基因工程期末复习材料-22精选文档

1、1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.名词解释基因工程：通过基因操作，将目的基因或 DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。基因克隆：指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，目的在于获得大量的基因拷贝载体： 将外源基因引入宿主细胞进行复制或表达的运载工具。受体细胞：能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实 施遗传改良的细胞。限制性内切核酸酶：在细胞内能够识别双链 DNA分子中的特定核苷酸 序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。黏性末端:指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基

2、的单链延 伸形成的末端结构。平末端 : 限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割， 形成的片段末同裂酶：指来源不同但识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。同尾酶： 指来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相 同黏性末端的限制性内切核酸酶。酶的星号活性： 当条件改变时，许多限制酶的识别位点会改变，导致 识别与切割序列的非特异性的现象。DNA连接酶：是一种能够催化双链 DNA上彼此相邻的3 -OH和5 -P形成磷酸二酯键的核酸酶。12. DNA聚合酶：是指在引物和模板的存在下， 将dNTP连续地加到双链DNA 分子引物链的3 -OH末端，催化核苷酸聚合作用的酶。13. 反转录酶：依赖RNA勺

3、DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）14. 克隆载体：用于携带DNA片段进入宿主细胞进行复制或保存的载体。15. 表达载体：可携带DNA片段进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译 的载体。16. 穿梭载体 ：可在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达的载体17. 质粒： 是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状双链 DNA 分子， 可自主复制和表达。18. 质粒的拷贝数19. 质粒的不相容性： 两个质粒在同一宿主中细胞不能共存的现象。20. a -互补：lacZ基因产物分为a链和（3链两部分，只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为a -互补作用。21. 插入失活：在一个基因位

4、点中插入外源 DNA片段，从而使该基因活性 丧失的现象。22. 多克隆位点 （MCS :包含多个单一限制性酶切位点的一段很短的DNA序列。23. 琼脂糖凝胶电泳： 以琼脂糖为支持物，在适当的条件下对带电生物大分子进行电泳的技术，主要用于DNA分子的分离、纯化和鉴定。24. Southern杂交：是先将分布在琼脂糖凝胶上大小不同的变性DNA片段转移到滤膜上，之后通过碱基互补配对，将滤膜与探针杂交，显色鉴 定。25. 探针： 指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。聚合酶链式反应：是以DNA为模板，在引物指导下由 DNA 聚合酶催化的对特定基因片断进行的体外扩增反应。26.

5、 引物： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。27. 简并引物： 由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基 酸序列可以有多个可能的编码序列，称之为简并序列。相应合成这一 段序列作PCR扩增体系的引物。28. 目的基因：是基因工程中克隆的目标 DNA分子，是一段特定序列的DNA 片段，而并不一定是具有基因完整功能区的分子。29. 基因文库：又称DNA文库，是指某个生物的基因组 DNA或 cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过筛选获得大量的 阳性菌落（或噬菌斑 ） ，所有菌落或噬菌斑的集合即为该生物的基因文 库。30. 基因组文库：是将某一生物基因组DNA片段化

6、并全部克隆后所获得的重组子群体的总称，包含了这一生物的全部遗传信息。31. cDNA文库：是将生物特定的组织器官或发育时期的全部mRNA反转录成cDNA并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基 因的转录本。32. 衔接物 ：用化学方法合成的一段 8-12nt 的含有一个或数个特定限制 酶识别位点序列的平端双链。33. 转化：指以质粒为载体，将外源 DNA导入处于感受态的E. coli等原 核宿主细胞，并使其获得新表型的过程。34. 感受态细胞：处于能吸收外源DNA分子生理状态的细胞35. 感染：将以入噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒颗粒感 染受体菌的过程；由噬菌体和细

7、胞病毒介导的遗传信息转移过程也称 为转导 (transduction) 。36. 转染： 即转化与感染相结合，以噬菌体为载体，但不经过蛋白包装成 病毒颗粒，而是用 DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方 式导入受体菌。37. 重组子：含有重组DNA分子的转化子。38. 筛选：经过各种方法将外源 DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性 克隆子的过程称为克隆子的筛选。39. 阅读框架： 是基因的编码区，包含从起始密码子至终止密码子之间的 cDNA序 列。40. 启动子：是RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA序列。41. 增强子：是远距离调节启动子并提咼转录效率的一段DNA序列。4

8、2. 终止子：是为转录提供终止信号的一段 DNA序列。43. 沉默子：是远距离调节启动子以降低转录速率的一段DNA序列。44. 操纵子： 由数个功能相关的结构基因及其调控区 ( 操纵基因、启动子 及其它有调控功能的单位 ) 组成。45. 复制子：是一段包含复制起始位点和反式因子作用区在内的DNA区段46. 植物转化受体系统： 指用于转化的外植体通过组织培养途径或其它途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。47. 胚胎干细胞 : 是从早期胚胎内细胞团中分离出的未分化、 具有正常二倍 体和发育全能性的细胞。48. 细胞核移植技术 : 是将一个体细胞核

9、移植到另一个体的卵细胞中去， 最 终产生一个与供体细胞个体遗传性状一致的动物个体的技术。 P223-22449. 基因治疗 : 是指向目的细胞引入正常功能的可表达的基因， 从而修正由 于基因缺陷所造成的遗传性疾病。50. 分子标记：能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，表现为核苷酸序列的任何差异，哪怕是单个核苷酸的变异。问答及填空：1. 基因工程的技术流程 :? 目的基因克隆? 载体的准备? 目的基因与载体的连接? 重组DNA转化/转染/转导? 重组体的筛选与鉴定? 重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用2. 基因工程的基本条件 : 目的基因、 载体、 工具酶、 受

10、体细胞（宿主细胞）3. 基因工程的技术策略(1) . 强化基因的表达，改善生物性状(2) . 关闭特定基因的表达，改善生物性状(3) . 基因的异源表达赋予生物新的功能4. II 型限制性核酸内切酶命名原则：1. 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 3 个字母的略语表示寄 主菌的物种名。大肠杆菌( Escherichia coli )用 Eco 表示；流感嗜血菌( Haemophilus influenzae )用 Hin 表示。2. 若该菌有不同的变种或品系，再加上变种或品系的第一个字母，如EcoRIo3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制 - 修复系统，用罗马字母表示，如 Ec

11、oRI, EcoRVo4. 限 制 酶 前 面 要 带 上 R( Restriction) ， 修 饰 酶 前 面 要 带 上 M ( Modification )o ( 现已省略 )5. 产生星活性的原因及影响其酶活性的因素? 导致星号活性发生的因素? 高甘油含量 (5%， V/V) ；? 限制酶用量过大 (100U/ IL g DNA);? 低离子强度 (pH8.0) ；? 含有机溶剂 ( 如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等 ) ；? m6+、Cf、C6+、Zn2+等非Mg+的二价阳离子存在。? 抑制星号活性的方法? 尽量用较少的酶进行完全消化反应，这样可以避免过度消化 以及过高的甘油浓度

12、；? 尽量避免有机溶剂的污染；? 将离子浓度提高到 100-150mM；? 将反应缓冲液的 pH 值降到 7.0 ；? 二价离子用 Mg2+ 。6. DNA连接酶的种类及作用特点种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、嗜热菌 DNA连接酶DNA连接酶催化的连接反应特点?连接反应发生在一条 DNA链的3 -OH端和另一条DNA链的5 -P端之间；?连接反应需要ATP或NAD和Mg+作为辅助因子与激活因子；? DNA连接酶不能催化两单链 DNA分子或环化单链 DNA分子的连接；?只能连接双链 DNA分子的单链缺口 （n ick），不能连接双链中的裂口（gap） 。7. 常见工具酶的用途如：D

13、NA聚合酶：? 补齐 5 - 突起端? 合成第二条 cDNA?除去3-端突起的单链 DNA（在无dNTP时）? 切口移位制备探针 反转录酶：?以mRN的模板合成其互补的 DNA(cDNA)用于构建cDNA和基 因克隆；?对具5端突出的DNA片段的3凹端进行补平和标记，制备 杂交探针；?代替Klenow片段或测序酶，用于 DNA序列分析。 碱性磷酸酶：? DNA或 RNA分子片段5末端的去磷酸化，防止自身连接；在5 端标记之前，去除 DNA或 RNA分子的5末端磷酸基团。P31-32 末端转移酶：?用于克隆DNA片段，给载体和外源 DNA3末端分别加上互补 的同聚物尾巴，以便二者在体外连接。?用

14、于DNA片段3末端标记，催化a -32P- 3-脱氧核苷酸标 记DNA片断的3末端；催化生物素等非放射性的标记物掺入 到DNA片断的3-末端。? 按照模板合成多聚核糖核苷同聚物。 多核苷酸激酶：? DNA 5端磷酸化?标记 DNA或 RNA的 5 端8. 质粒的基本性质： 自主复制性、不相容性、转移性、携带特殊的遗传标记9. 理想质粒载体的必备条件和质粒载体人工构建的策略理想质粒载体的必备条件：? 具有较小的分子质量和较高的拷贝数；? 具有尽可能多限制酶的单一酶切位点；? 具有两种以上的选择标记基因；? 缺失mob基因；? 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。 质粒人工构建的策

15、略 P39-40? 加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择；? 增加或减少合适的酶切位点，便于重组；? 缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量；? 改变复制子 , 变严谨为松弛 , 变少拷贝为多拷贝；? 根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。10. 入和M13噬菌体的性质入噬菌体的性质? 是 E.coli 的温和型噬菌体。?入噬菌体颗粒中的 DNA是一线性dsDNA分子，两端各有12个碱基(5 -GGGCGGCGAC3TTT的5凸出黏性末端是互补的。进入细菌细胞的入DNA通过两端的黏性末端配对形成环状的 dsDNA这种由 黏性末端结合形成的双链区段称为 cos位点(

16、cohesive end site) 。? 含有 60 多个基因，整个基因组分为三部分11. 入噬菌体载体的构建与类型、各种载体承载量的大小。噬菌体载体的构建：? 缩短长度，提高装载量；? 删除重复的酶切位点，增加一些单一的酶切位点；? 加装选择标记 ( 免疫功能类标记和颜色反应类标记) ；? 构建琥珀密码子的突变体。噬菌体载体的类型： P44-45插入型载体：载体长度 37kb，插入片段大小0-14kb ( 51-37)置换型载体：载体长度 26kb，最小装载长度10kb ( 36-26 ),最大装载长度 25kb(51-26)12. 提取和纯化DNA的步骤主要有：?细胞裂解和DNA的溶解与

17、保护；?去除与核酸结合的蛋白质及 RNA等杂质；? DNA勺沉淀和纯化。13. 如何检测、评价提取的 DNA质量：(一)紫外分光光度法测定DNA RNA勺浓度和纯度? DNA或 RNA链上碱基的苯环结构在 260nm处有特异的紫外吸收峰，吸收 强度不仅与它们总含量有关，还与它们的分子形状、单双链有关。? 可用OD60/OD280值衡量DNA/RNA勺纯度? 纯DNA的OD6/OD80应为1.8 ,大于1.9表明有RNA亏染，小于1.6表明有蛋白质或酚污染；同时OD60/OC230应大于2.0，小于2.0表明溶液中有残存的多糖、盐和小分子杂质等。?纯RNA的OD6/OD280应介于1.7-2.0

18、之间，小于1.7说明有蛋白质或酚的污染，大于 2.0表明有异硫氰酸胍残存；同样 OD60/OD230应 大于 2.0 ，小于 2.0 表明有小分子及盐和多糖存在。? （ 二 ） 琼脂糖凝胶电泳鉴定? （ 三 ） 核酸的保存14. DNA电泳的影响因素：? DNA分子大小：分子越大，泳动越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。? DNA分子构型：超螺旋环状线状切口环状。? 凝胶浓度：浓度越高，电泳速率越慢；浓度低的胶线性范围较宽，浓度高的胶对小分子DNA呈较好的线性关系。? 电场强度：强度高，电泳速度快，但分辨率低。?凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭（EB）:插入dsDNA造成其负电荷减少

19、、 刚性和长度增加。对超螺旋的 DNA分子影响较大。15. 分子杂交的主要技术的原理、步骤及用途，探针的制备方法 分子杂交的基本原理：?具有互补特定核苷酸序列的 ssDNA或 RNA混在一起时，其相应同源区段 将会退火形成双链结构。?把一段已知基因（DNA或RNA的核酸序列用合适的标记物予以标记，当 作探针（probe），与变性后的单链基因组 DNA或 RNA等进行杂交。? 再用合适方法把标记物检测出来， 就可确定靶核苷酸序列的拷贝数及表 达丰度等。探针制备的方法：1. 均匀标记： （1） 切口平移法标记、 （2） 随机引物法 （6 核苷酸引物标记法 ） 、（3） PCR 扩增标记2. 末端标

20、记： 5末端标记法、 3末端标记法、 T4 聚合酶替代法。16. PCF技术的原理、步骤、体系及引物设计的原则PCF技术的原理：（变性、复性、半保留复制）在有DNA单链、与DNA单链互补的寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚合酶的情况下，当引物与单链的互补区结合后，在DNA聚合酶的催化作用下即可进行DNA单链的5f 3合成反应。PCF技术的基本过程 P79? DNA模板的变性（denatureation）:将待扩增 DNA加热至U 95 C左右，使dsDNA解幵成为单链并作为模板；? 模板与引物的结合 （退火 annealing 或复性 ）：将体系温度降至合适温度（55 C左右），使加入的引物与

21、模板 DNA两端碱基序列互补结合；?引物延伸（extension）:将体系温度升到72 C左右，Taq聚合酶催化 dNTP按碱基互补原则连接在 DNA引物 3端，使引物延伸，形成两 条与模板互补的新链。PCF反应的成分：1. 缓冲液， 2. MgCl 2， 3. dNTPs ， 4. 引物， 5. 模板 DNA， 6. TaqDNA聚合酶引物设计的 3条基本原则 :? 引物与模板的序列要紧密互补；? 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；?弓I物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。17. 基因文库的分类及操作步骤 分类：外源DNA片段、载体、宿主基因组DNA文库的构建程

22、序：?高纯度大相对分子质量基因组 DNA的提取和大片段的制备；?高纯度基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；?载体DNA的制备；? 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；? 重组克隆的挑选和保存。18.基因组DNA文库与cDNA文库的优缺点? cDNA文库的优点（与基因组文库相比）P 116-117? cDNA克隆以mRN的材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结 构研究及有关基因的克隆分离；? cDNA文库的筛选比较简单易行；? 假阳性的概率比较低；? cDNA克隆可进行原核表达；? cDNA克隆还可用于真核细胞 mRNA勺结构和功能研究。? cDNA文库的缺点（与基因组文库相比）

23、?包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响；? 不能直接获得基因内含子序列和调控序列的结构与功能信息，不能克隆到基因组 DNA中的非转录区段序列；? cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA勺分布状态, 即：高丰度mRNA勺cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易;低丰度mRNA勺cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难。19. 外源DNA片段与载体DNA片段连接方式：一、黏性末端勺连接（ 一 ） 同一种酶产生勺黏性末端勺连接（ 二 ） 不同种酶产生勺黏性末端勺连接二、平末端勺连接1. 直接连接2. 人工加尾形成 “粘性末端”（1）同聚加尾法（ 2）

24、衔接物 （linker） 连接法（ 3）接头 （adapter） 分子连接法三、PCR产物的连接1. 引入酶切位点连接法2. T-A 克隆法20. CaCl2法制备细胞感受态转化重组 DNA的原理及步骤。?原理：细菌处于0C的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀成球形，DNA与CsT结合形成抗DNase的复合物粘附于细胞表面，经42 C短暂热击后，细胞膜形成许多间隙，DNAS入细胞。P139细菌感受态细胞的制备过程 （CaCl2）：21. 重组子的筛选与鉴定的方法与原理，尤其是插入失活法、 b- 半乳糖苷 酶显色法和核酸杂交法一、载体表型选择法： P152-1531. 抗药性标记插入失活选择法2.

25、B -半乳糖苷酶显色反应选择法二、根据插入基因的表型选择法?原理：外源DNA编码的基因对宿主菌株所具有的突变发生体内抑制 或互补效应，从而使被转化的宿主细胞表现出外源基因编码的表型 特征三、DNA电泳检测法四、PCR检测法?原理：PCR能在模板序列上扩增出预期 DNA片断。五、核酸杂交检测法?原理：利用标记的核酸做探针与转化细胞的DNA进行分子杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。六、免疫化学检测法 P154-155? 原理：利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的 蛋白质的外源基因。22. 影响外源基因表达的因素：一、阅读框架对转化基因表达的影响二、顺式作用元件对转化基因表达的影

26、响三、翻译过程对表达的影响四、表达系统对表达产物的影响23. 原核与真核生物基因表达与调控的特点原核生物基因表达调控的特点：1. 原核生物基因表达以操纵子为单位。2. 原核生物只有一种RNA聚合酶。3. 原核生物无核膜，转录和翻译过程是偶联的。4. 原核生物基因一般不含内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后 加工系统。5. 原核生物基因表达的调控主要在转录水平 真核生物基因表达调控的特点：1. 基因组DNA的存在形式可影响基因表达，其基因的表达调控比原核 生物要复杂得多；2. 真核基因的转录和翻译不是偶联在一起的；3. 真核基因表达的调控是多层次的；4. 基因表达具有组织和细胞类型特异性；5

27、. 不同的真核细胞在基因表达调控中对信号分子的反应不同。24. 了解植物、动物和微生物基因工程的应用植物基因工程的应用（一）在植物遗传改良中的应用（二）作为药物生产的反应器动物基因工程的应用1. 利用转基因技术改良动物遗传性状2. 利用转基因动物生产生物大分子3. 异种器官移植4. 利用转基因技术构建医学动物模型5. 基因治疗微生物基因工程的应用（一）微生物基因工程在农业领域的应用（二）微生物基因工程在工业领域的应用（ 三 ） 微生物基因工程在药物生产上的应用（ 四 ） 微生物基因工程在环境保护上的应用25. 常见分子标记的种类、原理? 分子标记的类型? Hibridization-based

28、markers以分子杂交为基础的 DNA标记技术（RFLP标记、DN曲旨纹技术、原位杂交）? PCR-basedmarkers以PCF反应为核心的分子标记技术（RAPD 标记、SSR标记、SSLP标记、SCAR标记、AFLP标记、STS标 记）? Sequencing based markers 新型的分子标记（SNP标记、EST标记）1. 限制性片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism, RFLP）?原理：DNA序列上的微小变化，可能引起限制性内切酶切点的丢失 或产生，导致酶切片段长度的变化。2. 随机扩增多态性 DNA标记（rand

29、om amplified polymorphic DNA, RAPD）?原理：用一个随机引物（8-10个碱基）非定点地扩增基因组 DNA然后用凝胶电泳分开扩增片段。3. 扩增片段长度多态性 （amplified fragment length polymorphism,AFLP）?原理：先将基因组 DNA用两种限制酶切成大小不等的片断，并与含 有粘性末端的人工接头相连， 形成不同酶切位点的限制性酶切片 段，然后用与接头和位点相匹配的引物进行预扩增，预扩增产物作 为进一步PCR扩增的模板，再选用特异引物进行选择性扩增，扩增 后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异的限制性片段分离。4. 简单重复序列

30、（simple sequence repeat, SSR）?原理：根据两端序列的保守性，设计引物；进行 PCR电泳分离， 染色显带以检测微卫星序列多态性。一、名词解释（ 10个， 20 分）二、填空题（ 20 分，每空 1 分）三、单项选择题（ 10题， 10 分）四、判断题（ 10 题， 10分）五、简答题（ 30 分，每小题 6 分）六、论述题（ 1 题， 10 分）第二章填空题1. 枯草芽孢杆菌蛋白酶；（1）5 t 3合成酶的活性；（2）3 t 5外 切核酸酶2. 碱性磷酸酶； 5端的磷酸基团3. DNA聚合酶I : 5t 3外切核酸酶；5t3合成酶4. S1核酸酶切割；DNA聚合酶补平

31、5. 核酸水解酶 H； RNA6. 5 T 3合成酶；3 T 5外切核酸酶选择题1 b； 2b； 3b，c，d， e； 4b； 5d； 6b； 7a； 8a； 9d； 10b； 11 d； 1 2abc ； 13a，b； 14a； 15c； 16d； 17c； 18.B；19. D ； 20. D ； 21. D第三章1. 质粒载体、噬菌体载体、质粒噬菌体混合载体 (或克隆载体、表达 载体、整合载体)2. 复制区、选择标记、克隆位点3. 缺少选择标记，克隆位点4. (1) 分子量大 (2) 酶的多切点 (3) 无选择标记5. 75% 105%6. T-DNA区；Vir 区；Con 区；Ori

32、区7b； 8b； 9a，c，d，e； 10. d20. 答: 这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区段编码B -半乳糖 苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基-B -D-硫代半乳糖苷)可以诱导 该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的B-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(a -互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lac Z 的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物 X-gal(5- 溴 -4- 氯-3-吲哚-B -半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串克隆 位点克隆入B -半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使B -半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而