酶分子修饰(2)课件

1、1 上节课主要内容回顾上节课主要内容回顾 从酶的生产到酶的改性从酶的生产到酶的改性 酶分子修饰酶分子修饰 所要解决的问题和修饰的目标所要解决的问题和修饰的目标 酶分子修饰的种类酶分子修饰的种类 侧链基团修饰侧链基团修饰 2 酶的改性（酶的改性（enzymic improvingenzymic improving）：通过各种方法：通过各种方法 使酶的催化特性得以改进的技术过程。使酶的催化特性得以改进的技术过程。 酶改性的技术酶改性的技术 l 酶分子的修饰酶分子的修饰 l 酶固定化酶固定化 l 酶的非水相催化酶的非水相催化 l 酶的定向进化酶的定向进化 l 3 酶分子修饰酶分子修饰 通过各种方法使

2、通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变酶分子的结构发生某些改变， 从而改变酶的某些特性和功能的技术过程从而改变酶的某些特性和功能的技术过程 称为酶分子修饰。称为酶分子修饰。 4 4.1 4.1 概述概述 2 2、酶分子修饰的原因、酶分子修饰的原因 细胞外稳定性差；细胞外稳定性差； 酶活性不够高；酶活性不够高； 具有抗原性。具有抗原性。 5 4.1 4.1 概述概述 4 4、酶分子修饰的目的、酶分子修饰的目的 研究酶的结构与功能的关系。研究酶的结构与功能的关系。 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。 （7070年代末之后）年代末之后） 提高酶的

3、生物活性（酶活力）。提高酶的生物活性（酶活力）。 增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能 力）。力）。 产生新的催化能力。产生新的催化能力。 6 4.4 4.4 酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰金属离子置换修饰 大分子结合修饰大分子结合修饰 侧链基团修饰侧链基团修饰 肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰 酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰 7 氨基酸侧链基 团 修饰剂 Lys（赖）氨基三硝基苯磺酸，2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、 碘

4、乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 Asp、Glu （天冬、谷） 羧基碳化二亚胺 Arg（精）胍基苯乙二醛，1,2环己二酮、丁二酮 Cys（半胱） 巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 二硫键巯基乙醇、DTT（二硫苏糖醇） His（组）咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸 Tyr（酪）酚羟基碘、四硝基甲烷 Trp（色）吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺 各种氨基酸侧链的修饰剂各种氨基酸侧链的修饰剂 8 4. 4. 酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰） 利用酶分子利用酶分子主链的切断和连接主链的切断和连接，使酶分子的化学，使酶分子的化学 结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的结构及其空

5、间结构发生某些改变，从而改变酶的 特性和功能的方法。特性和功能的方法。 主链的主链的切断切断修饰修饰 9 1 1）主链的切断引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其）主链的切断引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其 活性。活性。 主要用于主要用于探测酶活性中心的位置探测酶活性中心的位置。 2 2）主链切断后仍可维持酶活性中心的空间构象，酶）主链切断后仍可维持酶活性中心的空间构象，酶 的催化能力保持不变或损失不多，其抗原性等特的催化能力保持不变或损失不多，其抗原性等特 性发生改变。性发生改变。 提高提高某些酶特性特别是某些酶特性特别是药用酶的使用价值药用酶的使用价值。 3 3）主链切断有利于酶活性中心的形成，

6、使酶分子显）主链切断有利于酶活性中心的形成，使酶分子显 示其催化功能，使酶活力提高。示其催化功能，使酶活力提高。 酶原酶原酶酶 主链的切断修饰主链的切断修饰 10 胃蛋白酶原 胃蛋白酶 N N端失去端失去4444个个 氨基酸残基氨基酸残基 HClHCl pH1.5pH1.52 2 自身激活自身激活 a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 11 5. 5. 酶组成单位置换修饰酶组成单位置换修饰 氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰：将蛋白酶分子肽链上的某一个：将蛋白酶分子肽链上的某一个 氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法。氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法。 核苷酸置换修饰核苷酸置换修饰：将核酸类酶核苷

7、酸链上的某一：将核酸类酶核苷酸链上的某一 个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法。个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法。 12 （1 1）酶分子组成单位修饰的作用）酶分子组成单位修饰的作用 通过修饰可以提高酶活力通过修饰可以提高酶活力 通过修饰可以增强酶的稳定性通过修饰可以增强酶的稳定性 通过修饰可以使酶的专一性发生改变通过修饰可以使酶的专一性发生改变 通过核苷酸置换修饰可获得各种人造核酸类酶。通过核苷酸置换修饰可获得各种人造核酸类酶。 如：酪氨酸如：酪氨酸-RNA-RNA合成酶合成酶 反应：催化酪氨酸与其对应的反应：催化酪氨酸与其对应的tRNAtRNA反应生成酪反应生成酪 氨酰氨酰-tRNA-tR

8、NA 置换：将置换：将5151位的位的苏氨酸苏氨酸换为换为脯氨酸脯氨酸 结果：酶对结果：酶对ATPATP的亲和性提高近的亲和性提高近100100倍，酶活力倍，酶活力 提高提高2525倍。倍。 如：枯草杆菌的蛋白酶如：枯草杆菌的蛋白酶 反应：催化蛋白质和多肽水解反应：催化蛋白质和多肽水解 置换：活性中心上的置换：活性中心上的丝氨酸丝氨酸换成换成半胱氨酸半胱氨酸 结果：酶对蛋白质和多肽的水解活性消失，出结果：酶对蛋白质和多肽的水解活性消失，出 现催化硝基苯酯等底物进行水解反应的活性。现催化硝基苯酯等底物进行水解反应的活性。 采用核苷酸置换修饰技术将保守核苷酸采用核苷酸置换修饰技术将保守核苷酸 以外

9、的某个或某些核苷酸置换，就可以获得各种以外的某个或某些核苷酸置换，就可以获得各种 不同的人造核酸类酶。不同的人造核酸类酶。 如：如：T T4 4- -溶菌酶溶菌酶 置换：第置换：第3 3位的位的异亮氨酸异亮氨酸换成换成半胱氨酸半胱氨酸，半胱氨，半胱氨 酸可与第酸可与第9797位的半胱氨酸形成位的半胱氨酸形成二硫键。二硫键。 结果：酶活力保持不变，但酶对热的稳定性大结果：酶活力保持不变，但酶对热的稳定性大 大提高。大提高。 13 氨基酸置换修饰的方法氨基酸置换修饰的方法 化学修饰法化学修饰法 定点突变技术定点突变技术 14 （2 2）定点突变技术在酶分子修饰中的应用）定点突变技术在酶分子修饰中的

10、应用 定点突变（定点突变（site directed mutagenesis site directed mutagenesis ）： 指指DNADNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改序列中的某一特定位点上进行碱基的改 变，从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质变，从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质 工程（工程（protein engineeringprotein engineering）和酶分子组成）和酶分子组成 单位置换修饰中常用的技术。单位置换修饰中常用的技术。 15 定点突变技术用于酶分子修饰的主要过程定点突变技术用于酶分子修饰的主要过程（P148P148） 1. 1. 设计新酶分子

11、结构设计新酶分子结构 设计新酶的设计新酶的RNARNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的的核苷酸排列次序或酶蛋白的 氨基酸排列次序，确定需置换的核苷酸或氨基酸氨基酸排列次序，确定需置换的核苷酸或氨基酸 及其位置。及其位置。 2. 2. 确定突变基因碱基序列确定突变基因碱基序列 酶酶RNARNA互补原则互补原则DNADNA序列序列 酶蛋白酶蛋白遗传密码遗传密码mRNA DNAmRNA DNA 3. 3. 获得突变基因获得突变基因 寡核苷酸诱导的定位突变。寡核苷酸诱导的定位突变。 4. 4. 获得新酶获得新酶 获得基因体外重组后导入宿主内进行表达。获得基因体外重组后导入宿主内进行表达。 16 6. 6.

12、酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰 通过物理修饰，可以了解通过物理修饰，可以了解不同物理条件不同物理条件下，特下，特 别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端 pHpH值等）由于酶分子值等）由于酶分子空间构象空间构象的改变而引起酶的改变而引起酶 的特性和功能的变化情况。的特性和功能的变化情况。 特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分 子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的 作用下，副键发生某些变化和重排。作用下，副键发生某些变化和重排。 共价键与副键共价键与副键 17 酶分

13、子修饰的应用酶分子修饰的应用 理论研究理论研究 医学和工业应用医学和工业应用 酶的作用机制研究酶的作用机制研究 亲和标记法和差示标记法亲和标记法和差示标记法 有机介质酶催化反应中的应用有机介质酶催化反应中的应用 18 酶分子的修饰方法酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰金属离子置换修饰 大分子结合修饰大分子结合修饰 侧链基团修饰侧链基团修饰 肽链有限水解修饰肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰氨基酸置换修饰 酶分子的物理修饰酶分子的物理修饰 氨基的修饰氨基的修饰 羧基的修饰羧基的修饰 巯基的修饰巯基的修饰 精氨酸胍基的修饰精氨酸胍基的修饰 酪氨酸酚基的修饰酪氨酸酚基的修饰 组氨酸咪唑基的修饰组氨酸咪

14、唑基的修饰 色氨酸吲哚基的修饰色氨酸吲哚基的修饰 分子内交联修饰分子内交联修饰 19 20 4.6 4.6 酶的定向进化酶的定向进化 定向进化：模拟自然进化的过程，进行定向进化：模拟自然进化的过程，进行人工随人工随 机突变机突变，并在特定的环境条件下进行，并在特定的环境条件下进行选择选择，使，使 进化朝着进化朝着人们所需方向人们所需方向发展的技术过程。发展的技术过程。 定向进化定向进化 分子定向进化分子定向进化 细胞定向进化细胞定向进化 酶分子定向进化酶分子定向进化 蛋白质分子定向进化蛋白质分子定向进化 核酸分子定向进化核酸分子定向进化 微生物细胞定向进化微生物细胞定向进化 植物细胞定向进化植

15、物细胞定向进化 动物细胞定向进化动物细胞定向进化 21 酶分子的定向进化酶分子的定向进化（directed evolutiondirected evolution）：）： 模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），模拟自然进化过程（随机突变和自然选择）， 在在体外体外进行酶基因的人工进行酶基因的人工随机突变随机突变，建立突变建立突变 基因文库基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，在人工控制条件的特殊环境下，定定 向选择向选择得到具有优良催化特性的酶的得到具有优良催化特性的酶的突变体突变体的的 技术过程。技术过程。 属于蛋白质的属于蛋白质的非合理设计非合理设计，它，它不需事先了解不需事先了解 酶的

16、空间结构和催化机制。酶的空间结构和催化机制。 22 适应面广；适应面广； 目的性强；目的性强； 效率高。效率高。 23 以很低的比率向目的基因中以很低的比率向目的基因中随机引入突变随机引入突变，构建突，构建突 变库，凭借变库，凭借定向的选择方法定向的选择方法，选出所需性质的优化，选出所需性质的优化 酶酶( (或蛋白质或蛋白质) )，从而排除其他突变体。，从而排除其他突变体。 定向进化的定向进化的基本规则基本规则是是“获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体”。 定向进化定向进化= =随机突变随机突变+ +定向选择定向选择。 24 4.6.3 4.6.3 酶基因的随机突变酶基因的随机突变 1 1

17、、易错、易错PCRPCR技术为代表的无性进化技术为代表的无性进化 无性突变无性突变：向：向单一酶分子单一酶分子基因内随机引入突变，基因内随机引入突变， 制造突变酶库以便筛选。制造突变酶库以便筛选。 易错易错PCRPCR：从酶的：从酶的单一基因单一基因出发，在出发，在改变反应条改变反应条 件件的情况下进行的情况下进行聚合酶链反应聚合酶链反应，使扩增得到的基，使扩增得到的基 因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术 过程。过程。 反应条件：提高反应条件：提高MgMg2+ 2+浓度；添加 浓度；添加MnMn2+ 2+；改变四 ；改变四 种底物浓度比等。种底

18、物浓度比等。 25 易错易错PCRPCR技术技术 特点：操作简便，随机突变丰富。特点：操作简便，随机突变丰富。 缺点：正突变基因少，需多次缺点：正突变基因少，需多次PCRPCR。 注意：控制好基因突变频率。注意：控制好基因突变频率。 适用：较小基因的定向进化。适用：较小基因的定向进化。 26 2 2、DNADNA重排技术为代表的有性进化重排技术为代表的有性进化 又称又称DNADNA改组技术，有性改组技术，有性PCRPCR （sexual PCRsexual PCR）。从正突变基因文库中分离得到的）。从正突变基因文库中分离得到的 同源同源DNADNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的，用酶切割

19、成随机片段，经过不加引物的 多次多次PCRPCR循环，使循环，使DNADNA的碱基序列重新排布而引起基的碱基序列重新排布而引起基 因突变的技术过程。因突变的技术过程。 27 28 DNADNA改组技术改组技术 特点：正突变频率高，进化速度快。特点：正突变频率高，进化速度快。 注意：需多次进行。注意：需多次进行。 29 3 3、基因家族之间的同源重组、基因家族之间的同源重组 从自然界中存在的基因家族出发，从自然界中存在的基因家族出发， 利用它们之间的同源顺序进行利用它们之间的同源顺序进行DNADNA改组实现同改组实现同 源重组。源重组。 如：如：StemmerStemmer等从等从4 4种微生物

20、种微生物中选择编码头孢中选择编码头孢 菌素酶的菌素酶的4 4个同源基因个同源基因，对它们进行单独进化或，对它们进行单独进化或 同源重组进化。结果对同源重组进化。结果对单基因进化单基因进化得到的突变酶得到的突变酶 中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了增加了8 8倍倍， 而用而用家族同源重组进化家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种的方法使抗性比其中两种 微生物来源的天然酶提高微生物来源的天然酶提高270270倍倍，比另外两种酶，比另外两种酶 提高了提高了540540倍倍。 30 杂合酶：把来自不同酶分子中的结构单元或是杂合酶：把来自不同酶分子中的结构单元或是 整个酶

21、分子进行组合或交换，以产生具有所需整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需 性质的优化酶杂合体。性质的优化酶杂合体。 31 定向进化中，突变具有随机性，但通过定向进化中，突变具有随机性，但通过 ，加之控制实验条件，加之控制实验条件， 限定突变种类，限定突变种类， 降低突变率，缩小突变库的容量，降低突变率，缩小突变库的容量， 这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一 方向的进化速度。方向的进化速度。 。另有。另有 一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的 底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。底物或利用

22、绿色荧光蛋白的荧光性质等。 32 1 1、突变基因文库的构建、突变基因文库的构建 定义：将各种不同定义：将各种不同突变基因突变基因与与载体重组载体重组，再转入，再转入 适宜的细胞或包装成重组适宜的细胞或包装成重组噬菌体的技术过程。噬菌体的技术过程。 质量要求：文库质量要求：文库包容性包容性和文库和文库完整性完整性 过程：过程： l载体选择载体选择 l基因重组基因重组 l形成基因文库形成基因文库 质粒质粒 噬菌体噬菌体DNADNA 黏粒载体黏粒载体 噬菌粒载体噬菌粒载体 转化转化 转导转导 33 2 2、突变基因的筛选、突变基因的筛选 （1 1）定向选择环境条件的设定）定向选择环境条件的设定 （

23、2 2）高通量筛选技术）高通量筛选技术 l平板筛选技术平板筛选技术 l荧光筛选法荧光筛选法 l噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法 l酵母细胞表面展示法酵母细胞表面展示法 34 举例举例 例例1 1：定向进化提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力：定向进化提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力 例例2 2：大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究：大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究 例例3 3：采用易错：采用易错PCRPCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶对粘质沙雷氏菌几丁质酶C C进行进行 定向进化定向进化 35 酶酶性质性质突变方法突变方法 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶E E有机相活性有机相活性/ /稳定性稳定性易错易错PC

24、RPCR -内酰胺酶内酰胺酶总活力总活力/ /底物专一性底物专一性DNADNA改组改组 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶BPNBPN稳定性稳定性 盒式诱变盒式诱变 对硝基苯酯酶对硝基苯酯酶底物专一性底物专一性/ /有机相活性有机相活性易错易错PCR/DNAPCR/DNA改组改组 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性底物专一性盒式诱变盒式诱变 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶底物专一性底物专一性DNADNA改组改组 绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白荧光荧光DNADNA改组改组 核酶核酶底物专一性底物专一性易错易错PCR/DNAPCR/DNA改组改组 天冬氨酸酶天冬氨酸酶活性与稳定性活性与稳定性随机随机/ /定位

25、诱变定位诱变 药物和疫苗药物和疫苗活性活性/ /专一性专一性/ /最佳表达最佳表达DNADNA改组改组 36 4.7 4.7 酶分子修饰的应用（酶分子修饰的应用（P152-157P152-157） 在在酶学研究酶学研究方面的应用方面的应用 在在医药医药方面的应用方面的应用 在在工业工业方面的应用方面的应用 在在抗体酶抗体酶研究开发方面的应用研究开发方面的应用 在在核酸类酶核酸类酶人工改造方面的应用人工改造方面的应用 在在有机介质酶催化有机介质酶催化反应中的应用反应中的应用 37 4.7 4.7 酶分子修饰的应用（酶分子修饰的应用（P152-157P152-157） 1 1、在、在酶学研究酶学研

26、究方面的应用方面的应用 l酶活性中心的研究酶活性中心的研究 l酶的空间结构研究酶的空间结构研究 l酶的作用机制研究酶的作用机制研究 38 4.7 4.7 酶分子修饰的应用（酶分子修饰的应用（P152-157P152-157） 2 2、在、在医药医药方面的应用方面的应用 l降低或者消除酶的抗原性降低或者消除酶的抗原性 l增强医药用酶的稳定性（半衰期）增强医药用酶的稳定性（半衰期） 39 4.7 4.7 酶分子修饰的应用（酶分子修饰的应用（P152-157P152-157） 3 3、在、在工业工业方面的应用方面的应用 l提高工业用酶的催化效率提高工业用酶的催化效率 l提高工业用酶的稳定性提高工业用酶的稳定性 l改变酶的动力学特性改变酶的动力学特性 40 4.7 4.7 酶分子修饰的应用（酶分子修饰的