AAAA分散片人体生物等效性试验研究报告32号资料临床实验报告

1、目 录1. 摘要12. 伦理学和有关指导原则13. 缩写说明24. 引言25. 试验目的36. 试验管理37. 试验总体设计及方案48. 试验设计及参比药选择的依据49. 受试者选择510.试验药物911.给药剂量及给药途径912.生物样本采集913.生物样品分析方法的建立与确证914.数据质量保证2315.研究结果数据2316.生物等效性评价3517.临床不良事件观察及分析3518.主要参考文献3519.附件目录36aaaa分散片人体生物等效性试验研究报告1.摘要本试验采用hplc-ms法测定20名健康男性志愿受试者分别口服bbb制药有限公司提供的aaaa分散片100mg（受试制剂，规格：1

2、00mg/片）或ccc有限责任公司生产的aaaa分散片100mg（参比制剂，规格：100mg /片）后不同时刻血浆中aaaa的浓度，绘制了血药浓度-时间曲线。由血药浓度-时间数据，获得受试制剂和参比制剂的主要药代动力学参数，采用方差分析和双单侧检验法进行生物等效性判定。用hplc-ms法测定血浆中aaaa的浓度，血浆中内源性物质不干扰样品测定。aaaa标准曲线线性范围为20.07000.0 ng/ml，定量下限为20.0 ng/ml，回收率为86.0% 87.4 %；批内和批间精密度与准确度均符合有关规定1，符合生物样品分析要求。受试制剂aaaa的t1/2：3.5 0.9h，cmax：3949

3、.1 839.4 ng/ml，tmax：3.3 0.7 h，auc0-t：25303.37327.7 ngh/ml；参比制剂aaaa的t1/2：3.6 0.9 h，cmax：3959.0 936.8ng/ml，tmax：3.3 0.9 h，auc0-t：25148.27264.4 ngh/ml。以auc0-t计算，与参比制剂相比受试制剂aaaa的平均相对生物利用度为102.0 % 16.8 %。主要药代动力学参数经对数转换后进行方差分析，并进一步采用双单侧t检验和1-2置信区间法进行生物等效性评价，其中tmax采用非参数检验法。结果表明，bbb制药有限公司研制的aaaa（受试制剂）的auc0-

4、t、auc0-和cmax均拒绝生物不等效假设。受试制剂中，aaaaauc0-t的90 %置信区间为参比制剂的94.2 107.5 %，auc0-的90 %置信区间为参比制剂的93.9 107.6 %，cmax的90 %置信区间为参比制剂的95.1 105.4 %，受试制剂和参比制剂间的tmax差异无统计学意义。根据以上结果，判定bbb制药有限公司提供的aaaa分散片100mg（受试制剂，规格：100mg片）与ccc有限责任公司生产的aaaa分散片100mg（参比制剂，规格：100mg片）具有生物等效性。2. 伦理学和有关指导原则赫尔辛基宣言（当前版本）国际协调会（ich）的gcp原则中华人民共

5、和国国家食品药品监督管理局（sfda）颁布的gcp原则中华人民共和国药品管理法本试验严格遵守赫尔辛基宣言的有关伦理准则，试验方案经独立伦理委员会（iec）审核批准。实验开始之前，研究人员向受试者说明试验药物的性质，试验的目的、方法、试验的风险和自愿参加的原则，并获得受试者的书面知情同意书。3. 缩写说明anova方差分析cmax 达峰浓度（最大血药浓度）tmax 达峰时间（达到最大血药浓度所需的时间）t1/2 消除半衰期auc血药浓度-时间曲线下面积auc0-t零时间到最终采血点的血药浓度-时间曲线下面积auc0-零时间到无限大时间的血药浓度-时间曲线下面积f相对生物利用度das 2.0数据统

6、计软件spss16.0数据统计软件rpm转/分qc质控样品sd标准差re相对偏差rsd相对标准差mean平均值4.引言aaaa，其化学名称n-(4-硝基-2-苯氧基)甲基磺酰胺分子式：c13h12n2o5s分子量：308.31结构式：aaaa(nimesulide，ni) 是一种非甾体抗炎药，可选择性抑制环氧合酶-2，具有很强的抗炎、解热和镇痛作用，并有抑制人中性粒细胞的突发性呼吸，消除炎症时体内过多的自由基等多种作用。临床上用于呼吸道炎症、风湿性和类风湿性关节炎、骨关节炎、手术后疼痛和水肿等的治疗。本品口服吸收迅速完全，健康志愿者口服aaaa片100mg后，平均血峰浓度2.864.58mg/

7、l，达峰时间1.223.83h之间，食物对其吸收速度均无明显影响，相对生物利用度为54%96%；口服吸收后，广泛与血浆蛋白结合，游离型药物仅占0.7%4.0%，主要分布在细胞外液，表观分布容积为0.190.39l/kg。由bbb制药有限公司生产的aaaa分散片（受试制剂），已经由国家食品药品监督管理局批准进行临床研究。该药与ccc有限责任公司生产的aaaa分散片（参比制剂）具有相同的给药途径和活性成分，按药品注册管理办法可进行人体相对生物利用度和生物等效性试验。5. 试验目的本试验采用随机交叉方法对20例健康成年男性志愿者，以市售aaaa分散片（ccc有限责任公司）为参比制剂，研究单剂量口服a

8、aaa分散片（bbb制药有限公司，受试制剂）相对生物利用度并对生物等效性进行评价（批件号：2009l00656）。6. 试验管理主要研究者接到辽宁中医药大学附属第二医院药理基地临床试验任务后，依据申办者提供的资料及查阅参考文献后，召开临床试验方案讨论会，与申办方共同撰写临床试验方案、病例报告表及知情同意书，经质量保证部门审查合格后提交伦理委员会审核，并在临床试验机构备案。经伦理委员会批准后，由主要研究者主持召开临床试验启动会，对参加本次试验的所有人员实施gcp培训，制订试验过程中的监查、实验室质量控制、统计/数据管理、严重不良事件的报告等相关的各种标准操作规程，对研究中可能发生的问题制订其处理

9、措施。临床试验机构根据试验药物的特性和要求，组织招募健康志愿者并进行体检，经体检合格后进行本研究。试验期间，有专门医师负责进行并记录试验前后受试者的体温、脉搏、呼吸和血压，对可能出现的危急情况备有急救措施，并负责危急情况时的急救。研究用药由该药理基地专人负责接收并对其进行编码和保管。研究用药的领取根据参加试验的受试者人数，由研究者在试验当天领取试验药物，保管人员详细记录并由研究者签名和注明日期。因试验人数的变动，研究者再领取或退还药物，应做详细的记录。7. 试验总体设计及方案本试验采用随机分组、双周期双交叉试验的设计方法。将招募的符合入选标准的20名健康男性志愿受试者随机分配至2组，每组10人

10、，按表1以相同剂量（100mg）进行给药，每位受试者均分别交叉口服受试制剂和参比制剂，进行交叉对照和自身对照。交叉服药前有一周清洗期。表1 给药方案表分组周期ab周期1tr周期2rtt：受试制剂 r：参比制剂8. 试验设计及参比药选择的依据参比制剂的选择符合药品注册管理办法附件二，并按照临床研究批件的要求选择。ccc有限责任公司生产的aaaa分散片，其与受试制剂具有相同的给药途径和活性成分，且在市场中已成主导产品，符合国家有关规定和要求1，故采用其作参比制剂。9. 受试者选择9.1 入选标准1. 健康志愿者，男性，年龄1840岁，且同一批受试者的年龄不宜相差10岁。2. 体重指数（bmi）在1

11、924bmi=体重kg/(身高m)2之间。3. 无心、肝、肺、肾、消化道、神经系统、精神异常及代谢异常等病史。4. 经体格检查血压、心电图、呼吸状况及肝、肾功能、血象均无异常者（或经临床医师判断无临床意义者）。5. 试验前2周内未服过任何其他药物。6. 3个月内无献血史。7. 试验前30天内未服过任何试验药物。8. 自愿签署知情同意书。 不符合上述条件之一者，不得作为受试者入选。9.2 排除标准1. 筛选时体格检查，实验室检查或心电图检查异常。2. 有肝病史或血清转氨酶超过正常范围者。3. 在过去的一年中，有酗酒史、嗜烟或药物滥用史者。4. 入选前3个月内，参加过另一药物试验者。5. 试验前2

12、周内服用过影响试验的其他药物。6. 任何对aaaa药物过敏者。9.3 剔除标准1. 一次药未用者；2. 无任何记录者；3. 采血时间错误；4. 用药剂量与方法错误；5. 采血后处理、保藏、运输方法失误；6. 使用了影响研究结果的其它药物。9.4 终止试验标准1. 在拟用的治疗剂量下，出现了严重不良反应（危及生命，或影响正常的一般性工作和生活），应终止全部试验；2. 在拟用的治疗剂量下，多数受试者出现中度不良反应，应终止全部试验。9.5 替换原则退出、脱落或被剔除的受试者可进行替换。当受试者退出、脱落或被剔除时，替换的受试者应采用与退出、脱落或被剔除、的受试者相同的试验过程。替换的受试者编号加“

13、100”，以便与其他受试者区别。9.6 入选及体检情况入选的20名健康男性志愿受试者在被告知所有与药物有关的可能不良反应后，签署知情同意书。受试者全面体格检查均正常（其中包括肾功能、肝功能、血常规及尿常规等体格检查指标）。详见表2-1 2-3。表2-1 受试者自然状况与试验分组安排一览表受试者编码受试者代码年龄（y）体重（kg）身高（cm）体重指数（bmi）试验周期121yuqi207317623.6tr2zsmi286516623.6rt3czhu196017519.6tr4sxyo237017323.4rt5huju256316224.0tr6mqfu286016821.3rt7buta2

14、06918719.7tr8cwlo246017220.3rt9cgya265616520.6tr10nthu196717621.6rt11gzji206017619.4tr12lxji195516819.5rt13yuya196517421.5tr14lxbi206017020.8rt15jdsh275516520.2tr16lxti196518020.1rt17doka216016522.0tr18lvni207517823.7rt19zhch226517521.2tr20wkyu246017220.3rt均值226317221.3sd3.25.66.11.6t：受试制剂 r：参比制剂表2-

15、2 受试者实验体格检测结果筛选号受试者编码.体温wbc109/lrbc1012/lhgbg/lplt109/laltg/lastg/lcrmol/lbunmol/l心电图尿常规备注12136.26.14.591411981916884.95正常正常入选1236.16.35.331662161030696正常正常入选2336.36.64.861401661325673.97正常正常入选5436.57.55.531622464021724.33正常正常入选10536.34.25.11591942329685.6正常正常入选3636.26.74.931512491119673.96正常正常入选673

16、6.45.24.81512471129534.27正常正常入选13836.26.54.811561962624664.33正常正常入选7936.46.15.31168198917644.43正常正常入选81036.36.04.83138271717654.02正常正常入选141136.54.45.481701772318845.32正常正常入选151236.04.95.351551711910706.85正常正常入选161336.06.74.861481692010825.08正常正常入选171436.27.15.171472801918655.26正常正常入选41536.38.95.1421

17、6157917653.93正常正常入选181636.37.24.771471761816663.07正常正常入选191736.16.55.191721222215734.71正常正常入选111836.07.94.931492494029683.35正常正常入选201936.27.05.081582204022764.51正常正常入选92036.14.45.151571963421555.17正常正常入选2136.25.74.681441505732863正常正常未入选表2-3 受试者体格检测结果(出组)受试者编码.体温wbc109/lrbc1012/lhgbg/lplt109/laltg/la

18、stg/lcrmol/lbunmol/l心电图尿常规136.76.14.51402001613783.96正常正常236.55.94.921551936134784.74正常正常336.54.24.731381381617714.35正常正常436.18.85.311572233333683.17正常正常536.24.45.081582285035804.37正常正常636.27.94.55141246920613.7正常正常736.17.55.01572612024633.99正常正常836.15.64.881591901710884.94正常正常936.76.65.111611811812

19、634.47正常正常1036.54.84.481302121612774.91正常正常1136.24.05.161631731334776.16正常正常1236.17.45.06146145913875.62正常正常1336.28.04.711461691912684.01正常正常1436.26.15.051462881612734.35正常正常1536.28.15.071552121718704.29正常正常1636.17.34.681441871514763.44正常正常1736.15.14.881631372111724.43正常正常1836.16.84.761431993924864.

20、56正常正常1936.17.94.751482413718714.7正常正常2036.15.05.11551863217714.38正常正常10. 试验药物受试制剂（t）：aaaa分散片，规格：100mg /片，批号：xxxxx，由bbb制药有限公司生产提供；参比制剂（r）：aaaa分散片，规格：100mg /片，批号：xxxxx，由ccc有限责任公司生产，bbb制药有限公司提供。11. 给药剂量及给药途径根据中国药典临床用药须知2005年版（化学药和生物制品卷）及有关生物等效性研究的文献资料2 5，确定给药剂量为单次口服100mg。服药前禁食过夜10h以上，试验日晨空腹口服受试制剂1片（10

21、0mg /片）或参比制剂1片（用250 ml温开水送服），并做记录。 12. 生物样本采集将符合入选标准的20名健康男性志愿受试者随机分成两组，每组10人。服药前禁食10h以上，试验日晨空腹口服受试制剂1片或参比制剂1片，用250 ml温开水送服并做记录。服药后2h可饮水，4h进统一清淡饮食。分别于给药前及给药后的0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，18.0，24.0 h取静脉血，每一阶段总计取13个点（每点取血5 ml）。置肝素抗凝试管中，所有受试者的血样收集后应，3000 rpm离心10 min，分离血浆，分离出的血浆样本置于已标记好的试管中在

22、- 20 以下的冰箱中储存待测。13. 生物样品分析方法的建立与确证13.1仪器、试药与试剂13.1.1仪器lc系统lc-10atvp输液泵日本岛津公司ms系统2010ev型单重四极杆质谱仪（esi源）日本岛津公司数据采集lc-ms solution 3.0日本岛津公司分析天平ab135-s分析天平mettler toledo公司振荡器xw-80a旋涡混合器上海医科大学仪器厂蒸发仪wm-2h型无油压缩机天津市医疗仪器二厂数据处理统计软件das2.0中国药理学会离心机sc-2546低速离心机科大创新股份有限公司hc-2516高速离心机科大创新股份有限公司超声仪kq5200b型超声波清洗器昆山市超

23、声仪器有限公司13.1.2试药与试剂aaaa对照品（批号：xxxxx）中国药品生物制品检定所内标对照品 （含量：99.8% 批号：xxxxx）中国药品生物制品检定所甲醇（色谱纯）国药集团化学试剂有限公司乙酸乙酯（分析纯）天津市大茂化学试剂厂二氯甲烷（分析纯）天津市大茂化学试剂厂重蒸水实验室自制空白血浆沈阳军区总医院13.2溶液的配制 13.2.1aaaa储备液及标准系列溶液的配制 称取aaaa对照品约5mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度约0.1 mg/ml的aaaa储备液。以甲醇-水（50: 50,v/v）稀释储备液，配制aaaa标准系列溶液，如表3所示

24、。表3 标准系列溶液的配制标准系列溶液稀释过程aaaa（g/ml）sd7储备液, 3.5 ml10 ml35.0qc3储备液, 3.0 ml10 ml30.0sd6储备液, 1.5 ml10 ml15.0sd5储备液, 0.5 ml10 ml5.0qc2储备液,1.25 ml50 ml2.5sd4qc2, 6 ml10 ml1.5sd3qc2, 2ml10 ml0.5qc1qc2, 1ml10 ml0.25sd2qc2, 0.8ml10 ml0.2sd1qc2, 0.4ml10 ml0.113.2.2内标溶液的配制 取内标对照品约10 mg，精密称定，置250 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻

25、度，摇匀，制成浓度约为40.0g/ml的内标溶液。各储备液、标准系列溶液及内标溶液均以相应体积、经过校正的量瓶配制，并于4 冰箱内保存备用。13.3 色谱/质谱条件13.3.1 色谱条件色谱柱：ods c18柱（150 4.6 mm , 5 m） 大连中汇达科学仪器有限公司预柱： ods c18保护柱（10 4.6 mm） 大连中汇达科学仪器有限公司流动相：甲醇-水（84:16，v/v）流速： 0.8 ml/min进样量：5 ml柱温： 3013.3.2 质谱条件esi源cdl温度： 200加热块温度： 200雾化气n2流速：1.5ml/min反吹气n2流速：0.2ml/min检测电压：1.5

26、kv 检测方式：负离子 扫描方式：选择离子监测m/z 307.00（aaaa）， m/z295.90（内标）13.4血浆样品预处理方法 取血浆样品100 l，加入甲醇20 l，内标溶液50 l，涡旋，加二氯甲烷-乙酸乙酯（4:1，v/v）2 ml，涡旋混合3 min，离心5 min（4000 rpm），分取有机相，于空气流下吹干，残渣用流动相定容至2ml，超声5 min，涡旋 3min，转移至ep管中，离心3 min（12000 rpm），取5l进行分析。13.5分析方法确证13.5.1专属性试验aaaa和内标（内标物）离子化后，主要生成m-h+准分子离子峰，分别为m/z307.00和m/z

27、295.90，将两者作为定量分析时的监测离子。全扫描图如图1所示。图1 aaaa（a）和内标（b）的全扫描质谱图精密量取6名受试者的空白血浆100 l，除不加内标溶液外，其余按“血浆样品预处理”项下操作，得色谱图2.1；将一定浓度的aaaa标准溶液和内标溶液加入空白血浆中，依同法操作，得色谱图2.2。aaaa的保留时间为3.1 min，内标内标的保留时间为2.0 min；取受试者5服用受试制剂2.5 h后的血浆样品100 l，依同法操作，得色谱图2.3。上述色谱图结果表明，aaaa的保留时间为3.1 min左右，内标内标的保留时间为2.0 min左右，血浆中内源性物质不干扰aaaa和内标物内标

28、的测定（为aaaa，为内标内标）。 图2.1 空白血浆样品色谱图图 图2.2 空白血浆样品加对照品色谱图图2.3 受试者5口服受试制剂2.5h的血浆样品色谱图 13.5.2标准曲线与线性范围取空白血浆100 l，分别加入aaaa系列标准溶液20 l，配制成相当于血浆中aaaa浓度为20.0，40.0, 100.0，300.0，1000.0，3000.0和7000.0 ng/ml的血浆样品，按“血浆样品预处理方法”项下同法试验，每一浓度进行双样本分析，制备aaaa的标准曲线。以待测物浓度（ng/ml）为横坐标x，待测物与内标物的峰面积比值（as/ai）为纵坐标y，用加权最小二乘法3（权重系数：1

29、/x2）进行线性回归运算，求得的线性回归方程即为标准曲线方程，用spss16.0软件计算三条标准曲线的差异。结果表明，aaaa在20.0 7000.0 ng/mll范围内线性关系良好。三天方法学确证的标准曲线结果见表4，方法学确证的典型曲线见图3。表4 标准曲线（方法确证）测 日线性血浆样品浓度（ng/ml）20.040.0100.0300.01000.03000.07000.0第一天y =6.865 10-4 x -8.12010-4r = 0.996719.542.495.3318.11117.82962.56363.020.239.597.4312.51095.62818.26260.4

30、第二天y = 6.845 10-4 x+1.17010-4r = 0.994522.037.893.9311.21124.52845.86206.219.636.496.4307.91115.83376.26258.9第三天y = 6.938 10-4 x +1.71310-3r = 0.994420.442.399.2318.61147.52804.96115.019.337.999.8323.91134.02766.96056.0mean20.239.497.0315.41122.52929.16209.9sd1.02.52.35.817.6228.9110.5日内rsd（%）5.5 5.

31、7 1.4 1.1 1.0 7.7 0.9 日间rsd（%）3.8 7.3 3.3 2.6 2.2 8.0 2.6 re（%）10.0-9.0-6.18.014.712.5-13.5y =6.865 10-4 x -8.12010-4r = 0.9967 图3 hplc-ms法测定血浆中aaaa的典型标准曲线（方法学确证第一天）13.5.3 定量下限取空白血浆100 l，加入aaaa标准溶液（100.0 ng/ml）20 l，配制成血浆中aaaa浓度为20.0 ng/ml的血浆样品（5样本），按“血浆样品预处理方法”项下同法试验，并根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度。结果表明，本试验所建立的

32、hplc-ms法测定血浆中aaaa的定量下限可达20.0 ng/ml。详见表5。表5 aaaa的定量下限血浆样品浓度（ng/ml）re%rsd%lloq117.9-10.48.2lloq220.73.6lloq319.3-3.4lloq421.99.4lloq521.68.213.5.4方法准确度与精密度取空白血浆100 l，分别加入不同浓度的aaaa标准溶液20 l，配制成相当于血浆中aaaa浓度为50.0、500.0和6000.0 ng/ml的血浆样品（每浓度5样本），按“血浆样品预处理方法”项下同法试验，并根据当日标准曲线计算血浆样品的浓度，用spss16.0软件，求得方法的准确度与精密

33、度。结果表明，本试验所建立的hplc-ms法测定的日内和日间精密度的rsd%达到试验要求1。详见表6。表6 aaaa准确度与精密度run血浆样品浓度（ng/ml）50.0500.06000.0153.4468.36293.648.0501.85928.253.8483.75759.646.5507.46221.154.7511.46545.8252.7504.16262.043.9508.76322.853.1523.26644.947.8491.25844.048.5490.35828.3353.0465.36238.446.1460.15505.947.1521.36189.953.452

34、6.05761.746.6511.36192.7样品数151515mean49.9498.36102.6sd3.621.2317.5re（%）-12.3-8.010.7日内rsd（%）7.5 4.5 5.4 日间rsd（%）5.3 2.1 4.0 13.5.5 重复进样考察本试验考察了在相同试验条件下重复进样的准确度和精密度。按“方法准确度与精密度”项下的方法配制低、中、高三浓度的qc样品（各1个样本），每个样品重复进样5次，计算血浆样品的浓度，求得重复进样的准确度和精密度。结果表明，本试验所建立的hplc-ms法重复进样的准确度和精密度达到试验要求。详见表7。表7 重复进样考察结果血浆样品浓

35、度（ng/ml）50.0500.06000.048.1 489.4 5451.4 47.8 488.1 5463.1 49.7 494.1 5453.0 47.3 493.1 5473.2 47.4 487.0 5485.2 样品数555mean48.1 490.3 5465.2 sd1.0 3.1 14.2 re（%）-5.4-2.6-9.1rsd（%）2.0 0.6 0.3 13.5.6 残留考察取空白血浆100 l，除不加内标溶液外，其余按“血浆样品预处理”项下操作，制得空白血浆样品（6样本分析）；另取空白血浆100 l，加入aaaa标准溶液（35000.0 ng/ml）20 l，配制成

36、血浆中aaaa浓度为7000.0 ng/ml的血浆样品（4样本分析），按“血浆样品预处理方法”项下操作，于方法学确证第一天将含药血浆样品（浓度7000.0 ng/ml，6样本，其中两样本为标准曲线sd7）和空白血浆样品（6样本）交替进样。结果表明，本试验所建立的hplc-ms法aaaa和内标（内标）均无残留。13.5.7 提取回收率取空白血浆100 l，按“血浆样品预处理”项下的方法配制低、中、高三个浓度（aaaa浓度分别为50.0，500.0，6000.0 ng/ml）的样品，每一浓度进行5样本分析；同时另取空白血浆100 l，除不加aaaa标准溶液和内标溶液外，按“血浆样品处理”项下操作，

37、向获得的有机相中加入相应浓度的aaaa标准溶液20 l和内标溶液50 l，涡旋混合，空气流下吹干，以2ml流动相溶解后进样分析，获得相应峰面积（5次测定的平均值）。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。结果表明，aaaa血浆样品的提取回收率符合有关规定1，内标回收率稳定。详见表8。表8 血浆样品中aaaa和内标物（内标）的提取回收率回收率（%）aaaa的血浆浓度(ng/ml)内标血浆浓度（ng/ml）50.0500.06000.040000.082.289.482.175.080.286.584.187.989.696.996.181.189.283.183.789.888.781

38、.284.488.0样品数5555mean（%）86.087.486.184.4sd（%）4.46.25.76.2rsd（%）5.27.06.67.313.5.8基质效应本试验考察了在相同试验条件下的基质效应。取空白血浆100 l，除不加aaaa标准溶液和内标溶液外，按“血浆样品处理”项下操作，向获得的有机相中加入低、中、高三种浓度的aaaa标准溶液20 l和内标溶液50 l，涡旋混合，空气流下吹干，以2ml流动相溶解后进样分析，获得相应峰面积，每一浓度进行5样本分析；同时另取相应浓度的aaaa标准溶液20 l和内标溶液50 l，涡旋混合，空气流下吹干，以2ml流动相溶解后进样分析，获得相应峰

39、面积（5次测定的平均值）。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算基质效应。结果表明，aaaa（低、中、高浓度）和内标内标基质效应考察结果均在85%-115%之间，aaaa和内标内标在上述试验条件下均无基质效应。详见表9。表9 基质效应考察结果基质效应（%）aaaa的血浆浓度(ng/ml)内标血浆浓度（ng/ml）50.0500.06000.040000.0104.1108.9102.4106.3135.7103.092.9111.6118.5105.8102.282.7107.9140.295.2111.5114.7103.697.0113.4样品数5555mean（%）114.7112.39

40、7.9105.1sd（%）12.915.84.212.8rsd（%）11.314.14.312.213.5.9 稳定性试验 本试验考察了血浆样品预处理前室温放置24h的稳定性、样品处理后在自动进样器中（4）放置6h的稳定性、血浆样品经历三次冷冻-解冻循环的稳定性、血浆样品于冰箱-20保存45天的长期稳定性及储备液的稳定性，以试验样品的测得值与理论值比较所得结果考察样品的稳定性。取空白血浆100 l，分别加入不同浓度的aaaa标准溶液20 l，配制成血浆中aaaa浓度为50.0 ,500.0和6000.0 ng/ml的血浆样品（每浓度5样本），在室温下放置24h后，按“血浆样品处理方法”项下同法

41、试验。结果表明，aaaa血浆样品室温放置24h稳定。详见表10-1。取空白血浆100 l，分别加入不同浓度的aaaa标准溶液20 l，配制成相当于血浆中aaaa浓度为50.0 , 500.0和6000.0 ng/ml的血浆样品（每浓度5样本），按“血浆样品预处理方法”项下同法试验，在自动进样器中（4）放置6h后测定。结果表明，aaaa血浆样品预处理后在进样器中（4）放置6h稳定。详见表10-2。表10-1aaaa血浆样品室温放置24h稳定性考察结果aaaa的血浆浓度(ng/ml)50.0500.06000.045.2488.66263.751.5480.06195.243.6468.95883

42、.347.8466.05880.344.3499.35845.3样品数555mean46.5480.66013.6re（%）-12.8-6.84.4rsd（%）6.92.93.3表10-2 aaaa血浆样品预处理后在自动进样器中（4）放置6h的稳定性aaaa的血浆浓度(ng/ml)50.0500.06000.053.0454.15428.746.5494.95473.050.3461.65922.755.7461.96257.554.6455.76266.5样品数555mean52.0465.65869.7re（%）11.5-9.2-9.5rsd（%）7.13.66.9取空白血浆100 l，分

43、别加入不同浓度的aaaa标准溶液20 l，配制成相当于血浆中aaaa浓度为50.0 , 500.0和6000 .0ng/ml的血浆样品（每浓度5样本），在- 20 下冷冻24h，然后在室温自然解冻。完全解冻后，放回-20 下冷冻不少于12h。第二次在室温自然解冻，再放回-20 下冷冻不少于12h，第三次在室温自然解冻后，按“血浆样品处理方法”项下同法试验。结果表明，aaaa血浆样品经过三次冷冻-解冻循环后稳定。详见表10-3。表10-3 aaaa血浆样品经过三次冷冻-解冻循环后的稳定性aaaa的血浆浓度(ng/ml)50.0500.06000.043.4453.76281.244.8470.2

44、5484.143.6468.05501.843.9475.15742.348.0468.76364.1样品数555mean44.8467.15874.7re（%）-13.2-9.3-8.6rsd（%）4.21.77.2取空白血浆100 l，分别加入不同浓度的aaaa标准溶液20 l，配制成血浆中aaaa浓度为50.0 , 500.0和6000.0 ng/ml的血浆样品（每浓度5样本），于冰箱-20保存，45天后按“血浆样品处理方法”项下同法试验。结果表明，于冰箱-20保存的aaaa血浆样品在45天内稳定。详见表10-4。表10-4 aaaa血浆样品-20保存长期稳定性考察结果aaaa的血浆浓度

45、(ng/ml)50.0500.06000.045.5514.65938.156.9520.55746.548.6505.25694.649.3523.75744.856.9483.96159.5样品数555mean51.4509.65856.7re（%）13.84.7-5.1rsd（%）10.13.13.3分别于方法学验证前十天和方法学第一天考察aaaa与内标溶液4 保存的稳定性。于方法学验证前十天称取aaaa对照品约5mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成浓度约0.1 mg/ml的aaaa储备液；精密量取0.5ml储备液，置50 ml量瓶中，以甲醇-水（50:

46、50,v/v）稀释至刻度，摇匀，制得浓度约为1.0g/ml的aaaa储备液；以甲醇-水（50:50,v/v）稀释储备液，配制供储备液稳定性分析的aaaa标准系列溶液及样品1，配制过程如下所示：表10-5 aaaa标准系列溶液配制（供储备液稳定性分析）标准系列溶液稀释过程aaaa（ng/ml）sd5储备液， 0.5ml10ml50.0sd4储备液, 0.4ml10 ml40.0sd3（样品1） 储备液， 0.3ml10 ml30.0sd2储备液, 0.2ml10 ml20.0sd1储备液， 0.1ml10 ml10.0将上述标准系列溶液分别进样，制备供储备液稳定性分析的aaaa标准曲线(1)，方程如下：y=2.972103x+4.383103 (1)测定样品1的峰面积，并根据标准曲线(1)计算样品1的浓度，结果见表10-7；称取内标对照品约5 mg，精密称定, 置250 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度约20.0g/ml的内标（内标）储备液；以甲醇-水（50:50,v/v）稀释储备液，配制供储备液稳定性分析的内标（内标）标准系列溶液及样品2，配制过程如下所示：表10-6 内标（内标）标准系列溶液配制（供储备液稳定性分析）标准系列溶液稀释过程内标（ng/ml）sd5储备液， 1.0ml10ml2000.0sd4储备液, 0.8