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1、生物技术制药3第五章第五章动物细胞制药动物细胞制药生物技术制药3第一节第一节 概述概述v16651665年英国物理学家虎克用自制的显微年英国物理学家虎克用自制的显微镜发现了细胞,实际上是死细胞留下的镜发现了细胞,实际上是死细胞留下的细胞壁,不久,荷兰科学家列文虎克才细胞壁,不久,荷兰科学家列文虎克才真正观察到了细胞。从此认为细胞是一真正观察到了细胞。从此认为细胞是一切动植物体结构和功能的基本单元。切动植物体结构和功能的基本单元。v18381838年德国的植物学家施莱登和动物学年德国的植物学家施莱登和动物学家施旺共同创立了细胞学说。家施旺共同创立了细胞学说。生物技术制药3细胞学说细胞学说v所有生
2、物都是由一个或多个细胞组成的;所有生物都是由一个或多个细胞组成的;v细胞是生命的基本单位;细胞是生命的基本单位;v新细胞是由原有细胞分裂而来的。新细胞是由原有细胞分裂而来的。生物技术制药3v细胞培养是将细胞从机体取出,在细胞培养是将细胞从机体取出,在体外模拟机体体内生理条件进行培体外模拟机体体内生理条件进行培养,使之生存和生长。养,使之生存和生长。v细胞培养已有近百年历史了。随着细胞培养已有近百年历史了。随着细胞生物学、分子生物学、生物化细胞生物学、分子生物学、生物化学和基因工程等一系列学科和技术学和基因工程等一系列学科和技术的发展,逐渐形成了细胞工程学。的发展,逐渐形成了细胞工程学。生物技术
3、制药3v细胞工程细胞工程是以细胞为单位,按人们是以细胞为单位,按人们的意志,应用生物学、分子生物学的意志,应用生物学、分子生物学等理论和技术,有目的地进行精心等理论和技术,有目的地进行精心操作,使细胞的某些遗传特性发生操作,使细胞的某些遗传特性发生改变,从而达到改良或产生新品种改变,从而达到改良或产生新品种的目的,以及使细胞增加或重新获的目的,以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力,从而得产生某种特定产物的能力,从而在离体条件下进行大量培养、增殖,在离体条件下进行大量培养、增殖,并提取出对人类有用的产品。并提取出对人类有用的产品。生物技术制药3生物技术制药3第二节第二节 动物细胞的形态
4、和生理特点动物细胞的形态和生理特点v一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态v动物细胞属于真核细胞,结构复杂,分化精动物细胞属于真核细胞,结构复杂,分化精确,不同细胞执行不同的功能,例如神经细确,不同细胞执行不同的功能,例如神经细胞具有很长的分支,很多的纤维,以便接受胞具有很长的分支,很多的纤维,以便接受和传递刺激,红细胞呈扁圆盘状,增大其接和传递刺激,红细胞呈扁圆盘状,增大其接触面等。但细胞在离体培养时形态会发生变触面等。但细胞在离体培养时形态会发生变化,根据不同的需要将离体培养的细胞分为化,根据不同的需要将离体培养的细胞分为三类:贴壁依赖型、贴壁非依赖型和兼性贴三类:贴壁依赖型、贴壁非依赖型和
5、兼性贴壁型壁型。生物技术制药3生物技术制药31 1、贴壁细胞、贴壁细胞v生长时必须要有给以贴附的支持物表生长时必须要有给以贴附的支持物表面,细胞依靠自身分泌的或培养基中面,细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖。和繁殖。生物技术制药3生物技术制药3v细胞在表面上生长时有细胞在表面上生长时有两种形态两种形态,成纤成纤维样细胞型维样细胞型和和上皮样细胞型上皮样细胞型。v成纤维样细胞型成纤维样细胞型主要来源于中胚层组织主要来源于中胚层组织细胞,如心肌细胞、平滑肌细胞成骨细细胞,如心肌细胞、平滑肌细胞成骨细胞等。胞等。v上皮样细胞型上皮样细胞
6、型主要来源于外胚层和内胚主要来源于外胚层和内胚层组织细胞,如皮肤细胞、肠管上皮细层组织细胞,如皮肤细胞、肠管上皮细胞,在培养过程中,随着培养条件的变胞,在培养过程中,随着培养条件的变化细胞形态也会发生改变。化细胞形态也会发生改变。生物技术制药3贴壁细胞单层培养的优点贴壁细胞单层培养的优点v1 1、可以很方便地进行完全换液;、可以很方便地进行完全换液;v2 2、如果需要高细胞密度,可通过灌流、如果需要高细胞密度,可通过灌流技术完成;技术完成;v3 3、很多细胞只有在贴壁时才能更有效、很多细胞只有在贴壁时才能更有效地表达产物;地表达产物;v4 4、可用于所有细胞类型。、可用于所有细胞类型。生物技术
7、制药3细胞贴壁的表面处理可以使用三种物质细胞贴壁的表面处理可以使用三种物质v1 1、玻璃,重复使用贴壁效果会降低,、玻璃,重复使用贴壁效果会降低,用用1mmol/L1mmol/L醋酸镁室温浸泡几个小时,醋酸镁室温浸泡几个小时,再用蒸馏水反复冲洗可恢复贴壁能力。再用蒸馏水反复冲洗可恢复贴壁能力。v2 2、塑料,聚苯乙烯最常用。、塑料,聚苯乙烯最常用。v3 3、金属,不锈钢或钛,化学特性呈惰、金属,不锈钢或钛,化学特性呈惰性,具有适合的高阴性电量。性,具有适合的高阴性电量。生物技术制药3单层培养的放大单层培养的放大v1 1、转瓶;、转瓶;v2 2、改进的转瓶,玻璃管、增大表面积的转、改进的转瓶,玻
8、璃管、增大表面积的转瓶;瓶;v3 3、单元操作系统,玻璃珠反应器、微载体、单元操作系统,玻璃珠反应器、微载体系统。系统。生物技术制药3生物技术制药3生物技术制药3生物技术制药3v2 2、悬浮细胞、悬浮细胞v生长不依赖支持物表面,在培养液中悬生长不依赖支持物表面,在培养液中悬浮生长,如淋巴细胞等。浮生长,如淋巴细胞等。v3 3、兼性贴壁细胞、兼性贴壁细胞v根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生根据生长条件的不同可贴壁也可悬浮生长,中国地鼠卵巢细胞。长,中国地鼠卵巢细胞。生物技术制药3生物技术制药3二、动物细胞生理特点二、动物细胞生理特点v1 1、分裂期长、分裂期长 v12-4812-48小时,同一种
9、属不同部位的小时,同一种属不同部位的细胞也不相同,分裂期受培养条件细胞也不相同,分裂期受培养条件的影响如温度、酸度、成分等。的影响如温度、酸度、成分等。生物技术制药3v2 2、细胞生长需贴附于基质,并有接触、细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象。抑制现象。 v大多数二倍体细胞的生长都需在一定的大多数二倍体细胞的生长都需在一定的基质上贴附,伸展后才能生长繁殖,机基质上贴附,伸展后才能生长繁殖,机制并不清楚,当细胞在基质上分裂增殖,制并不清楚,当细胞在基质上分裂增殖,逐渐汇合成片时,即细胞与周围细胞接逐渐汇合成片时,即细胞与周围细胞接触时,细胞就停止增殖触时,细胞就停止增殖接触抑制,若接触抑制,
10、若细胞转化成异倍体后,该抑制可解除。细胞转化成异倍体后,该抑制可解除。生物技术制药3v3 3、正常二倍体细胞的寿命是有限的。、正常二倍体细胞的寿命是有限的。 v正常二倍体细胞传代培养都是有限的,正常二倍体细胞传代培养都是有限的,大约在大约在5050代左右,然后细胞就会逐渐代左右,然后细胞就会逐渐死亡,但在培养基中加入表皮生长因死亡,但在培养基中加入表皮生长因子或经自然和人为的因素转为异倍体子或经自然和人为的因素转为异倍体后该细胞可转变成无限细胞系,更适后该细胞可转变成无限细胞系,更适合于工业生产。合于工业生产。生物技术制药3v4 4、动物细胞对周围环境十分敏感、动物细胞对周围环境十分敏感 v物
11、理化学因素,如渗透压、酸度、离物理化学因素,如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化子浓度、剪切力、微量元素等的变化都会影响其生长,这是由于动物细胞都会影响其生长,这是由于动物细胞没有细胞壁的保护,所以更敏感。没有细胞壁的保护,所以更敏感。生物技术制药3v5 5、动物细胞对培养基要求很高、动物细胞对培养基要求很高 v原核生物只要有碳源、氮源和无机盐原核生物只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长;而动物细胞不仅需要就可以生长;而动物细胞不仅需要1212种必需氨基酸、种必需氨基酸、8 8种以上维生素,多种种以上维生素,多种无机盐和微量元素、葡萄糖外,还需无机盐和微量元素、葡萄糖外,还需要多种
12、细胞生长因子和贴壁因子。要多种细胞生长因子和贴壁因子。生物技术制药3v6 6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。功能与细菌不同。 v动物细胞蛋白质的合成在游离和粗面动物细胞蛋白质的合成在游离和粗面型内质网上都可以进行,内质网上合型内质网上都可以进行,内质网上合成的蛋白质多数为糖蛋白,需要糖基成的蛋白质多数为糖蛋白,需要糖基化,而细菌细胞则没有糖基化过程。化,而细菌细胞则没有糖基化过程。生物技术制药3动物细胞作为宿主细胞生产药物的动物细胞作为宿主细胞生产药物的优点和缺点:优点和缺点:v优点优点:多半可分泌到细胞外,提取纯化:多半可分泌到细胞外,提取纯化
13、方便,蛋白质经糖基化修饰后与天然产方便,蛋白质经糖基化修饰后与天然产物更一致,适合于临床应用。物更一致,适合于临床应用。v缺点缺点:培养条件要求高、成本高、产量:培养条件要求高、成本高、产量低。低。生物技术制药3第三节第三节 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得v一、要求一、要求v最初要求生产用动物细胞必须是原代细胞,以最初要求生产用动物细胞必须是原代细胞,以后放宽至二倍体细胞即可,即使是经过多次传后放宽至二倍体细胞即可,即使是经过多次传代也可用,但是非二倍体细胞是绝对禁止使用代也可用,但是非二倍体细胞是绝对禁止使用的,因为担心异倍体细胞的核酸会影响到人的的,因为担心异倍体细胞
14、的核酸会影响到人的正常染色体,有致癌的危险。由于二倍体细胞正常染色体,有致癌的危险。由于二倍体细胞传代不会超过传代不会超过5050代,所以使用受到限制。后来代,所以使用受到限制。后来发现异倍体也可使用,并未对机体产生影响,发现异倍体也可使用,并未对机体产生影响,并且可无限使用,对工业生产带来了极大的方并且可无限使用,对工业生产带来了极大的方便。便。生物技术制药3二、获得二、获得v原代细胞、已建立的二倍体细胞系及可原代细胞、已建立的二倍体细胞系及可无限传代的转化细胞系。无限传代的转化细胞系。v1 1、原代细胞、原代细胞v直接取自动物组织、器官,经过粉碎、直接取自动物组织、器官,经过粉碎、消化后获
15、得的细胞悬液。需大量动物,消化后获得的细胞悬液。需大量动物,费钱费劳力。费钱费劳力。生物技术制药3v2 2、二倍体细胞、二倍体细胞v原代细胞经过传代、筛选和克隆,从而原代细胞经过传代、筛选和克隆,从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。某种具有一定特征的细胞株。v特点特点:二倍体;有明显的贴壁和接触抑:二倍体;有明显的贴壁和接触抑制特性;有限的增殖能力;无致瘤性。制特性;有限的增殖能力;无致瘤性。生物技术制药3v3 3、转化细胞系、转化细胞系v通过转化形成,变成了异倍体,有无限通过转化形成,变成了异倍体,有无限增殖能力。转化可自发,在传
16、代过程中增殖能力。转化可自发,在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞;也可人自己转变成可无限增殖的细胞;也可人为转化,采用某些试剂处理,或从动物为转化,采用某些试剂处理,或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系。优点:无的肿瘤组织中建立的细胞系。优点:无限传代、倍增时间短、对培养条件和生限传代、倍增时间短、对培养条件和生长因子的要求低,适合于大规模工业化长因子的要求低,适合于大规模工业化生产。生产。生物技术制药3三、生产常用动物细胞的特性三、生产常用动物细胞的特性vWI-38WI-38:人二倍体细胞系,成纤维细胞,:人二倍体细胞系,成纤维细胞,能产生胶原,倍增时间为能产生胶原,倍增时间为2424小时,
17、有限小时,有限寿命寿命5050代,用于制备疫苗。代,用于制备疫苗。vMRC-5MRC-5:人二倍体细胞系,成纤维细胞,:人二倍体细胞系,成纤维细胞,有限寿命有限寿命42-4642-46代,用于制备疫苗。代,用于制备疫苗。vCHO-K1CHO-K1:从中国地鼠卵巢中分离的上皮:从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞,用于构建工程菌。样细胞,用于构建工程菌。生物技术制药3vBHK-21BHK-21:从地鼠幼鼠的肾脏中分离。成:从地鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞,用于构建工程菌,可生产纤维样细胞,用于构建工程菌,可生产疫苗。疫苗。vVeroVero:从非洲绿猴肾中分离,贴壁依赖:从非洲绿猴肾中分离,贴壁
18、依赖的成纤维细胞,用于制备疫苗。的成纤维细胞,用于制备疫苗。vNamalwaNamalwa:从淋巴瘤病人分离,生产干:从淋巴瘤病人分离,生产干扰素。扰素。vSP2/0-Ag14SP2/0-Ag14:从抗羊红细胞活性的小鼠:从抗羊红细胞活性的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系融合获得,生产脾细胞和骨髓瘤细胞系融合获得,生产单克隆抗体。单克隆抗体。生物技术制药3四、基因工程细胞的构建和筛选四、基因工程细胞的构建和筛选v生产中常采用融合细胞或基因工程构建生产中常采用融合细胞或基因工程构建的工程细胞。的工程细胞。生物技术制药31 1、真核细胞基因表达载体的构建、真核细胞基因表达载体的构建v常用病毒或质粒载体,用
19、杆状病毒作载常用病毒或质粒载体,用杆状病毒作载体的体的优点优点:该病毒基因是双链的容易进:该病毒基因是双链的容易进行重组;插入行重组;插入7-87-8千碱基对不影响正常千碱基对不影响正常病毒的形成;可用外源基因更换部分病病毒的形成;可用外源基因更换部分病毒基因,仍具有感染力;有很强的启动毒基因,仍具有感染力;有很强的启动子;用光学显微镜可见,容易挑选阳性子;用光学显微镜可见,容易挑选阳性克隆;可直接表达外源基因。克隆;可直接表达外源基因。生物技术制药3v构建穿梭质粒载体的基本成分构建穿梭质粒载体的基本成分:v允许载体在细胞内扩增的质粒序列;允许载体在细胞内扩增的质粒序列;v含有能使基因转录表达
20、调控元件;含有能使基因转录表达调控元件;v能用以筛选出外源基因已整合的选择标能用以筛选出外源基因已整合的选择标记;记;v有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。统。生物技术制药32 2、载体的导入和高效表达、载体的导入和高效表达工程细胞的筛选工程细胞的筛选v载体的导入可用融合法、化学法、物理载体的导入可用融合法、化学法、物理法、病毒法。最常用磷酸钙沉淀和电穿法、病毒法。最常用磷酸钙沉淀和电穿孔法。孔法。生物技术制药3磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 v将溶解的将溶解的DNADNA加在磷酸氢二钠溶液中,再加在磷酸氢二钠溶液中,再逐渐加入氯化钙溶液,当磷酸氢二钠和逐渐加入氯
21、化钙溶液,当磷酸氢二钠和氯化钙形成磷酸钙沉淀时,氯化钙形成磷酸钙沉淀时,DNADNA被包裹在被包裹在当中,形成当中,形成DNA-DNA-磷酸钙共沉淀。当沉淀磷酸钙共沉淀。当沉淀物与细胞表面接触时,通过细胞吞噬作物与细胞表面接触时,通过细胞吞噬作用将用将DNADNA导入其中。优点是方法简单、可导入其中。优点是方法简单、可进行共转化,可将不含选择性标记的进行共转化,可将不含选择性标记的DNADNA和含选择性标记的和含选择性标记的DNADNA放在一起进行形成放在一起进行形成混合的共沉淀物,一起导入细胞。混合的共沉淀物,一起导入细胞。 生物技术制药3电穿孔法电穿孔法 v借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场,
22、使细借助电穿孔仪产生的高压脉冲电场,使细胞膜出现瞬时可逆性的小孔,外源胞膜出现瞬时可逆性的小孔,外源DNADNA即即可进入细胞。转化效率较高,但进入的可进入细胞。转化效率较高,但进入的DNADNA拷贝数较低。依靠构建载体内的选择拷贝数较低。依靠构建载体内的选择性标记采用相应的筛选系统:性标记采用相应的筛选系统:HATHAT、GPTGPT、G418G418、MTXMTX筛选相应的转化细胞;对选出筛选相应的转化细胞;对选出的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化。的细胞要进行克隆和亚克隆使其纯化。 生物技术制药3五、细胞库的建立五、细胞库的建立v除原代细胞外,其他细胞株、细胞系,除原代细胞外,其他细胞株、
23、细胞系,包括二倍体、转化细胞、融合细胞和工包括二倍体、转化细胞、融合细胞和工程细胞都需建立细胞库保存。用于生产程细胞都需建立细胞库保存。用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库,原始的工程细胞必须建立两个细胞库,原始细胞库和生产用细胞库。细胞库和生产用细胞库。生物技术制药3v原始细胞库应有详细档案原始细胞库应有详细档案:v1 1、该细胞系的历史:来源、动物的年、该细胞系的历史:来源、动物的年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养材料。养材料。v2 2、该细胞的特性:形态、生长特性。、该细胞的特性:形态、生长特性。v3 3、对各种有害因子的检查结果,细菌、对各种有害因
24、子的检查结果,细菌、真菌、支原体和各种病毒。真菌、支原体和各种病毒。生物技术制药3第四节第四节 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基v一、动物细胞在体外培养所需条件一、动物细胞在体外培养所需条件v1 1、所有的与细胞接触的设备、器材和溶、所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌,避免污染;液都必须保持绝对无菌,避免污染;v2 2、必须有足够的营养保证,绝对不可有、必须有足够的营养保证,绝对不可有有害的物质,避免有害离子;有害的物质,避免有害离子;生物技术制药3v3 3、保证有适量的氧气供应;、保证有适量的氧气供应;v4 4、需随时清除细胞代谢中的有害产物;、需随时清
25、除细胞代谢中的有害产物;v5 5、有良好的适于生存的外界环境,渗透、有良好的适于生存的外界环境,渗透压、离子浓度和酸度;压、离子浓度和酸度;v6 6、及时分种,保持合适的细胞密度。、及时分种,保持合适的细胞密度。生物技术制药3二、动物培养基的种类和组成二、动物培养基的种类和组成v天然培养基天然培养基v合成培养基合成培养基v无血清培养基无血清培养基生物技术制药3v血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。液、羊水、腹水。1 1、天然培养基、天然培养基生物技术制药32 2、合成培养基、合成培养基v组成稳定、可大量生产供应。成分为氨组成稳定、可大量生产供应。成分为氨
26、基酸(细胞合成蛋白质的原料)、维生基酸(细胞合成蛋白质的原料)、维生素(维持细胞生命活动的低分子活性物素(维持细胞生命活动的低分子活性物质,形成酶的辅基或辅酶)、糖类(碳质,形成酶的辅基或辅酶)、糖类(碳源)、无机盐(保持细胞的渗透压并参源)、无机盐(保持细胞的渗透压并参与代谢)、其他(前体和氧化还原剂)。与代谢)、其他(前体和氧化还原剂)。生物技术制药3v合成培养基中除了各种营养成分外,合成培养基中除了各种营养成分外,还需添加还需添加5%-10%5%-10%的小牛血清,才能使的小牛血清,才能使细胞很好地增殖。细胞很好地增殖。生物技术制药3添加小牛血清的作用添加小牛血清的作用v1 1、提供有利
27、于细胞生长增殖所需的各种、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子和激素;生长因子和激素;v2 2、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子和伸展因子;和伸展因子;v3 3、提供可识别金属、激素、维生素和脂、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白;类的结合蛋白;v4 4、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量、提供细胞生长所必需的脂肪酸和微量元素。元素。生物技术制药33 3、无血清培养基、无血清培养基v无血清培养基在天然或合成培养基的基无血清培养基在天然或合成培养基的基础上添加激素、生长因子、结合蛋白、础上添加激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素。贴附和
28、伸展因子及其他元素。生物技术制药3无血清培养基的优点无血清培养基的优点v优点优点:1、提高了细胞培养的可重复性,避、提高了细胞培养的可重复性,避免了血清差异所带来的细胞差异;免了血清差异所带来的细胞差异;v2、减少了由血清带来的病毒、真菌和支原、减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险;体等微生物污染的危险;v3、供应充足、稳定;细胞产品易于纯化;、供应充足、稳定;细胞产品易于纯化;v4、避免了血清中某些因素对有些细胞的毒、避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性;性;v5、减少了血清中蛋白对某些生物测定的干、减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰,便于结果分析。扰,便于结果分析。生物
29、技术制药3第五节第五节 动物细胞培养的基本方动物细胞培养的基本方法法v一、细胞分离一、细胞分离v二、细胞计数二、细胞计数v三、细胞传代三、细胞传代v四、细胞的冻存和复苏四、细胞的冻存和复苏生物技术制药3一、细胞分离一、细胞分离v1 1、离心分离法、离心分离法v从含有细胞的体液如血液、羊水、腹水从含有细胞的体液如血液、羊水、腹水中分离细胞。中分离细胞。v800-1000800-1000转转/ /分,离心分,离心5-105-10分。分。v转速过高或时间过长会使细胞损坏或死转速过高或时间过长会使细胞损坏或死亡。亡。生物技术制药32 2、消化分离法、消化分离法v先从生物体取来组织块,将其剪碎,并先从生
30、物体取来组织块,将其剪碎,并用消化液将其消化,使组织松散成细胞用消化液将其消化,使组织松散成细胞悬液,然后用缓冲液洗涤,离心,去除悬液,然后用缓冲液洗涤,离心,去除残留的消化液而获得所需的细胞。残留的消化液而获得所需的细胞。v常用的消化物:常用的消化物:v胰蛋白酶、胰蛋白酶、EDTAEDTA、胰酶柠檬酸盐、胰、胰酶柠檬酸盐、胰酶酶EDTAEDTA等。等。生物技术制药3二、细胞计数二、细胞计数v在细胞分离制成悬液准备接种培养前都在细胞分离制成悬液准备接种培养前都要对细胞进行计数,然后按需要量接种要对细胞进行计数,然后按需要量接种于培养瓶或反应器中。在观察细胞增长于培养瓶或反应器中。在观察细胞增长
31、变化以及药物对细胞的抑制作用时也常变化以及药物对细胞的抑制作用时也常用到计数。用到计数。v常用方法:自动细胞计数器常用方法:自动细胞计数器v 血球计数板计数血球计数板计数v 结晶紫染色细胞核计数结晶紫染色细胞核计数v MTTMTT染色计数法染色计数法生物技术制药3三、细胞传代三、细胞传代v当细胞增殖到一定程度,由于营养条件、当细胞增殖到一定程度,由于营养条件、代谢废物、接触抑制等限制,需要及时代谢废物、接触抑制等限制,需要及时分种,否则细胞会死亡、脱落,所以在分种,否则细胞会死亡、脱落,所以在培养过程中要及时传代。培养过程中要及时传代。v悬浮细胞的传代:将原培养瓶中的细胞悬浮细胞的传代:将原培
32、养瓶中的细胞悬液分种到几个装有新鲜培养基的培养悬液分种到几个装有新鲜培养基的培养瓶中。瓶中。v贴壁细胞的传代:先消化再分种。贴壁细胞的传代:先消化再分种。生物技术制药3四、细胞的冻存和复苏四、细胞的冻存和复苏v冻存冻存v为了长期让细胞存活即保存细胞,常采为了长期让细胞存活即保存细胞,常采用液氮低温冻存(用液氮低温冻存(-196-196)。在冻存过)。在冻存过程中,渗透压的改变会影响脂蛋白使细程中,渗透压的改变会影响脂蛋白使细胞膜破裂,可适当加入保护剂,如甘油胞膜破裂,可适当加入保护剂,如甘油和二甲基亚砜,这些小分子容易渗入到和二甲基亚砜,这些小分子容易渗入到细胞中。在冷冻过程中速度控制很重要,
33、细胞中。在冷冻过程中速度控制很重要,太慢会产生冰晶损伤细胞,太快不足以太慢会产生冰晶损伤细胞,太快不足以使水分排出。使水分排出。生物技术制药3冻存中应注意的事项冻存中应注意的事项v1 1、冻存的细胞应处在良好的营养状态,在冻、冻存的细胞应处在良好的营养状态,在冻存前一天要换培养液。存前一天要换培养液。v2 2、细胞密度以、细胞密度以1 1* *10106 62 2* *10106 6个个/mL /mL 为好。为好。v3 3、冻存用培养基要和实际使用的一致,保护、冻存用培养基要和实际使用的一致,保护剂也需要除菌。剂也需要除菌。v4 4、分装安瓿若是玻璃材质,需要检验其密封、分装安瓿若是玻璃材质,
34、需要检验其密封性。性。v5 5、标签上要写明细胞名称、编号和冻存日期。、标签上要写明细胞名称、编号和冻存日期。生物技术制药3复苏复苏v复苏要做到快融。复苏要做到快融。v1 1、从液氮罐中取出的安瓿要立即放入、从液氮罐中取出的安瓿要立即放入装有装有37374040温水的搪瓷杯内,并搅温水的搪瓷杯内,并搅动加速融化、动加速融化、v2 2、用乙醇消毒安瓿外表。、用乙醇消毒安瓿外表。v3 3、二甲基亚砜对细胞有一定的毒性作、二甲基亚砜对细胞有一定的毒性作用,融化后将细胞立即离心,换新鲜培用,融化后将细胞立即离心,换新鲜培养液。养液。生物技术制药3第六节第六节 动物细胞的培养方法和操作方式动物细胞的培养
35、方法和操作方式v一、动物细胞的大规模培养方法一、动物细胞的大规模培养方法v根据培养细胞可分为原代细胞培养和传根据培养细胞可分为原代细胞培养和传代细胞培养;代细胞培养;v根据培养容器和方式可分为,静止培养、根据培养容器和方式可分为,静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定床和流化床培养;空纤维培养、固定床和流化床培养;v实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁贴壁- -悬浮培养。悬浮培养。生物技术制药31 1、悬浮培养、悬浮培养v优点优点:操作简单、培养条件均一、传质:操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好,
36、容易扩大培养规模,可和传氧比较好,容易扩大培养规模,可借鉴细菌发酵的经验。借鉴细菌发酵的经验。v缺点缺点:体积小,较难采用灌流培养。常:体积小,较难采用灌流培养。常用反应器为搅拌和气升式。用反应器为搅拌和气升式。生物技术制药32 2、贴壁培养、贴壁培养v优点优点:适用的细胞种类多,较容易采用:适用的细胞种类多,较容易采用灌流培养,达到高密度细胞。灌流培养,达到高密度细胞。v缺点缺点:操作比较复杂,需要合适的贴附:操作比较复杂,需要合适的贴附材料和足够的面积,培养条件不易均一,材料和足够的面积,培养条件不易均一,传质和传氧较差。传质和传氧较差。生物技术制药33 3、贴壁、贴壁- -悬浮培养悬浮培
37、养v微载体培养。微载体培养。v优点优点:可创造相当大的贴附面积,载:可创造相当大的贴附面积,载体体积较小,比重较轻,在轻度搅拌体体积较小,比重较轻,在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内,发挥悬浮培养的特长。内,发挥悬浮培养的特长。生物技术制药3包埋和微曩培养包埋和微曩培养包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细胞可获得保护,避免了剪切力的损害;胞可获得保护,避免了剪切力的损害;可以获得较高的细胞密度;通过控制可以获得较高的细胞密度;通过控制微曩膜的孔径可使产品浓缩在微曩内微曩膜的孔径可使产品浓缩在微曩内有利于下游处理;可采用多种生
38、物反有利于下游处理;可采用多种生物反应器进行大规模培养。应器进行大规模培养。生物技术制药3多孔载体多孔载体由实心微球向开放的内部相互由实心微球向开放的内部相互连接的多孔微球的转变极大地增加了贴壁面积,连接的多孔微球的转变极大地增加了贴壁面积,其优点为:其优点为:1 1、提高细胞密度、提高细胞密度20205050倍;倍;2 2、同时支持悬浮与贴壁培养;、同时支持悬浮与贴壁培养;3 3、很容易达到三维空间的细胞固定;、很容易达到三维空间的细胞固定;4 4、到球体内的扩散路径更短;、到球体内的扩散路径更短;5 5、适于搅拌、流化床或固定床反应器;、适于搅拌、流化床或固定床反应器;6 6、有良好的放大
39、潜力;、有良好的放大潜力;7 7、细胞免受剪切力的影响;、细胞免受剪切力的影响;8 8、可长期连续培养。、可长期连续培养。生物技术制药3二、动物细胞培养的操作方式二、动物细胞培养的操作方式v分批培养分批培养v半连续培养半连续培养v灌流式培养灌流式培养生物技术制药3分批培养分批培养v将细胞和培养基一次性加入反应器内,将细胞和培养基一次性加入反应器内,待培养结束后,放出培养液,进行提取。待培养结束后,放出培养液,进行提取。生物技术制药3生物技术制药3半连续培养半连续培养v细胞和培养基一起加入反应器后,每间细胞和培养基一起加入反应器后,每间隔一段时间取出部分培养物,再加入同隔一段时间取出部分培养物,
40、再加入同样数量的新鲜培养基。样数量的新鲜培养基。生物技术制药3灌流培养灌流培养v细胞和培养基加入反应器后,在产物形细胞和培养基加入反应器后,在产物形成过程中,不断取出培养基同时不断补成过程中,不断取出培养基同时不断补充新鲜培养基。充新鲜培养基。生物技术制药3生物技术制药3灌流培养的优点灌流培养的优点v1 1、细胞可处于稳定良好的环境中,营、细胞可处于稳定良好的环境中,营养条件好、有害代谢废物浓度低;养条件好、有害代谢废物浓度低;v2 2、可极大地提高细胞密度;、可极大地提高细胞密度;v3 3、产品在罐内停留时间短,可及时分、产品在罐内停留时间短,可及时分离出产品并在低温下保存,有利于产品离出产
41、品并在低温下保存,有利于产品质量的提高;质量的提高;v4 4、培养基的比消耗率低,产品质量高,、培养基的比消耗率低,产品质量高,成本降低。成本降低。生物技术制药3第七节第七节 动物细胞产品的纯化方法和动物细胞产品的纯化方法和质量要求质量要求v一、动物细胞产品常用的纯化方法一、动物细胞产品常用的纯化方法v1 1、离心、离心v纯化的早期阶段,用以去除细胞、细胞纯化的早期阶段,用以去除细胞、细胞碎片或其他较大的杂质。常在低温下进碎片或其他较大的杂质。常在低温下进行。行。v2 2、离子交换层析、离子交换层析v根据各种蛋白质所带的电荷性质不同进根据各种蛋白质所带的电荷性质不同进行分离。行分离。生物技术制
42、药3v3 3、凝胶过滤、凝胶过滤v根据各种蛋白质分子量大小的差异进行根据各种蛋白质分子量大小的差异进行分离。分离。v4 4、亲和层析、亲和层析v根据特异性结合的性质,如酶和底物,根据特异性结合的性质,如酶和底物,抗原和抗体。抗原和抗体。v5 5、盐析和有机溶剂沉淀、盐析和有机溶剂沉淀v6 6、透析、透析v7 7、高压液相层析、高压液相层析生物技术制药3二、动物细胞产品的质量要求二、动物细胞产品的质量要求v1 1、对工程细胞的要求、对工程细胞的要求v历史资料:来源、动物年龄和性别、细历史资料:来源、动物年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养基。胞分离的方法和所用的培养基。v细胞特性资料:形态、生
43、长特征、细胞细胞特性资料:形态、生长特征、细胞抗原、染色体等。抗原、染色体等。v无污染:细菌、真菌、支原体和各种病无污染:细菌、真菌、支原体和各种病毒。毒。生物技术制药32、对生产工艺的要求、对生产工艺的要求v厂房条件符合国家规定,所用的一切原厂房条件符合国家规定,所用的一切原料、试剂都必须质量稳定可靠。料、试剂都必须质量稳定可靠。v在细胞培养中尽可能少用或不用小牛血在细胞培养中尽可能少用或不用小牛血清,必须用时需严格挑选,以防病毒和清,必须用时需严格挑选,以防病毒和支原体污染。支原体污染。v纯化过程要低温进行。纯化过程要低温进行。v纯化后的产品需经严格质量检测,合格纯化后的产品需经严格质量检
44、测,合格后才可分装。后才可分装。生物技术制药33 3、对产品的质量要求、对产品的质量要求v纯度纯度v生物活性生物活性v比活性比活性v稳定性稳定性v临床前的安全性和有效性评价临床前的安全性和有效性评价v临床试验的安全性和有效性评价临床试验的安全性和有效性评价生物技术制药3第八节第八节 动物细胞制药的实例动物细胞制药的实例v组织纤溶酶原激活剂(组织纤溶酶原激活剂(tPAtPA)生产工艺:)生产工艺:v组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶,组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶,它与纤溶酶原亲和力低,而与纤维蛋白亲和它与纤溶酶原亲和力低,而与纤维蛋白亲和力较大,力较大,后两者后两者结合后形成的复合物可
45、提高结合后形成的复合物可提高其与其与tPAtPA的亲和力,使纤溶酶原活化为纤溶酶,的亲和力,使纤溶酶原活化为纤溶酶,后这可水解纤维蛋白,导致血栓溶解,故对后这可水解纤维蛋白,导致血栓溶解,故对血栓性疾病有较好疗效。人黑色素瘤细胞株血栓性疾病有较好疗效。人黑色素瘤细胞株培养后可产生大量的培养后可产生大量的tPAtPA,其培养液中,其培养液中tPAtPA浓浓度可达到度可达到1 1毫克毫克/ /升。升。生物技术制药3(1 1)、工艺流程)、工艺流程生物技术制药3(2 2)、工艺过程)、工艺过程vA A、培养基:主要为、培养基:主要为EagleEagle培养基,其主要成分(毫克培养基,其主要成分(毫克
46、/ /升)为升)为L-L-盐酸精氨酸盐酸精氨酸2121,L-L-胱氨酸胱氨酸1212,L-L-谷氨酰胺谷氨酰胺292292,L-L-盐酸组氨酸盐酸组氨酸9.59.5,L-L-异亮氨酸异亮氨酸2626,L-L-亮氨酸亮氨酸2626,L-L-盐酸赖氨酸盐酸赖氨酸3636,L-L-蛋氨酸蛋氨酸7.57.5,L-L-苯丙氨酸苯丙氨酸1818,L-L-苏氨酸苏氨酸2424,L-L-色氨酸色氨酸4 4,L-L-酪氨酸酪氨酸1818,L-L-缬氨酸缬氨酸2424,氯化胆碱氯化胆碱1 1,叶酸,叶酸1 1,肌醇,肌醇2 2,烟酸,烟酸1 1,泛酸钙,泛酸钙1 1,盐酸,盐酸吡哆醛吡哆醛1 1,核黄素,核黄素0
47、.10.1,硫胺素,硫胺素1 1,生物素,生物素1 1,氯化钠,氯化钠68006800,氯化钾,氯化钾400400,氯化钙,氯化钙200200,七水硫酸镁,七水硫酸镁200200,二,二水磷酸二氢钠水磷酸二氢钠150150,碳酸氢钠,碳酸氢钠20002000,葡萄糖,葡萄糖10001000。此。此外尚加入青霉素外尚加入青霉素100100单位单位/ /毫升,链霉素毫升,链霉素100100单位单位/ /毫升毫升及及10%10%小牛血清。小牛血清。生物技术制药3vB B、tPAtPA抗体制备:取人抗体制备:取人tPAtPA或猪心或猪心tPAtPA免免疫家兔,按每只家兔疫家兔,按每只家兔2000-30
48、02000-300微克计,微克计,用福式完全佐剂充分乳化注入家兔皮下,用福式完全佐剂充分乳化注入家兔皮下,每隔两周再用每隔两周再用100100微克微克tPAtPA加强免疫,共加强免疫,共加强两次。然后取家兔血清,用加强两次。然后取家兔血清,用50%50%硫硫酸胺盐析,沉淀于酸胺盐析,沉淀于0 0度对生理盐水透析度对生理盐水透析及及Sephadex 75Sephadex 75柱层析,得抗柱层析,得抗tPAtPA的免疫的免疫球蛋白球蛋白G G。生物技术制药3vC C 、 抗、 抗 t P At P A 亲 和 吸 附 剂 制 备 : 取亲 和 吸 附 剂 制 备 : 取Sepharose 4BSe
49、pharose 4B用用1010倍体积蒸馏水分多次倍体积蒸馏水分多次漂洗,布式漏斗抽滤,称取漂洗,布式漏斗抽滤,称取2020克湿凝胶克湿凝胶于于500500毫升颈烧瓶中,加蒸馏水毫升颈烧瓶中,加蒸馏水3030毫升,毫升,搅匀后,用搅匀后,用2 2摩尔摩尔/ /升升NaOHNaOH溶液调溶液调pH11pH11,降温至降温至1818度,在通风橱中另取溴化氰度,在通风橱中另取溴化氰1.51.5克于乳钵中,用克于乳钵中,用30-4030-40毫升蒸馏水分毫升蒸馏水分多次研磨溶解,将溴化氰溶液倾入三颈多次研磨溶解,将溴化氰溶液倾入三颈瓶中,升温至瓶中,升温至20-2220-22度,反应同时滴加度,反应同
50、时滴加2 2摩尔摩尔/ /升升NaOHNaOH溶液维持溶液维持pH11-12pH11-12,待反应,待反应液液pHpH不变时,继续反应不变时,继续反应5 5分,整个操作分,整个操作在在1515分内完成。分内完成。生物技术制药3v取出烧瓶,向其中投入小冰块降温,永取出烧瓶,向其中投入小冰块降温,永号垂熔漏斗抽滤,然后用号垂熔漏斗抽滤,然后用300300毫升毫升4 4度的度的0.10.1摩尔摩尔/ /升碳酸氢钠溶液洗涤,再用升碳酸氢钠溶液洗涤,再用500500毫升,毫升,pH10.2pH10.2,0.0250.025摩尔摩尔/ /升硼酸升硼酸缓冲液冲洗缓冲液冲洗3-43-4次,抽滤洗涤,最后转次,
51、抽滤洗涤,最后转移至移至250250毫升烧杯中,加毫升烧杯中,加50-6050-60毫升上述毫升上述硼 酸 缓 冲 液 冲 洗 , 即 得 活 化 的硼 酸 缓 冲 液 冲 洗 , 即 得 活 化 的Sepharose 4BSepharose 4B备用。备用。 生物技术制药3v另取另取70-8070-80克上述抗克上述抗tPA tPA 免疫球蛋白免疫球蛋白G G溶于溶于2020毫升硼酸缓冲液中,过滤,滤液加至上述活毫升硼酸缓冲液中,过滤,滤液加至上述活化的化的Sepharose 4BSepharose 4B中,中,1010度搅拌反应度搅拌反应16-1816-18小时,次日装柱,用小时,次日装柱
52、,用1010倍柱床体积的倍柱床体积的pH10.2pH10.2硼酸缓冲液以硼酸缓冲液以5-65-6毫升毫升/ /分流速洗涤柱床,收分流速洗涤柱床,收集流出液,并测定集流出液,并测定A280A280,然后再依次用,然后再依次用5 5倍倍柱床体积的柱床体积的pH10.0pH10.0,0.10.1摩尔摩尔/ /升乙醇胺溶液升乙醇胺溶液及及 pH8.0pH8.0,0.10.1摩尔摩尔/ /升硼酸缓冲液充分洗涤,升硼酸缓冲液充分洗涤,直至流出液直至流出液A280A2800.010.01,所得固定化抗,所得固定化抗tPAtPA的免疫球蛋白的免疫球蛋白G G即为即为tPAtPA的亲和吸附剂,将其的亲和吸附剂,
53、将其转移至含转移至含0.01%NaN3 pH7.4,0.10.01%NaN3 pH7.4,0.1摩尔摩尔/ /升磷酸升磷酸缓冲液中,于缓冲液中,于4 4度储存,备用。度储存,备用。生物技术制药3vD D、细胞培养:将人黑色素瘤种质细胞按常规、细胞培养:将人黑色素瘤种质细胞按常规方法消化分散后,洗涤及计数,稀释成细胞方法消化分散后,洗涤及计数,稀释成细胞悬浮液,备用。另取悬浮液,备用。另取5 5升玻璃转瓶,按每升玻璃转瓶,按每1 1平平方米表面积方米表面积2.52.5升比例加入细胞培养基,然后升比例加入细胞培养基,然后将上述细胞悬浮液接种至转瓶中,接种浓度将上述细胞悬浮液接种至转瓶中,接种浓度为(为(1-31-3)10103 3细胞细胞/ /毫升,然后置于毫升,然后置于3737度,度,二氧化碳培养箱中,通入含二氧化碳培养箱中,通入含5%5%二氧化碳的无二氧化碳的无菌空气培养至长成致密单层后,弃去培养液,菌空气培养至长成致密单层后,弃去培养液,再用再用pH7.4pH7.4,0.10.1摩尔摩尔/ /升磷酸缓冲液洗涤细胞升磷酸缓冲液洗涤细胞单层单层2-32-3次,再换入无血清次,再换入无血清EagleEagle培养液继续培养液继续培养。然后每隔培养。然后每隔3-43-4天即收获一次培养液,用天即收获一次培养液,用于制备于制备tPAtPA,同时向转瓶中加入新鲜培养液继,
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