氨基酸发酵生产工艺学 (2)ppt课件

1、氨基酸消费工艺 氨基酸是构成蛋白成分 目前世界上可用发酵法消费氨基酸有20多种。氨基酸 碳原子分别以共价键衔接氢原子、羧基和氨基及侧链。侧链不同，氨基酸的性质不同。氨基酸的用途 1.食品工业： 强化食品(赖氨酸，苏氨酸，色氨酸于小麦中) 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA同意,如今每年产量已达数万吨。 2.饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 3.医药工业： 多种复合氨基酸制剂可经过输液治疗营养或代谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 4.化学工业

2、：谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。氨基酸的消费方法 发酵法： 直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸构造类似物突变株发酵、抗氨基酸构造类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。 添加前体法 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的本钱高,工艺复杂,难以到达工业化消费的目的。 消费氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸消费的三巨头。它们能消费高质量的氨基

3、酸,可直接用于输液制剂的消费。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸消费厂家,消费氨基酸和天冬甜精等衍生物。 国内消费氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,湖北八峰氨基酸公司,但目前无论消费规模及产质量量还难于与国外抗衡。 在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸协作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但消费原料都依赖进口。 据专家估计,到2000年,世界氨基酸产值可达45亿美圆,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。 氨基酸发酵消费开展的历

4、史回想 所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主要原料的培育基中培育微生物,积累特定的氨基酸。 这些方法成立的一个重要缘由是运用选育成的氨基酸生物合成高才干的菌株。菌株的育种 从自然界中挑选有产酸才干的菌株,并建立其培育条件. 在确立突变技术和阐明氨基酸生物合成系统调理机制的根底上开展为营养缺陷变异株、抗药性菌株的育种。 随着重组DNA技术的开展,接合、转导、转染、细胞交融等手段首先用于体内基因重组,是早期用基因重组方法构建消费菌株的尝试。 随着载体、受体系统的构建及体外基因重组技术的日益完善,氨基酸生物工程菌的构建有了长足的开展。 苏氨酸等的消费菌株被胜利地构建并运用于工业化消费。2.1用野生株

5、的方法 这是从自然界获得的分别菌株进展发酵消费的一种方法。 典型的例子就是谷氨酸发酵。 改动培育条件的发酵转换法中,有变化铵离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷氨酰胺和缬氨酸发酵 2.2用营养缺陷变异株的方法 这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成某步反响阻遏的营养缺陷型变异体，使生物合成在中途停顿，不让最终产物起控制造用。 这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵，还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。 2.3类似物抗性变异株的方法 用一种与本人想获得的氨基酸构造相类似的化合物参与培育基内，使其发生控制造用，从而抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种培育基中可以生长的

6、变异株，而这种变异株正是解除了调控机制的，可以生成过量的氨基酸。 利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸和精氨酸。 2.4 体内及体外基因重组的方法 基因工程包括细胞内基因重组方法和试管内的体外基因重组方法。 体内基因重组在运用上又称为杂交育种，主要方法包括：转化、转染、接合转移、转导和细胞交融等，这都是在细胞内暂时地产生染色体的部分二倍体，在两条DNA链之间引起两次以上的交叉，是遗传性重组景象。 细胞内基因重组技术的缺陷是，如今只在同种或有近缘关系的微生物之间进展并较难胜利。 代谢工程在阐明代谢途径及其调控规律的根底上，运用重组DNA技术可以改动代谢途径分支点上的流量或引入新的

7、代谢步骤与构建新的代谢网络。 其主要步骤为: 鉴定目的代谢途径涉及的酶(特别是限速酶); 获得酶基因，必要时可用蛋白质工程技术，如定点诱变，基因剪接等，使蛋白具有新的特点(加强活性或稳定性、解除反响抑制等); 将一种或多种异源的或改造后的酶基因与调理元件一同克隆进目的生物; 使调理元件的作用及培育条件最优化。 3.1载体-受体系统及克隆表达的研讨 3.1.1受体的获得 目前运用的氨基酸工程菌受体主要是大肠杆菌K-12及棒状杆菌家族，通常是经过诱变选育出的根底产率较高的菌株。 大肠杆菌遗传背景研讨得清楚，载体系统完善，利于工程菌的构建，但它含有内毒素且不能将蛋白产物分泌至胞外，为运用带来困难。

8、棒状杆菌能抑制这两个缺陷，但载体受体系统研讨较晚且有限制修饰系统的妨碍，所以获得利于外源基因导入及表达且能稳定遗传的受体菌是尚待处理的问题。 3.1.2载体的构建 有效的载体需求有在受体菌中可启动的复制起始位点，这可从棒状杆菌家族内源小质粒中获得; 载体所需的挑选标志及外源基因插入的多克隆位点，可从常用的克隆载体中获得。 3.1.3基因转移手段 由于棒状杆菌是革兰氏阳性菌，CaCl2转化法对它不适用。 通常采用的方法有:原生质体转化、转导，电转化，接合转移。 原生质体转化的方法是较早采用的方法，由于遭到原生质体再生条件的局限，效率不高; 电转化方法由于高效，快速被广泛运用，目前它的转化效率可到

9、达原生质体转化法的1001000倍。 接合转移可用于基因在亲缘关系远的物种之间的转移，并且可将外源基因整合于染色体上，易于稳定遗传。 氨基酸发酵的代谢控制 控制发酵的条件 控制细胞浸透性 控制旁路代谢 降低反响作用物的浓度 消除终产物的反响抑制与阻遏作用 促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成控制发酵的条件 专性需氧菌，控制环境条件可改动代谢途径和产物。控制细胞浸透性生物素、油酸和外表活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改动。青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞面内外的浸透压而泄显露来。控制旁路代谢降低反响作用物的浓度 利用营养缺陷型突变株进展氨基酸发酵必需限制所要求的氨基酸的量。限制精氨酸的浓度可

10、解除反响抑制，实现鸟氨酸的生物合成。消除终产物的反响抑制与阻遏作用 运用抗氨基酸构造类似物突变株的方法。促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成 ATP的积累可促进氨基酸的生物合成氨基酸发酵的工艺控制 培育基 pH 温度 氧培育基 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。 菌种性质、消费氨基酸种类和所采用的发酵操作决议碳源种类2、氮源：铵盐、尿素、氨水；同时调整pH值。营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。尿素灭菌时构成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。可分批流加。氨水用pH自动控制延续流加 3、适宜C

11、/N 氮源用于调整pH。 合成菌体 生成氨基酸，因此比普通微生物发酵的C/N高。 4、磷酸盐：对发酵有显著影响。缺乏时糖代谢受抑制。 5、镁：是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。 6、钾：促进糖代谢。谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。 7、钠：调理浸透压作用，普通在调理pH值时参与。 8、锰：是许多酶的激活剂。 9、铁：是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。 10、铜离子：对氨基酸发酵有明显毒害作用。 生长因子：生物素 作用：影响细胞膜透性和代谢途径。 浓度：过多促进菌体生长，氨基酸产量低。过少菌

12、体生长缓慢，发酵周期长。 与其它培育条件的关系：氧供应缺乏，生物素过量时，发酵向其它途径转化。 种类：玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。pH对氨基酸发酵的影响及其控制 作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。 控制pH方法：流加尿素和氨水 流加方式：根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等要素决议。 控制： 1菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，防止pH过高 2菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。 3发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免呵斥氨基酸提取困难。 4氨水对pH影响大，应采取延续流加。温度对氨基酸发酵的影响及其控制 菌体生长达一定程度后再

13、开场产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。 菌体生长温度过高，那么菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。 采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。氧对氨基酸发酵的影响及其控制 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵：生物合成与TCA循环有关。 适宜在缺氧条件下进展的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产量最大。 供氧缺乏时产酸受细微影响的天冬氨酸族氨基酸发酵谷氨酸消费工艺 工业化消费开场于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。 1957年，日本率先采用微生物发酵法消费，并投入大规模工业化消费，这是被誉为现代发酵工业的艰苦创举，使发

14、酵工业进入调理代谢的调控阶段。 目前世界产谷氨酸钠30吨/年，占氨基酸总量的2/3。 我国现已有200余家消费，年产量达15万吨，居世界首位。 产生菌株特点： 革兰氏阳性 不构成芽胞 没有鞭毛，不能运动 需求生物素作为生长因子 在通气条件下才干产生谷氨酸。 谷氨酸生物合成机理： 由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进展复原性氨化作用而得到。 一、淀粉水解糖的制备：酸水解或酶水解 1、调浆：干淀粉用水调成10-11Bx的淀粉乳，加盐酸0.5-0.8至pH1.5。 2、糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80下中和。 3、中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0 4、脱

15、色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6-0.8，在70度及酸性条件下搅拌后过滤。 酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用 大米进展浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进展液化，85 30min，加糖化酶60 糖化24h，过滤后可供配制培育基。 糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。 预处置方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发酵液中参与外表活性剂吐温60或添加中青霉素。 二、菌种扩展培育 1、斜面培育：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属、节杆菌属。 我国各工厂目前运用的菌株主要是钝齿棒杆菌和北京棒杆菌及各种诱变株。

16、生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素为生长因子。 斜面培育基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的pH7.0-7.2琼脂培育基，32培育18-24h。 2、一级种子培育：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。1000ml装200-250ml振荡，32 培育12h。 3、二级种子培育：用种子罐培育，料液量为发酵罐投料体积的1，用水解糖替代葡萄糖，于32 进展通气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培育终了时，无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字陈列。活菌数为108-109 /ml。三、谷氨酸发酵 1、顺应期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。

17、2-4h。 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。 2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维持在一定程度。菌体浓度迅速增大，菌体形状为陈列整齐的八字形。不产酸。12h。 措施：及时供应菌体生长必需的氮源及调理pH，在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30- 32 3、菌体生长停顿期：谷氨酸合成。 措施：提供必需的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气，控制温度34-37 。 4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 措施：营养物耗尽酸浓度不添加时，及时放罐。 发酵周期普通为30h。谷氨酸发酵控制 1生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反响的关键酶

18、乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响磷酯的合成。 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸可以从胞内渗出，积累于发酵液中。 生物素过量，那么发酵过程菌体大量繁衍，不产或少产谷氨酸，他谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。 2种龄和种量的控制 一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。 种量为1。过多，菌体柔嫩，不强健，提早衰老自溶，后期产酸量不高。 3pH。 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌体生长旺盛，营养成分耗费大，转入正常发酵慢，长菌不长酸。 谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适pH 7.2-7.4。在发酵中后期，坚持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子缺乏。 4通风：不同种龄、种量，培育基成分，发酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。 在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑制菌体生长。 在发酵产酸阶段，需求大量通风供氧，以防过量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，那么大量积累a-酮戊二酸。 防止噬菌体和杂菌的污染 从空气过滤、培育基、设备、环境等环节严厉把关。四、谷氨酸的提取1、等电点法：操作简单，收率60。周期长，占地面积大。 2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取吸附谷氨酸构成的