植物分子育种学

1、植物分子育种学的概念运用分子生物学技术的科学性与先进性，即可以将不同物种的遗传物质（DNA或基因）导入受体细胞，再进行培育与选择，从而育出符合育种目标要求的新品种。植物分子育种可概括为三个层次上的工程技术：1. 将带有目的性状基因的供体总DNA片段导入欲改良的植物受体细胞，使其后代发生变异，从中筛选出获得目的性状的后代或符合需要的有价值的新类型，培育出高产、优质、高抗的新品种；2 .分离目的基因，构建重组分子，导入需要改良的植物受体细胞，经过筛选，培育出获得目的性状，且综合性状优良的后代，育出新品种。3 .分子标记层次。植物分子育种的特点使遗传物质能在不同的植物间，甚至在植物、动物和微生1、打

2、破物种分类的界限，充分利用自然界丰富的遗传资源， 物之间进行交流；如卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞；或者幼胚、幼苗、芽丛分DNA或基因的导入、整合与转化过程。无需经过细胞原生质2、 利用植株的特定细胞进行外源DNA或基因的转移， 裂旺盛的细胞，它们随着整体生长发育的进程而完成外源体离体培养、转化诱导，形成再生株等一系列繁琐复杂的培养流程。3、适应面广，单子叶、双子叶植物均可运用这项技术达到品种创新与改良的育种效果。4、 与常规育种相比，育种时间明显缩短，一般只需34代各选系便可稳定。5、方法简便，室内外（大田、盆栽场、温室等）均可进行，常规育种工作者易于掌握。 周光宇提出的 “DNA片段杂交”假

3、说:就整体分子而言，远缘亲本间的染色体结构是不亲和的，容易相互排斥。但局部DNA分子部分基因间的结构有可能保持一定的亲和性，因而远源DNA片段有可能进入受体细胞。在母体 DNA复制过程中，这种 DNA片段便与受体基因组相应区段整合，成为子代所表现的各种典型或非典型遗传变异现象的内在遗传依据。DNA片段杂交假说的分子验证1、同工酶分析：在高粱稻（银坊X亨加利）及其亲本酯酶同工酶分析研究中发现一条与高粱相同而银坊（母本）没有 的酶带，说明高粱稻中的这条酶带来自父本高粱；2、 DNA分子杂交：在对高粱稻基因组的分析研究中，取父本高粱DNA与母本水稻DNA进行分子杂交，除去两者的 同源序列，以其余的高

4、粱 DNA序列制备探针，与高粱稻 DNA进行分子杂交，发现高粱稻 DNA中存在高粱的同源序 列，从而证实高粱稻基因组中确实存在高粱 DNA片段，此即说明高粱 DNA片段已整合于高粱稻的基因组中。3、 DNA复性动力学分析：在对高粱稻及其两亲本的重复序列DNA复性动力学分析研究中，发现高粱稻基因组的中度重复序列部分与母本水稻有差异，从而进一步说明这是由于父本高粱稻DNA整合于母本水稻基因组而造成的结果。外源DNA的导入是指通过某种特定的途径将外源基因或外源DNA片段导入受体细胞，使之整合到受体细胞基因组中，而实现其功能表达的过程。外源DNA导入植物细胞三个关键因素：一、有适宜的基因（包括目的基因

5、、选择标记基因或报告基因）和合适的选择条件；二、组织培养体系，要求植物细胞必需有效的再生成株，频率高，周期短；三、外源基因导入到植物的途径和 方法，要求损失小、频率高且外源基因能稳定的整合到基因组，并且具有正常的时空表达能力。外源DNA导入方法：一、按照技术属性可将它们分为物理法、化学法、生物法。1、物理法：基因枪法、电激法、微注射法、激光穿刺法、超声波法、碳化硅纤维法等；2、 化学法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸钙DNA共沉淀、脂质体法等；3、生物法：农杆菌介导法、花粉管通道法、浸渍法、病毒介导法等。二、按照媒介类型的有或无，可分为载体介导法、直接导入法和种质系统介导法：DNA导入植物细胞3、

6、种质系统介导法：借助植物自身DNA导入，它包括花粉管导入法、子房、幼穗、1、载体介导法：将目DNA转入农杆菌或病毒中，并以之为载体，随着它们对植物的感染而将目的 中；2、直接导入法：以裸露的外源 DNA通过化学或物理方法直接导入植物细胞； 的种质细胞与媒介（如花粉、子房、花粉管通道、幼胚等）来实现外源 幼胚注射法、种子浸渍法等。（2）原生质体和农杆菌共培养法转化植物细胞（一、农杆菌介导法 又包括：（1）创伤植株感染法（又叫做整株感染） 叶盘法转化植物细胞。目的基因通过这种方法进入植物细胞要分几个步骤走：第一，将目的基因重组到适当的 Ti质粒载体或Ri质粒载体或其它类型的载体上。根据所选用的载体

7、系统进行重组。组方法就是基因工程中常用的一些基本方法。第二，目的基因随载体进入农杆菌（即转化农杆菌）。1）直接转化法；三亲交配法。第三，目的基因进入植物细胞，即植物细胞的转化。根癌农杆菌获得了外源目的基因后，接下来的工作 就是要转化给植物细胞。（原理）：农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它们侵染植物后能诱发植物形成肿瘤。从一种致癌的农杆菌中分离出了 一种巨大质粒（约 200Kb ）,称为致癌质粒，简称 Ti质粒。Ti质粒上有一段 DNA被称为转移 DNA （简称T DNA ）, 能转移并整合到植物染色体上，其上携带的基因能在受体细胞中表达。Ti质粒随后被改造用作人工植物基因工程的载DNA 片段插

8、入 Ti 质粒的 T DNA 中，并随之导入受体植物体。这种利用农杆菌的遗传转化体系，将外源目的基因或 细胞，而获得转基因植株的方法，即为农杆菌介导法。（操作步骤） 植物受体系统的建立； Ti 质粒转化载体系统的构建；工程农杆菌的制备；外源基因的转化；转化体的筛 选和转基因植株的检测DNA二、基因枪法 又称微弹轰击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击，是一种借助高速金属微粒将 分子引入活细胞的转化技术。DNA 的金（或钨）粉等金属微粒加速，射入受体处理来调节受体细胞或组织的渗透压，2、 DNA 微弹的制备。这一过程 3、受体材料的轰击。 4、过渡培养与筛 12 周），以利于受轰击材

9、料的恢复（原理） 利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源 细胞或组织，从而达到将外源 DNA 分子导入细胞中的目的。（操作步骤） 1、受体细胞或组织的预处理。通过渗透剂（甘露醇、山梨醇等）维持细胞的高渗状态，使其在轰击受伤后细胞质的外渗减少，从而有利于细胞的成活。是将外源基因 DNA 分子以一定比例附着在金属微粒子（金粉或钨粉）载体上。，再转入有选择压力的培养基中进行培养，以抑制非转化细胞的生长，选培养。 轰击后的材料先在不含选择压力的培养基中过渡培养一段时间（一般 并充分表达外源基因（包括选择压力抗性基因） 而转化细胞则能继续生长分化，从而被筛选出来。三、聚乙二醇法（原理）聚乙

10、二醇（PEG）是一种选择性化学渗透剂，它可以使细胞膜之间或使DNA与细胞膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，从而促进外源大分子进入原生质体，因 此称之为 PEG 诱导法。（操作程序） 1、分离原生质体； 2、提取带有目的基因的质粒或其它外源DNA ；3、取 0.5ml 新制备的原生质体悬浮液（原生质体密度为 2X106/ml ），加入50卩I小牛胸腺DNA，混匀后静置10分钟，然后再加入 10ml外源DNA，轻轻混 匀后静置10分钟；4、加入等体积40%的PEG溶液，立即混匀，室温下置30分钟；5、每隔5分钟加12ml 0.2mlCaCI2

11、 溶液，逐步稀释到 10ml； 6 、离心收集原生质体，并重新悬浮培养到10ml 培养基中培养 1 周； 7、将原生质体转移到选择培养基中进行筛选培养。（基本特点） PEG 法的优点如下： 1实验成本低，不需要特殊的仪器设备；2受体植物材料不受种类的限制，只要能建立原生质体再生体系的植物都可以采用此法；3得到的转化体中嵌合体很少；4结果稳定，重复性好； 5有实验证明，此法可使两个非连锁基因的共转化率达50%左右； 6有研究表明，用植物总 DNA 进行转化，其转化频率与用质粒 DNA 接近； 7此法可与电击法、脂质体法、基因枪法、激光微束穿刺法等技术结合使用，可大大提高转化率。PEG 法也有较大

12、的局限性： 1必须以原生质体为受体，而建立原生质体再生体系往往十分困难；2转化率仍然偏低。四、浸渍法DNA 溶DNA 分子直接导入受体细胞。DNA 吸入细胞内： 1、外源 DNA 可以通过细胞间隙与胞间连丝组2、植物细胞通过类似于动物细胞的内吞作用将外源DNA 摄入细胞尤其是生殖细胞以及分生细胞中，（基本原理） 浸渍法是将植物的种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源 液中，利用植物细胞自身的物质运输系统将外源 现在已经证明植物细胞至少通过以下几种途径将外源 成的网络化的运输系统而被运输到每一个细胞内；内； 3、植物组织中的传递细胞的膜透性改变可以为大分子物质透过细

13、胞膜提供机会，外源 DNA 进入细胞中的机会更大。（基本方法） 以种子为受体介绍其基本操作方法：1、将种子用 0.1%的升汞或 20% 30%次氯酸钠消毒，无菌剥去种皮（也可剥去幼胚）2、 将剥出的种子浸于无菌的 0.1 XSSC 缓冲液中，加入 20%的二甲基亚砜（ DMSO）；3、加入供体 DNA溶液（100200卩g/ml）,浸泡30min至数小时；4、用无菌 0.1 XSSC 缓冲液冲洗干净；5、将种子放在无菌滤纸上吸干水份后，转入无激素的固体培养基上培养；6、 将生长发育正常的胚转入筛选培养基上进行筛选（用质粒DNA 浸泡的种子） ，或成苗后转栽到土壤中进行变异性状 分析（用总 DN

14、A 浸泡的种子） 。（基本特点） 浸渍法具有如下优点：浸渍法是高等植物转化技术中最简单、快速、便宜的一种转化方法，它无需昂贵 的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，容易推广。局限性如下： 转化频率较低， 重复性较差， 筛选和检测也困难， 往往很难得到分子生物学证据。五、花粉管通道法（原理） 在受精及胚胎发育的初期是植物接受远缘遗传物质的敏感时期，就生殖细胞的结构而言，在胚囊中的精、卵 细胞类似天然的原生质体；而且在精子入卵时，卵膜有一个开闭的过程；即使到了合子期，胞壁的形成也尚未完备， 胞壁的屏障作用还很小，因此外源基因进入受体卵细胞及合子的阻力较小。在花粉管伸入胚珠的

15、过程中可形成花粉管 通道，这为外源 DNA 分子进入胚囊提供了天然的途径。植物授粉后外源 DNA 能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入 胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎。就整体分子而言，亲缘关系愈远的生物间的染色体基因DNA的结构愈不易亲和， 而容易相互排斥 ，但从局部的 DNA 片段来看， 两种来源的 DNA 在部分区段上可能保持一定的亲 和性，因而远缘 DNA 片段在受体细胞 DNA 复制过程中有可能被重组进去，这便是染色体水平以下的分子杂交。（操作方法）1.柱头切除法：当受体植物自花授粉一定时间后（一般2 3 小时），切去花柱，然后马上在切口上滴入供体DNA 溶液（浓度为5

16、0100卩g/ml，溶于1XSSC）,最后套袋隔离至种子成熟。2花粉粒吸入法：收集新鲜花粉加入到供体 DNA 溶液中混匀，使外源 DNA 吸入花粉粒，然后取混合液滴于预先去雄 套袋隔离的雌花上进行人工授粉，再继续套袋至种子成熟。3柱头涂抹法：在未授粉前先用 DNA 溶液涂抹柱头，然后人工授粉套袋隔离，通过花粉管的伸入将外源 囊，成熟后收获种子。（基本特点）1 无需细胞、 原生质体等组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。 可能导致染色体变异或优良农艺性状丧失的问题。2不受植物种属的限制，在具备有性生殖过程的任何植物上都能应用。 3简便，易于掌握，可以在大田、棚栽或温室种进行。4育种时间短，

17、筛选遗传稳定的品系一般只需34 代时间。5通过外源总 DNA 片段的导入可以了解一些具有重大经济价值的农艺性状是否能够通过 状是单基因性状还是多基因性状，从而能为目的基因的克隆提供参考和材料。六、 超声波导入法（原理） 超声波是指频率为 2X1042X10 9Hz 的声波。它的生物效应主要是机械作用、热化作用和空化作用，导致细胞 壁与细胞膜的击穿或可逆的通透性的变化，这将使得外源DNA 进入细胞中。（操作程序）1 、受体材料的培养：一般采用无菌苗的不同器官、愈伤组织或原生质体，按常规方法进行培养。 所用质粒 DNA 或外源总 DNA 均按常规方法提取和纯化。3、 超声波处理：将受体材料切成小块

18、，放入超声波小室中，加入2 3ml 超声缓冲液，同时加入及40卩g/ml鲑鱼精DNA，超声波处理的声强为 0.52.0 W/cm 2,处理时间为1050分钟。4、处理后受体材料的培养和筛选：处理后将受体材料从缓冲液中取出，在正常培养基上恢复生长 培养基上进行筛选。（基本特点）优点： 1、不受受体种类的限制，不仅适应于原生质体，而且适用于带壁细胞的转化； 化效率高。 缺点： 外源 DNA 用量大，许多参数有待于优化。七、激光微束法（原理） 激光是一种很强的相干单色电磁射线，一定波长的激光束经聚焦后到达细胞膜表面时其直径大约只有0.5 nm。这种直径很小、能量很高的激光束可以使细胞膜产生可逆性穿孔

19、，利用激光微束的这种穿孔效应可以使外源 DNA 导入到受体细胞中。（操作程序）1、 受体材料的预处理。将欲处理的材料（幼胚、愈伤组织、悬浮细胞等）转入高渗缓冲液（10m mol Tris-HCl,0.7mol 山梨醇或甘露醇、 pH7.2） ，浸泡 15 小时，然后用新鲜培养液洗去高渗液，将受体材料移入激光机的样品处理室中， 加入0.5ml培养液，加入浓度为 5卩g/ml的外源DNA50卩l混匀，并设不加 DNA的对照。2、激光微束照射。 材料的培养：照射后的受体材料按照常规方法进行培养。（基本特点） 优点： 1、是一种物理转化方法，无受体材料限制，适用于各种功能植物材料和各种类型的受体细胞；

20、 操作简单、方便、转化效率较高； 3、还可进行细胞器的基因转化，由于激光微束小于细胞器，它可以在亚显微水平上 直接对细胞器穿孔，实现外源 DNA 对细胞器的转移。2、其稳定性和安全性目前还不如电激法和基因枪法。八、其它转化方法 一、脂质体介导法脂质体介导法是用脂类化学物质合成人工脂质膜，把外源DNA 转入到受体细胞中。脂质体是由磷脂组成的膜状结构，用它包装外源 于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用， 这种方法具有保护 DNA 在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用， DNA 可稳定地贮藏等优点。DNA 带入胚避免了原生质体再生以及组织培养过程中DNA 片段进行转移， 这些性2、提取外源 DN

21、A ：20卩g/ml供体DNA1 周后，转入到选择2、操作简单，转0.33、受体2、缺点： 1、需要昂贵的仪器设备，转化频率只有103 104体的吞噬或融合作用把内含的然后与植物原生质体共保温。高效地纳入植物的原生质体。 应，适用的植物种类广泛，重复性高包装在脂质体内的 二、病毒介导法DNA 分子包裹在膜内形成脂质体，然后通过植物原生质DNA 分子， 尔后通过细胞的内吞作用而将外源 DNA 降低了对细胞的毒性效将病毒基因组中对病毒繁殖非必需的一段核苷酸序列去掉， 换上一小段外源 DNA ，而不影响病毒基因组正常的包装， 病毒侵染植株或组织后，可通过系统感染把外源基因转移到细胞。三、电泳转移法借

22、在一定电场强度下由负极向正极泳动的DNA泳动力，将DNA引入到靠正极端的受体组织细胞中。细胞壁是以纤维丝为基质而组成的，含有许多小孔，在电场中DNA迁移可通过细胞壁的小孔，并可通过质膜而进入细胞。四、转座子介导法将植物内源转座子分离出来，构建在含有目的基因的表达载体上，并通过适当的方法将之导入到受体细胞中，利用 转座子的转座功能， 可将其邻近的目的基因转移到受体细胞的染色体上，即可实现外源基因的有效整合与表达。目的基因：基因工程中克隆的目标 DNA分子，是一段特异序列的 DNA片段。目标基因克隆的方法：1. 利用PCR技术或化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；2. 构建感兴趣的

23、生物个体的基因组文库或cDNA文库；3. 利用基因差异表达获得目的基因。PCR扩增获得目的基因或 cDNA（一）引物设计：1 .利用引物分析软件；2 .根据扩增序列，在其两端各选取5 端一段序列。3 .在引物的5端添加限制性内切酶的识别位点及保护碱基以方便克隆。（二）引物效果检验和 PCR参数确定PCR主要参数确定：退火温度Mg2+反应时间循环次数常规PCR衍生的几种基因克隆技术：（一）反向 PCR （in verse P CR）（二）热不对称交错 PCR （thermal asymmetric in terlaced P CR, TAIL-PCR）（原理）根据目标序列的侧翼已知序列设计3个嵌

24、套的特异引物（ sp1, sp2, sp3,约20bp）,用它们分别和一个具有低 Tm 值的短随机简并引物 （arbitrary degenerate primer, AD,约14bp）相结合，以基因组为模板， 根据引物长度及特异性 的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。TAIL-PCR分三轮反应。（三）从mRNA中扩增：RT-PCR(4) PCR扩增（1）提取基因组total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物cDNA文库cDNA比较的变异情况，将同源性基因cDNA的核心区段分析RT-PCR先扩增和克隆核心序列区。在测定核心序列后，根据

25、 cDNA 3端和5端的扩增。最后拼凑成cDNA全序列的信息并设计新的一对引物将其（四）锚定PCR（五）cDNA末端的快速扩增构建基因组文库或（原理）根据基因编码蛋白的同源性或者多个同源基因出来，针对核心区段保守性高的位点设计引物，然后运用核心序列设计新的引物并分别进行RT-PCR扩增并克隆。DNA片段而基因文库（Gene library）通过克隆的方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有 构成的克隆集合体。基因组文库（Genomic library）将某一生物基因组 DNA全部克隆后获得的重组子群体的总称。并全部克隆成重cDNA文库（cDNA library）将某生物特定的

26、组织器官或发育时期的全部mRNA反转录成cDNA ,组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的产物。（构建意义）1. 通过基因文库的构建贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，保存物种遗传种质。2. 从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。3. 构建基因文库是研究基因本身的需要，如基因结构的分析、基因表达和调控的研究等。基因组文库的类型：质粒文库、噬菌体载体文库、粘粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。构建基因组文库应满足的条件：基因组文库的完备性：是从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。基因组文库的大小：1）基因组的大小；2）克隆片断的长度；3）从中分离

27、特定基因的置信度。DNA的总长度。N=1 n（1 P）/ ln1-L/G式中P为期望概率，L为单个重组体的 DNA片段的长度，G为基因组N是所需要的重组体数目 基因组文库的构建：（一）基因组DNA的分离制备：原核细胞的基因组包括其拟核的DNA和附加的遗传体系如质粒DNA，真核细胞的基因组包括其核基因组及细胞器如线粒体和叶绿体的DNA。质量必须满足：1.结构具有相对完整性；2.尽量排除其它大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）；3.保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及离子等。（二）基因组DNA的片段化：1. 限制性内切酶对 DNA分子的酶解。两种方式：DNA完全酶解和 DNA不完全酶

28、解；DNA完全酶解2. DNA分子的物理剪切运用识别4对碱基的限制性内切酶制备随机性DNA片断，具有了较高的随机性，但相对随机性更高的方式还是运用不依赖碱基序列的物理剪切方法。选择合适的构建基因组文库的载体：1）要求有较大的克隆容量；2）要求在置于宿主中扩增时有较高而均等的转化效率；3）在重组子进行扩增时，扩增的机会相近；4）可以较方便地进行文库的筛选。基因组文库构建的常用载体：Lambda噬菌体载体、cosmid、BAC及YAC。插入BamH（三）载体制备；（四）重组连接：制备出的适当大小随机性基因组DNA与载体左臂右臂进行连接，实现左臂分子一右臂的分子重组。构建文库时重组连接常采用相同粘性

29、末端的连接，以）潜换型载体构建基因组文库多采用I酶切末端与插入外源 DNA Sau3A I末端的互补连接。（五）噬菌体离体包装；（六）重组噬菌体转染大肠杆菌。 基因组文库的扩增筛选：lambda载体的基因组文库是以噬菌斑的形式获得重组噬菌体的集合；cosmid载体的基因文库是存在于细菌中的大分子重组质粒，以独立的转化菌落形成集合；BAC文库也是以细菌菌落形式存在；YAC文库则以酵母菌形式出现。噬菌体文库的扩增可以通过感染宿主，每一噬菌斑便是一个重组噬菌体扩增后的产物。用缓冲液将这些噬菌斑中的病毒洗 脱下来，便获得了扩增后的文库。离心除出细菌碎片等杂质后，上清液加1-2滴氯仿，置于40C可以保存

30、数年。粘粒载体、BAC和YAC文库，则对转化的菌落单独编号、扩增和保存。染色体步移（chromosome walking）当基因的位置已知，但没有可用的探针，只知道同一染色体上的另外一个已经克隆 的基因，就可以通过染色体步移方法克隆所需的基因。（原理）是用探针筛选文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分（注意不能包含重复序列）作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分（即探针序列）是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端 部分作为探针，再去筛选文库。通过一系列

31、的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。cDNA文库的优越性：1、cDNA克隆以mRNA为材料，特别适用于某些 RNA病毒，例如流感病毒、脊髓灰质炎病毒和呼肠孤病毒等的基因 组结构研究及有关基因的克隆分离。2、cDNA基因文库的筛选比较简单易行。3、每一个cDNA克隆对应于一种 mRNA序列，假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的， 由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因的序列。4、cDNA克隆可用于在细菌中表达基因的产物。cDNA文库的大小：cDNA基因文库大小的估算公式N=ln（I-P）/ln（l-f）N为cDNA基因文库必需的克隆的数目；P为文

32、库中含目的基因cDNA片段的出现概率，一般情况下，期望值为99%； f是某种mRNA的丰度。cDNA文库的构建：1. cDNA文库构建的载体。cDNA是由mRNA反转录获得的互补 DNA，分子大小通常分布在 0.5kb 10kb间。2. cDNA的获得。A、分离mRNA ； B、对mRNA进行富集；C、cDNA的合成；D、粘性末端片断与载体的连接； 离体包装获得重组噬菌体。文库的筛选：筛选文库即指从文库克隆的群体中将特定的克隆选择出来的过程。PCR方法进行cDNA文库筛选。1、运用氨基酸序列信息进行 cDNA文库筛选；2、运用标记抗体对 cDNA文库进行筛选；3、分子探针杂交的方法，通 过分子

33、杂交后的信号，将与探针特异结合的克隆钓取出来；4、运用分子标记的定义是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其DNA分子标记具有的优越性有：大多数是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，他几种遗传标记 形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比， 分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不DNA分影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在 子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图

34、、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基 因克隆等方面。分子标记的种类： 形态标记、细胞学标记、生化标记。形态标记：遗传学上稳定、可见的外部特征-遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。如穗形、芒长、长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。特点：直观简单。从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型 差异有时难以反映基因型差异。C带、N细胞学标记：染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（带、 G 带等）。随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。特点：直观、快速而 经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时

35、难以分辨。 生化标记 贮藏蛋白和同工酶： 特点：经济、方便、成本较低。结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检 测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。 分子标记特点 （本质是以核苷酸序列作为标记 ）（ 1）不受季节、环境、基因表达与否的限制； （ 2）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（ 4）表现为 “中性 ”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁； （ 5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。 分子标记在遗传育种中的应用： 1、 分子图谱的构建。 2、品种、品系鉴定和杂交种纯度分析。 3、亲缘关系

36、分析。 4、基因标记及标记辅助育种。5、数量性状基因位点（ QTL ）的分子标记辅助选择。 植物分子育种目标：一、高产。高产是一个动态的概念，对于高产的要求是随着育种技术进步而不断发展的。如何实现育种提出的高产目 标，在育种中就是要将合理的株型与优良的生理功能相结合。合理的株型，就是指叶片在茎、枝上的着生姿态与分布， 叶片合理配置，以最有效地利用光能，制造更多地营养物质，增加产量。产品地质量决定在竞争中地胜 对优质的具体要求就各不相同。二、优质。农产品的品质是我国农业生产上一个比较突出地问题。在市场经济条件下， 负，而且关系到加工工业的发展，人民的健康和环境保护。不同作物，因其用途不同， 例如

37、稻米要求外观好看，整精米率高，米饭食味好等；麦类要求出粉率高等。降低农药残留量，保护生态环三、多抗。多抗是农作物稳产的重要保证，是减少各种自然灾害损失，降低生产成本， 境必须具备的特性。要求一个品种具备各种抗性是很难做到的。一般来说，在高产优质的基础上，能抗当地的主要病 虫及重要的自然灾害就是很大的成功。因此，在多抗性育种目标上，应抓住当地的主要矛盾，突出重点，才能获得较 显著的成效。四、其它目标。适宜的成熟期：适宜的成熟期就是能充分利用当地的光、温、水资源，达到全年（包括一季或多季） 最高产量的目的。适合机械化栽培管理：如株型紧凑，秆硬不倒，生长整齐，株高一致，成熟一致，不落粒等。 制定育种

38、目标的原则 ：一、 树立发展和超前的意识。一个新品种的育成和推广一般需要58年，因此在制定育种目标时，必须具备发展和超 前的观点。在这段时间内农业生产条件、农产品加工工业对作物品种的要求，人民生活水平提高对农产品要求等的变 化都必须考虑。二、抓住当地生产中主要矛盾。育种是在具体的地点与具体的时段内进行的，因此，必须根据当地这个时期现有品种 的生态特点，针对限制生产的主要问题，找出有关的主要目标性状，选育出能克服现有品种的缺点，而保持其优点的 新品种。三、要有市场经济的观点。在市场经济条件下，农产品最终都以商品进入市场，经济效益由市场销售量与价格决定。 所以，越是市场需要的产品，价格越高，效益随

39、之增加。市场价格取决于产品的质量，所以优质与高产是同样重要的。四、要注重环境保护。环境保护是一个世界性的问题，育种工作者也应该义不容辞地承担起这个任务。从育种工作来 看，选育生长期中抗病虫品种，可以减少施用农药，减少环境污染，降低农产品的残毒含量。同时，使农产品本身不 含有毒物质，如无棉毒素棉花品种的选育。此外，农产品在储藏期间的品质变化往往会产生一些有毒物质，如花生在 储藏期产生黄曲霉素，因此，选育耐储藏的品种也应该作为育种工作者的任务之一。五、要明确选育对象的具体性状。高产、优质、多抗等是总的育种目标，但如何实现却是很具体的，如果不落实到具 体性状上，就变成 泛泛而谈了。植物分子育种选择的

40、基本方法：1、 单株选择法。在原始群体（分子育种中是导入外源DNA 的后代）中选择优良的个体（单株、单穗或单铃） ，分别收 获、脱粒、保存、编号，第二年分别播种成行，种子量多时可种成小区，根据植株表现进行比较，鉴定上年当选个体 的优劣，将不良个体的后代淘汰。单株选择的次数取决与后代的表现。凡经过单株选择的后代性状表现整齐一致的， 就不再进行选择 。2、混合选择法。从供选择的群体材料中，按一定的经济性状和特性分成若干类型，选择各种类型中的优良个体，按类 型混合脱粒，下年混合种植，并与原品种比较。性状鉴定： 1、直接鉴定和间接鉴定 直接鉴定：根据某性状的直接表现评定该性状的优劣，称为直接鉴定。如株

41、叶形态、穗形、出油率、出粉率等。 间接鉴定：有些生理性状和品质性状不易进行直接鉴定或鉴定费用高时，可根据相关变异或性状连锁原理，借助另一 些性状与被鉴定性状的相关关系，间接推断所需鉴定性状，称为间接鉴定。例如，水稻秧苗的抗寒力与束缚水和可溶 性糖含量有关，含量高的抗寒力强。2、自然鉴定和诱发鉴定 自然鉴定：当自然条件下所需的鉴定条件经常发生，并使作物该项性状得以充分表达时，便可以在田间条件下进行鉴 定，称为自然鉴定。诱发鉴定：当鉴定所需条件不是经常发生的，如病害、虫害、冷害、干旱等，就必须人工模拟、创造条件，诱发性状 出现，称为诱发鉴定。如接种病原菌进行鉴定。3、当地鉴定与异地鉴定 当地鉴定：

42、在当地条件下能满足某些特性鉴定的要求，可在当地鉴定，称为当地鉴定。 异地鉴定：在当地不适合某些性状的充分表达，二人工诱发条件又不太容易和不便于模拟时，便需将材料送到其它适 宜的地方种植、鉴定，称为异地鉴定。各世代材料的种植方法：（1）D1 代的种植方式。总的原则是 D 1代是将导入所获得的种子全部种下去，因为通过导入所获得的种子数量较少， 其种植的方法可分为两种：一是将所获得的种子按组合混合种植；二是导入的材料较多时，可以按组合分株（单穗、 单铃）种植，这是因为有时在 D1 代表现变异，可以提早进行选择。（2） D2代的种植方式。一般是按组合材料组成群体，种植的数量较多，混合种植Di代混合收割

43、、脱粒、保存，作为D2代的种植材料，要特别注意的是在这种D2代时要种植受体亲本作对照，在有条件的情况下，也应种植供体亲本。（3）D3的种植方式。D3代的种植材料是从 D2代中的选择的单株或单穗，所以应按组合分单株种植，其规模的大小取 决于D2代选择单株或单穗的数量，同时也应种植通用的对照和原受体对照。Dn-1代还有分离,（4）Dn代种植方式。一、若 Dn-1代稳定，各项性状整齐一致，表现优异，则进入鉴定苗圃；二、若则应继续选择单株和单穗，作为Dn的种植材料。如此反复选择，直到各项性状稳定为止。选育技术： 通过外源 DNA 导入获得的变异材料是比较容易的，但要育成符合育种目标的新品种，就要进行选

44、择，选择 是育成新品种的关键，其中田间选择是必不可少的。田间选择的一般方法是：“先选系，后选株 ”。田间选择重要由感官鉴定来完成，考察的项目是：一、生育期。如禾谷类的始穗、齐穗、成熟期，棉花的现蕾、现花、吐絮期等。二、株型。叶片大小、着生姿态、茎蘖的集散程度、株高等。三、产量性状。如单株成穗数的多少、穗子大小、着粒密度、结实率、铃大小、成铃率等。四、品质性状。稻米的粒形、垩白的大小及有无、棉花纤维长度与长度的初步鉴定等。五、生长情况。如整个生长期是否正常、是否有病虫害的发生、严重程度、当发生某些灾害性天气后，植株授是否受 害及严重程度， 如开花期正遇到连续阴雨天， 开花是否正常； 早稻秧苗期遇

45、到低温阴雨， 秧苗生长是否正常。 性状鉴定与选育：（一）、抗病性。 常用的抗病性鉴定有田间鉴定与室内鉴定、成株鉴定与苗期鉴定、离体鉴定1、田间鉴定与室内鉴定自然条件下的田间鉴定是抗病鉴定的基本方法，但它易受气候的影响。田间鉴定一般需要设病圃，在病圃中要均匀 的种植感病材料作为诱发行；供试的材料中还要设改感病和抗病对照，等距离种植，以检验全田发病是否均匀，作为 确定抗性级别的参考 。2、成株鉴定和苗期鉴定 有些作物品种在成株期和苗期的抗病性表现不一致时，要在苗期和成株期分别进行鉴定。3、离体鉴定 离体鉴定是采取供测定的样本植株的枝条、叶、分蘖等进行离体的培养，然后人工接种。其优点是鉴定速度快，可

46、同时分别测定同一材料对不同的病原物或不同小种的抗病性，尤其是对正在生长中的任一单株进行测定，不会妨碍它 的结实。（二 ）、抗虫性。 以远缘亲本或近缘亲本作物外源 DNA 供体是为了确定抗虫性是否转入受体或需要选育抗某种虫害品 种时，就必须进行导入后代的抗虫性的鉴定才能有效的进行选择，淘汰不具抗性的材料。抗虫性鉴定的方法常用的是 田间鉴定和室内鉴定。1、 田间鉴定。（1 ）采用的方法：在大面积感虫的作物或品种中设置试验。在测试材料中间种感病品种，利用引诱 作物或诱虫剂，把害虫引入鉴鉴定小区。用特殊的杀虫剂减少天敌，而不杀测试害虫等来维持适当的害虫群体。（ 指标。田间鉴定的指标，依作物受害方式、部

47、位、发育阶段的不同而异，包括死苗率、叶被害率、果实被害率、枯心 率等。害虫的某些参数如产卵量、虫口密度、死亡率等。2、室内鉴定。室内鉴定同样可以选择植株受害后的表现或昆虫个体或群体的增长速度作为反映指标。它的最大的优点 是条件比较容易控制，但局限性也很大，不能够取代田间鉴定。（三）、抗旱性。 抗旱性的鉴定方法有直接鉴定和间接鉴定两种： 1、直接鉴定。在田间干旱田间下，或设置旱地和水浇地，或用装有不同水份含量土壤的盆钵，观察品种间的性状表现 和产量的高低，借以鉴定品种的抗旱性。2、间接鉴定。通过测定某些与抗旱性密切相关的性状，如种子在高渗容溶液中的发芽率、受旱幼苗的存活率、叶片的 导电率和电阻变

48、化、叶片的水势和渗透势，间接推断作物的抗旱性。RNA 、可溶性蛋白、磷脂、抗坏血酸等含量的（四）抗寒性。 抗寒性的鉴定方法也可以分为直接鉴定和间接鉴定。 1、直接鉴定。在田间自然条件下，于低温过后，调查死苗率或死蘖率、受害植株百分率，减产程度等进行评定。它是 鉴定的可靠方法。2、间接鉴定。在直接鉴定比较困难时，我们可以测定一些生化指标： 变化；酶的活性、电导率、 PH 值等来间接评价作物的抗寒性。品系鉴定、品比试验及区域试验：一、品系鉴定与品比试验。共同点：通过小区试验，鉴定品系的遗传稳定性，丰产性，以及育种目标要求的其它性状。 区别：品系鉴定的供试材料数量较多，一般不设置重复：品系比较供试材

49、料是通过品系鉴定后选择的优良材料，数量 较少，采用随机区组设计，重复 3 次，并对所需性状进行严格的鉴定，筛选最好的材料进入区域试验。二、区域试验。 区域试验是由有关部门组织的、 在一定的自然区域内的多点、 多年的品种比较试验， 分为全国和省 （市、 自治区）两级。品种审定： 品种选育是新品种选育的最后一项程序，是具有法律作用的程序。种子经审定合格后，方可正式命名并进 行大面积推广应用。申请品种审定所需提交的材料：1、选育报告。 2、区域试验结果。 3、生产试验及栽培试验结果。4、品种标准、抗性及品质测试结果。5、实物标本及照片。转化后代的性状变异 包括：形态特征的变异、生长发育性状的变异、生

50、理生化特征的变异、抗性的变异、品质性状的 变异、育性的变异等。（原因） 1、改变了受体遗传基础； 2、基因调控表达的改变； 3、基因相互作用的改变； 4、其它原因 （特点） 1、变异的随机性； 2、变异的广泛性； 3、通常带有供体的某些性状； 4、变异的意外性； 以水稻为例说明转化后代的性状变异：立、一、形态特征的变异：形态特征是指植株根、茎、叶、花、种子、果实的色泽、性状和大小；植株高矮、茎叶着生姿 态；生长习性直立、匍匐；茎蘖着生的集散程度；茸毛的多少、硬软，芒的有无、长短等，二、生长发育性状的变异：外源 DNA 导入水稻的后代，生育期的变异一般不超出供体与受体的生育期范围，多数倾向 于受

51、体，即与受体生育期大致接近。当以早熟品种为受体时，出现超早熟类型的变异较少，而出现稍迟的类型较多； 当以迟熟品种为受体时，则出现比受体早熟的类型的几率比较大。三、生理生化特征的变异：以密穗高粱 DNA 用花粉管通道法导入受体晚粳稻品种鄂宜105，导入后代于大田测定剑叶净光合速率。密穗高粱为C4作物，净光合速率比受体水稻高 2倍多，导入后代有明显提高，有的株系比受体提高 84.76%。四、抗性的变异：采用幼穗期茎注射法导入外源DNA ，经多次鉴定筛选获得 7个稻瘟病抗性株系，稻瘟病抗性变异率为 2.27%。研究表明稻米垩白度变异最显著，五、品质性状的变异： 对外源 DNA 导入后代的稻米品质变异

52、进行了比较完整的研究， 变异系数达到 37.78%。六、育性变异：外源 DNA 导入后代，在水稻、小麦等作物上均发现了育性变异，即出现不育株。不育现象产生的原因 可能与外源 DNA 在整合、重组过程导致生理功能紊乱所致。植物遗传研究中常用的分子标记：RFLP Restriction Fragment Length PolymorphismRAPD Random Amplified Polymorphic DNAs （DAF, AP-PCR）SSR Simple Sequence RepeatAFLP Amplified Fragment Length Polymorphism 针对非确定 DN

53、A 的分子检测的方法： 一、 RFLP 法：限制性片段长度多态性，即 DNA 分子经限制性内切酶水解后的片段在一个物种的不同个体间表现出多 态性。 植物的基因组 DNA 经限制性内切酶切割和以某分子探针进行 Southern 杂交后也表现出多态性， 这种多态性可由 点突变使限制酶位点增减，或其附近位点 DNA 的缺失、插入等结构突变而产生。 RFLP 以孟德尔方式遗传，可以作为 一种遗传标记。（原理） 检测 DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定 DNA 片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点 突变（新产生和去除酶切位点）和一段 DNA 的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度

54、发生变化）等均可导致 RFLP 的产生。DNA （ gDNA ）探针（检测的（步骤） 酶切电泳印迹杂交 洗脱放射自显影 （RFLP 探针） 来源： cDNA 探针（保守性较强，探针检测的多态性频率较低）与基因组 多态性频率较高，但不同种属特异性较强） （特点）优点： 共显性，可以区别纯合和杂合基因型；稳定、重复性强；某些植物中开发探针已遍及整个基因组。 点： DNA 需要量较大，技术复杂；用于做图较费时，难以分析大量样品；在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。 二、 RAPD 检测法RAPD 即随机扩增多态性 DNA （ randomly amplified polym

55、orphic DNA ）,是以 PCR 扩增为基础的一种研究遗传物质 DNA 差异性的新技术。EB 染色来检测扩增 DNA 序列有特定的结合位点，这 随机引物在模板的两条链上有互补的位置，且引 如果基因组在这些区域发生 DNA 的片段的插入或 而使 PCR 产物增加或者减少， 发生分子量的变化，（原理） RAPD 是建立在 PCR 技术之上的一种分子标记方法，它是以一系列不同的随机排列的寡聚核酸单链为引物， 对于所研究的基因组 DNA 进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰氨凝胶或者琼脂糖凝胶电泳分析，经 产物的多态性， RAPD 所使用的引物各不相同，对于任一特定的引物，它同基因组 些特定的结合位点

56、在基因组某些区域内的分布符合 PCR 反应的条件， 物的 3-端相距在一定的长度范围之内， 就可以扩增出来 DNA 片段， 者缺失， 或者碱基突变就能够导致这些特定结合位点分布发生变化， 通过对于 PCR 产物的检测分析即可以测出基因组在这些区域的多态性。（主要步骤）提取DNA ;用随机引物（10b P）进行PCR扩增；扩增产物电泳分离（3v/cm, 6hr ）;EB（溴化乙锭）染色（15min）; 紫外线下观察、拍照； RAPD 带的分析。（特点） （1）不需 DNA 探针，设计引物也不需要知道序列信息；（2）用一个引物就可扩增出许多片段（一般一个引物可扩增 612 条片段，但对某些材料可能不能产生扩增产物），总的来说 RAPD 在检测多态性时是一种相当快速的方法；（3）技术简单，RAPD分析不涉及Southern杂交、放射自显影或其它技术；（4）不象RFLP分析，RAPD分析只需少量 DNA 样品； （5）成本较低，因为随机引物可在公司买到，其价格不高；（6）RAPD 标记一般是显性遗传（极少数是共显性遗传的），这样对扩增产物的记录就可记为 “有 /无”，但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子；（8）RAPD 分析中存在的最大问题是重复性不太高，因为在 PCR 反应中条件的变化会引起一