光的方式读取信号。如果PCR之后信号为之后信号为阳性，那么就可以认为样本中存在病毒阳性，那么就可以认为样本中存在病毒(已经感染已经感染)，反之表明样本中没有病毒，反之表明样本中没有病毒(未未感染感染)。资料四资料四：在刑事侦破案件或遗传病的诊断过程中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效有效地解决了因为样品中地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的

3、诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。华师附中汕尾学校 杨宇涛（一）PCR原理1.多聚酶链式反应（PCR）：一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。2.细胞内的DNA复制（回顾）DNA的基本单位：脱氧核糖核苷酸DNA分子的结构：含氮碱基含氮碱基磷酸磷酸5 5脱氧脱氧核糖核糖O O1 12 23 34 45 5DNA的羟基羟基(-OH)末端称为3端，而磷酸基团磷酸基团的末端称为5端。3355（一）PCR原理2.细胞内的DNA复制（回顾）DNA的基本单位：脱氧核糖核苷酸DNA分子

4、的结构：（两条链）反向平行，双螺旋结构DNA复制的时间：发生在有丝分裂的间期和减数第一次分裂间期DNA复制的场所：细胞核（主要）、线粒体、叶绿体DNA复制的特点：边解旋边复制、半保留复制、多起点复制（一）PCR原理2.细胞内的DNA复制（回顾）DNA复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物打开打开DNADNA双链双链提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNADNA子链子链工作需要消耗工作需要消耗ATPATP催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键不能从头不能从头开始合成，开始合成，只能从只能从33端

5、延伸端延伸DNADNA链链子链只从引物33端开始延伸端开始延伸；子链的合成方向总是55端向端向 3 3端端。使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的33端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸作为作为DNADNA复复制的起点制的起点（一）PCR原理3.PCR(体外的DNA复制)的条件DNA分子的热变性热变性原理在80-100 的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性变性。温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链重新结合成双链，这个过程称为复性复性。参与的组分解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物DNA双链单链 变性（加热变性（加热80-10080-1

6、00） 复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）（一）PCR原理3.PCR(体外的DNA复制)的条件耐高温的Taq DNA聚合酶高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。 自然引物（细胞内的DNA复制）：RNA引物 人工引物（PCR）：DNA单链（主要）或RNA分别与两条模板链相结合的两种引物（引物和引物）参与的组分解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（一）PCR原理3.PCR(体外的DNA复制)的条件控制温度，但不需解旋酶；DNA模板；四种脱氧核苷酸；耐高温的聚合酶（Taq DN

7、A聚合酶）；分别与两条模板链相结合的两种引物（引物和引物）；需要在一定的缓冲液中进行。（二）PCR的反应过程1.PCR的反应步骤：一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性解旋，9494（二）PCR的反应过程1.PCR的反应步骤：一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性解旋，9494复性引物与模板链结合，5555不考虑模板链重新结合不考虑模板链重新结合：模板模板DNADNA比引物复杂的多；比引物复杂的多；加入引物的量足够多而模板链数量少；加入引物的量足够多而模板链数量少；引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。引物

8、和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。（二）PCR的反应过程1.PCR的反应步骤：一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性解旋，9494复性引物与模板链结合，5555延伸DNA新链由5端向3端延伸（引物端为新链5端），7272（Taq DNA聚合酶最适温度）第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列5引物5引物第二次循环第一次循环555555模板DNA55 5555 552530 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。引物数引物数= =新增单链数新增单链数=22=22n n-2-25引物5引物第二次循环第一次

9、循环555555模板DNA55 5555 555引物5引物第三次循环555555555555（二）PCR的反应过程1.PCR的反应步骤：一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步2.循环过程变性：解旋，9494复性：引物与模板链结合，5555延伸：DNA新链由5端向3端延伸，72723.PCR的反应结果从第二轮循环开始，前一轮循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸。 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，等长DNA从第三轮循环开始出现，这段固定长度的序列呈指数扩增。例：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，

10、主要有两点不同，它们是（ ）PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNAPCR过程不需要DNA聚合酶PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A B C DC C例：PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物延伸而成的DNA单链作模板时将（ ）A仍与引物结合进行DNA子链的延伸B与引物结合进行DNA子链的延伸C同时与引物和引物结合进行子链的延伸D无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链B B解析：当有引物延伸而成的DNA单链做模板时，此单链引物端为5端

11、，与它互补的子链此端为3端，因此新子链应从另一端开始合成，即由引物结合延伸DNA的子链。55（一）设备与用具1.PCR仪一台能够自动调控温度的仪器2.微量离心管进行PCR反应的场所，一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3.微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次（二）实验操作步骤准备移液混合离心反应（二）实验操作步骤准备移液混合离心反应按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。p62（PCR反应体系的配方）（二）实验操作步骤准备移液混合离心反应用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。（二）实验操作步骤准备移液混合离心反应过程

12、：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。注意：A.离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。B.手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。（二）实验操作步骤准备移液混合离心反应过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。（二）实验操作步骤准备移液混合离心反应将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率（二）实验操作步骤准备移液混合离心反应【注意事项】 避免外源DNA等因素的污染隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；分装试剂，简化操作程序，

13、使用一次性枪头。例：在PCR实验操作中，下列说法不正确的是()A在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头B离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢C用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合D离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果A A（一）理论上DNA扩增数目的计算1.一条DNA，复制n次， DNA为2n2.a条DNA，复制n次， DNA为a 2n（二）实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关2.过程稀释： 2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零：以蒸馏

14、水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零（二）实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关2.过程测定：取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值计算：DNA含量（g/mL）50(260nm的读数)稀释倍数50（常数）：1g /ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02紫外分光光度计紫外分光光度计比比色色杯杯B B1如图表示细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增两个过程，两反应过程的条件中相同的是()A模板 B原料 C酶 D能量供应解析：本题主要考查细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增的知识，意在考查考生对细胞内外DNA复制条件的理解。选项A模板不同，胞内DNA复制以整个DNA分子作为模板，PCR扩增却以一段目的DNA作为模板。选项B原料相同，均以4种脱氧核苷酸为原料。选项C酶不相同，胞内DNA解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等；胞外PCR扩增通过高温解旋而不需要解旋酶，延伸只需热稳定的Taq DNA聚合酶。选项D能量供应不同，胞内DNA复制过程由ATP提供能量，而PCR扩增主要由外界供能。D D2下列关于PCR的描述中，正确的是()PCR是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性扩增DN