毕业论文盘龙参中黄酮类物质的提取及工艺优化

1、吉林工商学院毕业论文 盘龙参中黄酮类物质的提取及工艺优化 学生姓名 所在系部 食品工程分院 专业名称 食品营养与检测 所在班级 08306班 学生学号 指导教师 二 一一年 五 月盘龙参中黄酮类物质的提取及工艺优化内 容 摘 要 对盘龙参中的黄酮类物质进行鉴定，采用单因素试验找出相对合理的提取工艺。方法 采用索氏提取法去除盘龙参中的色素，再采用乙醇提取法提取盘龙参中的总黄酮，在进浓缩提纯，计算其回收率。结果 黄酮类化合物的提取最佳工艺条件是：乙醇浓度70%、料液比120、提取时间1 h。关键词: 盘龙参；黄酮类化合物；索氏提取法；工艺优化 目 录一 、概述1 1.1 黄酮类化合物的结构.21.

2、2 黄酮类物质的生理学功效.21.3.1 溶剂提取法.31.3.2 微波提取法.3 1.3.3 超声波提取法.41.3.4 酶解法.41.3.5 超临界流体萃取法.51.3.6 双水相萃取分离法.51.3.7 半仿生提取法.61.4 黄酮类物质的应用.61.5 本实验的目的和意义.72 实验材料与方法.72.1实验试剂.82.2试验设备.82.3试剂的配制.92.4黄酮类化合物标准曲线的制备.92.5盘龙参中总黄酮的提取.102.6盘龙参中黄酮类物质的提纯.102.7黄酮类物质含量测定.112.8盘龙参中黄酮类物质提取的工艺优化.112.9盘龙参中黄酮类物质的鉴定.12三、参考文献.13 盘龙

3、参中黄酮类物质的提取及工艺优化一. 概述盘龙参，别名绶草，陆生植物，高15-50cm。茎直立，基部簇生数条粗厚、肉质的根，近基部生2-4枚叶。叶条状倒披针形或条形，长10-20cm，宽4-10mm。花序顶生，长10-20cm，具多数密生的小花，似穗状；花白色或淡红色，螺旋状排列；花苞片卵形，长渐尖；中萼片条形，先端钝，长约5mm，宽约1.3mm，侧萼片等长，较狭；花瓣和中萼片等长但较薄，先端极钝，唇瓣近长圆形，长4-5mm，宽约2.5mm，先端极钝，伸展，基部至中部边缘全缘，中部以上呈强烈的皱波状啮齿，在中部以上的表面具皱波状长硬毛，基部稍凹陷，呈浅囊状，囊内具2枚突起。黄酮类化合物广泛存在于

4、生物体内，具有多方面的生理活性，是许多中草药的有效成分之一, 具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保护心血管、免疫调节、保肝等等多种功能,在食品和医药工业中有着广阔的应用前景。对黄酮类化合物的研究也引起了国内外学者的广泛重视。1.1 黄酮类化合物的结构 黄酮类化合物以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物 ，也即以c6-c3-c6为基本碳架的一系列化合物。 1.2 黄酮类物质的生理学功效黄酮类化合物广泛存在于植物中，实际上存在于植物的所有部分，包括根、心材、树皮、叶、果实和花中，光合作用中约有2%的碳源被转化成类黄酮。早在3

5、0年代人们就发现了黄酮类化合物具有维生素c样的活性，曾一度被视为是维生素p。至今法国与俄罗斯仍继续将黄酮类化合物视为维生素p。pratt等人研究了黄酮类化合物的抗氧化性质，认为黄酮是作为一级抗氧化剂而起作用的，它们具有显著的抗氧化性。黄酮抗油脂过氧化的作用早在60年代就已经被证实了。80年代以来，对黄酮类化合物质的研究逐渐转向其清除自由基的能力、抗衰老，及老年人疾病的治疗上。黄酮类化合物的生理功能可概括为：调节毛细血管的脆性与渗透性。是一种有效的自由基清除剂，其作用仅次于维生素e。具有金属螯合的能力，可影响酶与膜的活性。对维生素c有增效作用，似乎有稳定人体组织内维生素c的作用。具有抑制细菌和抗

6、生素的作用，这种作用使普通食物抵抗传染病的能力相当高。在两方面表现有抗癌作用，一方面是对恶性细胞的抑制（即停止或抑制细胞的增长），另一方面是从生化方面保护细胞免受致癌物的损害。1.3 黄酮类物质的提取1.3.1 溶剂提取法水提法热水仅限于提取甙类,例如自槐花米中提取芦丁。由于热水浸提时易溶于水的杂质(如蛋白质、鞣质、淀粉、多糖类化合物等)较多,后处理较复杂,提取效率也不高,故不常使用。有机溶剂提取法黄酮类化合物的提取,主要是根据被提取物的性质及伴随的杂质来选择适合的提取溶剂,甙类和极性较大的甙元,一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取。大多的甙元宜用极性较小的溶

7、剂,如乙醚、氯仿、乙酸乙酯等来提取,多甲氧基黄酮类甙元,甚至可用苯来提取。乙醇和甲醇是最常用的黄酮类化合物提取溶剂,高浓度的醇(如90% 95% )宜于提取甙元,60%左右浓度的乙醇或甲醇水溶液适宜于提取甙类物质。如采用70%乙醇提取芦笋中芦丁,浸提5h,条件为最优。提取过程中常用冷浸法或回流法,提取次数一般为2-4次。两种方法各有优缺点前者无需加热,有利于保持提取物的成分,但提取时间长,效率低，后者效率高,但需加热,因此成分不稳定的原料(如一些中药药材)不宜用此法。一般来说,醇提法的对总黄酮的提取效果要好于水提法。碱溶酸沉法由于黄酮类成分大多具有酚轻基,具有易溶于碱性水而难溶于酸性水的性质,

8、可用碱性水(如碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液)或碱性稀醇(如50%乙醇)浸出,在提取液中,加酸酸化,黄酮类化合物即可沉淀析出。用碱性溶剂提取时，所用的碱浓度不宜过高,以免在强碱下加热时破坏黄酮类化合物母核,当有邻二酚轻基时,应加硼酸保护。常用饱和石灰水溶液、稀氢氧化钠溶液或5%碳酸钠水溶液提取。氢氧化钠水溶液的浸出能力高,但杂质较多不利于纯化；石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质沉淀成钙盐沉淀,有利于浸液纯化,但是浸出效果不如氢氧化钠水溶液效果好,同时有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质,不被溶出。例如从菊花中提取黄酮类物质时,用ph=10 的氢氧化钠溶液浸出效果较好；从槐米中提取芦丁,则应用

9、碱性较强的饱和石灰水作溶剂,这样则有利于芦丁成盐溶解；选用硼砂缓冲饱和石灰水的碱性可保护芦丁的黄酮母核不受破坏,用亚硫酸氢钠为抗氧剂可保护芦丁的邻二酚羟基。碱溶酸沉法在实际生产中应用较广泛,具有经济安全方便等优点。1.3.2 微波提取法微波是一种非电离的电磁辐射, 被辐射物质的极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列,从而产生撕裂和相互摩擦引起发热,同时可以保证能量的快速传递和充分利用。微波提取技术的研究表明,微波技术应用与天然产物的提取具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分得率高的特点。浸出过程中材料细粉不凝聚、不糊化,克服了热水提取法易凝聚、易糊化的缺点。1.3.3 超声波提取法超

10、声波提取黄酮类物质,是目前比较新的方法。超声提取原理是利用超声波在液体中产生“空穴作用”,破坏植物细胞和细胞膜结构,从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力,有助于黄酮类化合物的释放与溶出；超声波使提取液不断震荡,有助于溶质扩散,同时超声波的热效应使水温基本在57,对原料有水浴作用,缩短了提取时间,提高了有效成分的提出率和原料的利用率。超声波提取操作简便快捷、无需加热、提出率高、速度快、提取物的结构未被破坏、效果好,显示出明显的优势。1.3.4 酶解法对于一些黄酮类化合物被细胞壁包围不易提取的原料,传统的热水、碱、有机溶剂提取法,受细胞壁主要成分纤维素的阻碍,往往提取效率较低。恰当地利用酶处理这

11、些植物材料, 可改变细胞壁的通透性,提高有效成分的提取率。根据传质理论,溶剂向固体表面扩散,渗透固体表面,进入固体内部及固体内部微孔隙内,溶解黄酮类化合物,通过固体微孔隙向固体表面扩散,在表面与溶剂主体间,由于浓度差作用力,黄酮类化合物向溶剂主体扩散,完成提取传质过程。采用酶解法却能使细胞壁疏松、破裂,减小传质阻力,从而提高提取效率。1.3.5 超临界流体萃取法超临界流体萃取( sfe) 它具有传质速度快、溶解能力强、低温操作、节能等优点, 引起国内外有关专家及学者的普遍关注,特别是用该技术提取天然产物有效成分成为人们研究的热点。超临界流体有近液体的溶解力,有气体那样向固体和高粘度物质较强的渗

12、透性。且超临界流体的密度当温度或压力有微小变化时,它能有较大的变化,这样超临界流体提取,就是依据它的这个特性,利用密度的变化对物质溶解力的差异,实现分离混合物的。一般多采用co2为超临界溶剂,co2具有性质稳定、无毒、且不燃不爆、临界压力不高、操作温度低、价廉易得等特点。超临界co2是非极性溶剂,对非极性和分子量很低的极性物质表现出很好的溶解性,但对极性较强的物质溶解能力不足,虽然增大密度能使其溶解能力提高,但增大密度需提高萃取压力,这将使萃取设备的费用显著增加, 不适于大规模生产。1.3.6 双水相萃取分离法双水相体系是由两种水溶性高分子化合物或一种高分子化合物与一种盐类在水中所形成的互不相

13、溶的两相体系,由于被分离物在两相中分配不同, 便可实现分离。与传统的油- 水溶剂萃取体系相比,排除了使用有毒、易燃的有机溶剂,能够提供温和的水环境, 避免了被萃成分的脱水变性,目前一般用于生物物质如蛋白质类的分离研究,在植物黄酮提取方面的研究还比较少。如采用双水相萃取法对银杏叶浸出液中黄酮类化合物进行萃取,具有萃取温度低,时间短,且分相速度快,萃取效率可达98% ,高于溶剂萃取的萃取率。估计在未来,双水相萃取分离法将为黄酮类化合物的提取分离提供一种新型有效方法。1.3.7 半仿生提取法半仿生提取法是近几年提出的新方法。它是从生物药剂学的角度,将整体药物研究法与分子药物研究法相结合,模拟口服药物

14、经胃肠道转运吸收的环境,采用活性指导下的导向分离方法,具有有效成分损失少、成本低、生产周期短的特点。在操作中,根据仿生学原理,人体胃、小肠、大肠的体液酸度最佳ph 分别为2.10,7.15,8.13,先将原料用一定ph的酸水提取,继以一定ph的碱水提取,提取液分别过滤、浓缩。1.4 黄酮类物质的应用黄酮类化合物中含有消炎、抑制异常的毛细血管通透性增加及阻力下降、扩张冠状动脉、增加冠脉流量、影响血压、改变体内酶活性、改善微循环、解痉、抑菌、抗肝炎病毒、抗肿瘤等具有重要生物活性的化合物，有很高的药用价值。中草药含黄酮类化合物的很多，已经证明类黄酮是许多中草药的有效成分。例如满山红中的杜鹃素、小叶枇

15、杷中的小叶枇杷素、矮地茶中的槲皮苷、铁包金中的芦丁、白毛夏枯草和青兰中的木犀草素、红管药中的槲皮素、葛根中的黄豆苷与葛根素、毛冬青与银杏叶中的黄酮醇苷、黄芩中的抗菌成分黄芩素和解热有效成分黄芩苷等。此外，还有很多中草药富含黄酮类成分，如槐米、陈皮、射干、红花、甘草、蒲黄、枳实、芫花、金银花、菊花、山楂、淫羊藿、桎木和地锦等。除了药用价值外，其中的部分黄酮类化合物（特别是来源自药食两用的中草药）显然可应用在功能性食品。1.5 本实验的目的和意义黄酮类化合物广泛存在于生物体内，具有多方面的生理活性，是许多中草药的有效成分之一,具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、保护心血管、免疫调节

16、、保肝等等多种功能,在食品和医药工业中有着广阔的应用前景，对黄酮类化合物的研究也引起了国内外学者的广泛重视。2 实验材料与方法2.1实验试剂名称 纯度 厂商无水乙醇 （2500 ml，分析纯） (安徽安特生物化学有限公司)芦丁标准品 （1 g，生化试剂） （国药集团化学试剂有限公司）石油醚 （500 ml，分析纯） （ 天津市光复科技发展有限公司）乙酸乙酯 （500 ml，分析纯） （天津市富宇精细化工有限公司）亚硝酸钠 （500 g，分析纯） （天津市大茂化学试剂厂）硝酸铝 （500 g，分析纯） （天津市光复精细化工研究所）氢氧化钠 （500 g，分析纯） （天津市科密欧化学试剂公司）氯仿

17、 （500 ml，分析纯） （湖南汇虹试剂有限公司）甲醇 （500 ml，分析纯） (汕头市面陇化工厂有限公司)薄层层析硅胶 （500 g，化学纯） (青岛海浪硅胶干燥剂厂)羧甲基纤维素钠 （500 g，分析纯） （天津市科密欧化学试剂开发中心）2.2试验设备名称 厂商re-52旋转蒸发仪 巩义市英峪予华仪器厂shz-d真空泵 巩义市英峪予华仪器厂al-104电子分析天平 梅特勒托利多仪器（上海）有限公司gzx-9100me恒温干燥箱 上海博远实业有限公司医疗设备厂wfz.uv-2100型可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司超纯水仪 广大力德高端水处理设备kq-c玻璃仪器气流烘干机 巩义

18、市英峪予华仪器厂2.3试剂的配制芦丁标准品的配制：10 mg芦丁标准品（芸香叶苷，三水）加入几滴乙醇溶解，加入60%乙醇定容至100 ml，摇匀，即得标准品。5%亚硝酸溶液：精密称取10.00 g亚硝酸钠，溶解，定容至200 ml，即得。10%硝酸铝溶液：精密称取35.21 g九水硝酸铝，溶解，定容至200 ml，即得。4%氢氧化钠溶液：精密称取8 g氢氧化钠，溶解，定容至200 ml，即得。1%alcl3乙醇溶液：精密称取2 g氯化铝，定容至200 ml，即得。展开剂的配制：分别精密量取氯仿，甲醇，水，65 ml，45 ml，12 ml，混合即得。70%乙醇：精确量取700 ml无水乙醇，定

19、容至1000 ml。60%乙醇：精确量取600 ml无水乙醇，定容至1000 ml。2.4黄酮类化合物标准曲线的制备由于芦丁和黄酮类化合物均是以2-苯基色原酮为母核结构，具有相同的吸光度测试性质，故用芦丁制作标准曲线。精密称取芦丁对照品5 mg置于50 ml容量瓶中，加入几滴无水乙醇使其溶解，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得标准溶液。精密量取上述标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置于10ml容量瓶中，加入蒸馏水使成5 ml，精密加5%亚硝酸溶液0.3 ml，摇匀，放置5 min，再加10%硝酸铝溶液0.3 ml，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠试液2 ml，各

20、用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置10 min，以第一管为空白，在510 nm处测定光密度值。2.5盘龙参中总黄酮的提取取5 g粉碎好的经索氏提取去除色素的盘龙参于50 ml圆底烧瓶中，加入50 ml70%无水乙醇回流1.5 h，提取23次，合并提取液。2.6盘龙参中黄酮类物质的提纯将回流液浓缩至30 ml左右，加入几滴稀盐酸进行酸化，摇匀。放置5 min，加入等体积的乙酸乙酯进行混合，萃取23次，合并萃取液。浓缩（精提液），即得黄酮类粗提物，平行三次。2.7黄酮类物质含量测定2.7.1粗提物中黄酮的含量测定样品液5 ml于50 ml烧杯中，加入25 ml蒸馏水稀释，再加5%亚硝酸溶液1.5 ml

21、，摇匀，放置5 min，再加10%硝酸铝溶液1.5 ml，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠试液10 ml，放置10 min，定容，测定吸光度。2.7.2浓缩液中黄酮的含量测定将浓缩液定容至25 ml,取浓缩液1 ml于50 ml烧杯中，加入25 ml蒸馏水稀释，再加5%亚硝酸溶液1.5 ml，摇匀，放置5 min，再加10%硝酸铝溶液1.5 ml，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠试液10 ml，放置10 min，定容测定吸光度。2.8盘龙参中黄酮类物质提取的工艺优化2.8.1乙醇浓度对提取率的影响 称取5.0 g粉碎过筛好的经索氏提取去除色素的盘龙参3份，分别置于50 ml圆底烧瓶中，

22、分别编号a、b、c。分别加入125 ml70%、75%、80%无水乙醇回流1.5 h提取，得粗提液，使其体积为125 ml，量取5 ml，定容置25 ml，测定其吸光度。将回流液浓缩至50 ml左右，加入几滴稀盐酸进行酸化，摇匀。放置5 min，加入等体积的乙酸乙酯进行混合，萃取23次，合并萃取液。浓缩，定容至25 ml，量取1 ml，定容至25 ml，测定其吸光度，平行三次。2.8.2盘龙参的质量与乙醇的体积的比值（料液比）对提取率的影响称取5.0 g粉碎过筛好的经索氏提取去除色素的盘龙参3份，分别置于50 ml圆底烧瓶中，分别编号a、b、c。分别加入75 ml、100 ml 、125 ml

23、65%无水乙醇回流1 h提取，得粗提液，使其体积为75 ml、100 ml 、125 ml，分别量取5 ml，定容置25 ml，测定其吸光度。将回流液浓缩至50 ml左右，加入几滴稀盐酸进行酸化，摇匀。放置5 min，加入等体积的乙酸乙酯进行混合，萃取23次，合并萃取液。浓缩，定容至25 ml，量取1 ml，定容至25 ml，测定其吸光度，平行三次。2.8.3提取时间对提取率的影响称取5.0 g粉碎过筛好的经索氏提取去除色素的盘龙参3份，分别置于50 ml圆底烧瓶中，分别编号a、b、c。分别加入100 ml70%无水乙醇回流1h、1.5 h、2.0 h提取，得粗提液，使其体积为100 ml，量

24、取5 ml，定容置25 ml，测定其吸光度。将回流液浓缩至50 ml左右，加入几滴稀盐酸进行酸化，摇匀。放置5 min，加入等体积的乙酸乙酯进行混合，萃取23次，合并萃取液。浓缩，定容至25 ml，量取1 ml，定容至25 ml，测定其吸光度，平行三次。2.9盘龙参中黄酮类物质的鉴定2.9.1盐酸-镁粉反应在样品液中加入少量镁粉，在滴加1-2滴浓盐酸，在沸水中加热3 min中，观察反应结果。2.9.2碱性试剂显色反应样品液2-3 ml于50 ml烧杯中，加入25 ml蒸馏水稀释，再加5%亚硝酸溶液1.5 ml，摇匀，放置5 min，再加10%硝酸铝溶液1.5 ml，摇匀，放置6 min，加4%

25、氢氧化钠试液10 ml，观察结果。2.9.3 薄层层析对比取活化好的薄层板3块，每块薄层板分别点3个样，1 芦丁标准品；2 黄酮类粗取物（未脱色）；3黄酮类粗提物（脱色）。使用氯仿-甲醇-水=65：45：12为展开剂，用三氯化铝-乙醇=1：99显色。观察区别。结论 本论文只是初步对盘龙参中的总黄酮提取工艺进行优化，黄酮类物质是以c6-c3-c6为基本碳架的一系列化合物。主要包括黄酮和黄酮醇；黄烷酮（又称二氢黄酮）和黄烷酮醇（又称二氢黄酮醇）；异黄酮；异黄烷酮（又称二氢异黄酮）；查耳酮；二氢查耳酮；橙酮（又称澳咔）；黄烷和黄烷醇；黄烷二醇（3，4）（又称白花色苷元）；花（色）又称2-苯基苯并吡（

26、喃）。黄酮类化合物均有不同的脂溶性和水溶性，本论文中所使用的有机溶剂乙酸乙酯对粗提液中的黄酮类化合物进行精提，主要是提取脂溶性的黄酮类化合物。采用此方法的原因是因为盘龙参中脂溶性的黄酮类类物质含量较高。本论文使用的盘龙参进行回流提取前均采用索氏提取法去除色素，目的是是防止色素在吸光度的测定是产生干扰，保证实验的精确性。 本论文初步确定了盘龙参中黄酮类物质提取的最佳工艺条件：乙醇浓度70%、料液比120、提取时间1 h，有较好的应用价值。 本论文也存在不足，比如提取温度的优化，由于设备的原因无法完成，黄酮初提液中含有大量的植物多糖，具有一系列的药理学功效和保健功能，具有优良的应用前景，也是个好的研究方向。参考文献1李东菊,林阳.山桔总黄酮的提取及鉴定j.辽宁