第二章基因工程及其在食品科学中的应用

1、制备目的基因制备目的基因构建重组构建重组dna 获得转化体获得转化体 筛选出重组转化体阳性克隆筛选出重组转化体阳性克隆 筛目的基因在受体生物筛目的基因在受体生物细胞中高效表达隆细胞中高效表达隆 指一类能够识别和切割双链dna分子内核苷酸序列的内切核酸酶是指一类能够识别dna特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶 其命名主要是参照其命名主要是参照hosmith和和d. nathans提出的待命名提出的待命名酶的供体微生物的属名酶的供体微生物的属名与与种名种名相结合的原则进行的，具体如下：相结合的原则进行的，具体如下： 以属名的第一个字母(大写)和种名的最前两个字母(小写)

2、组成的三字母符号为其基本形式 如：如：来源于大肠杆菌(escherichia coli)的酶用eco表示；来源于流感嗜血菌(haemophilus influenzae)的用hin表示 当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时，则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一个字母(小写)代替上述三字母符号中的最后一个字母 如：如：来自haemophilus parainfluenzae (副流感嗜血杆菌)的用hpa表示，而来自同一属的haemophilus parahaemolyticus (副溶血嗜血杆菌)的则用hph表示。大鼠生长激素基因大鼠生长激素基因转入小鼠转入小鼠(2

3、) 限制酶的分类限制酶的分类 根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型: i型型: 三种三种不同亚基组成；辅助因子为不同亚基组成；辅助因子为atp、mg2+及及s-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸 其切割位点距其识别位点至少1000bp；且切割作用是切割作用是随机的随机的 型型: 两个两个相同亚基组成；辅助因子仅为相同亚基组成；辅助因子仅为mg2+；其识别位点常具；其识别位点常具旋转旋转 对称性对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近附近；且切割作；且切割作 用用特异性强特异性强 型型: 两种两种不同亚基组成；辅助因子为不同亚基组成

4、；辅助因子为atp和和mg2+，也受，也受s-腺苷甲硫腺苷甲硫 氨酸激活氨酸激活，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点3端端 2426bp处处 psti 5-c tgca g-3 3-g acgt c-5 hpai 5-gtt aac-3 3-caa ttg-5 限制性内切酶的旋转对称性限制性内切酶的旋转对称性 需要指出的是需要指出的是，i型和型限制性内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而对型限制性内切核酸酶而言，其只具限制酶活性，与其相应的dna甲基化酶才具甲基化酶活性。型限制性内切核酸酶及其相应的dna甲基化酶对dna有相同的识别序列。

5、(3)型限制性内切核酸酶的基本特性型限制性内切核酸酶的基本特性 识别序列与切割位点识别序列与切割位点 型限制性内切核酸酶可识别长度为型限制性内切核酸酶可识别长度为47bp的双链的双链dna特定序特定序列，该识别序列列，该识别序列(识别位点识别位点)常呈常呈旋转对称性旋转对称性 切割方式切割方式 平齐末端平齐末端 、5磷酸端磷酸端25个核苷酸突出单链黏性末端个核苷酸突出单链黏性末端 、3-羟基端羟基端25个核苷酸突出单链黏性末端个核苷酸突出单链黏性末端 5 3 3 5 5 3 3 5 5 突出突出3 突出突出 平端平端5 3 3 5 型限制性内切核酸酶切割方式型限制性内切核酸酶切割方式 同裂酶与

6、同尾酶同裂酶与同尾酶isoschizomer ：在型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均相同者 如：如：hpa和msp i两者的识别序列都是ccgg，切割方式也相同，因此二者为同裂酶 isocaudamer ：来源及识别序列不同，但dna经其切割后能形成相同黏性末端者 如：如：bamh i、bcl i、bgl、mbo i、sau3a i及xho切割dna后都形成相同的gatc四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶 需要指出的是需要指出的是，由同尾酶同尾酶切割dna所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。经限制性内切核酸酶切割后

7、产生的dna片段一般不同限制酶切割dna后所形成的限制性片段长度不一 假设在某dna分子中，a或t出现的频率为x，g或c出现的频率为y，那么某限制酶在该dna分子上的切割位点出现频率(切割频率或位点频率) f可用下式表示： f=xnym 式中：n该限制酶识别序列中双链a=t碱基对的数目；m该限制酶识别序列中双链g=c碱基对的数目 如果构成某dna分子的碱基对总数目(b)及某限制酶识别位点核苷酸序列均为已知，那么该限制酶在该dna分子上的理论切割位点数目(n)为： n=bf 假定在某dna分子中四种核苷酸残基数量相等，那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该dna分子中切割位点出现频率为(14)4，

8、即1256，也即平均256个碱基对出现1个切割位点。 同样，识别序列为六个碱基对的限制酶在该dna分子中切割位点出现频率为(14)6，即14096，也即平均4096个碱基对出现1个切割位点。 需要指出的是：需要指出的是：实际情况与理论不相符 (4) 影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略 底物底物dna制备物的纯度制备物的纯度：蛋白质、sds、edta、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。 底物底物dna的甲基化程度：的甲基化程度：大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种dna甲基化酶：a、dam甲基化酶；b、dcm甲基化酶。 底

9、物底物dna的结构构型：的结构构型：环状双螺旋dna较线性dna稳定。因此，在用限制性酶酶解同样分子量的dna时，环状双螺旋dna所需酶量为线性dna的1020倍。 酶反应缓冲液的组成：酶反应缓冲液的组成： 酶反应的最适温度：酶反应的最适温度： 为了提高限制酶对底物为了提高限制酶对底物dna低纯度制备物的反应效率，一般低纯度制备物的反应效率，一般采用如下方法采用如下方法：a 增加限制酶的用量(平均每g底物dna可用10iu甚至更多些)；b 延长酶催化反应的保温时间，使酶解更完全；c 扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被稀释，以减弱其抑制作用；d 在反应液中加入适量亚精胺(一般应用浓度为12.5mmoll)，以利限制酶对基因组dna的酶解作用。(5) 限制性内切核酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点限制性内切核酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点 (二二) dna聚合酶聚合酶 最常用的依赖于最常用的依赖于dna的的dna聚合酶聚合酶有有大肠杆菌大肠杆菌dna聚合酶聚合酶i(全酶全酶)、大肠杆菌大肠杆菌dna聚合酶聚合酶i大片段大片段(klenow片段片段)、t4噬菌体编噬菌体编码的码的dna聚合酶聚合酶、耐热的耐热的dna聚合酶聚合酶(