玉米深加工生产木糖醇的工艺优化 课程设计

1、燕山大学课 程 设 计 说 明 书玉米深加工生产木糖醇的工艺优化学院（系）：环境与化学工程学院年级 专业： 09级 生 物 化 工 学 号： 3 学生 姓名： 郭晓静 指导 教师： 崔红霞 张晓宇 教师 职称： 副教授 燕山大学课程设计（论文）任务书院（系）：环境与化学工程学院 基层教学单位：生物工程系 学 号3学生姓名郭晓静专业（班级）09生物化工设计题目玉米深加工生产木糖醇的工艺优化设计主要内容1. 单因素实验确定玉米深加工生产木糖醇的工艺参数范围的设计；2. 正交实验确定玉米深加工生产木糖醇的工艺参数设计；3. 最佳玉米深加工生产木糖醇方法的工艺设计；设计要求1.要有明确设计的目的；2.

2、提出设计方案之前要充分查阅各种文献资料（15篇以上）；3.设计合理的关于玉米深加工生产木糖醇的工艺及其最优条件探究的操作方式或方案；4.说明书撰写要求语言精练，表述清楚，设计方案可行且具创新性；5.设计提出总结与分析（包括讨论展望，个人收获体会等）；工作量1.至少阅读15篇以上的相关科技文献，外文文献三篇以上；2.设计文字至少在10000字以上；工作计划11.1811.23 定题，查阅收集资料11.24 确定设计思路，与老师沟通确定课设任务书内容11.2511.30 按照要求撰写：格式正确，条理清晰，表格清楚11.28 11.29 准备PPT，简单叙述设计过程中承担的工作回答设计基本问题11.

3、30 根据老师对课设说明书提出的问题对格式及内容加以改进，提交参考资料1冯永强, 王江星. 木糖醇的特性及其在食品中的应用. 食品科学, 2004, 25(11): 379-381.2尤新, 李明杰. 木糖与木糖醇的生产技术及其应用. 北京: 中国轻工业出版社, 2006,24(10): 289-451.3怀文辉, 何秀萍, 张博润, 等. 微生物产木糖醇的研究进展及应用前景. 微生物学通报, 2000, 27(1): 66-69.4Eleoncfa winkelhausen, Slobodanka kuzmanova. Microbiol con-version of D-xylose to

4、 xylitol. Journal of Fermentaition andBioengineering, 1998, 86(1): 1-14.指导教师签字基层教学单位主任签字说明：学生、指导教师、基层教学单位各一份。2012年 11月 21 日 燕山大学课程设计成绩评定表设计者姓名: 郭晓静 学号: 3 设计题目: 玉米深加工生产木糖醇的工艺优化 说明书评分： 设计思路： 20分 字数要求： 20分 文档排版： 20分 格式细节： 20分 分析讨论： 20分 成绩： 答辩小组评语：口语表达：满分20分 幻灯质量：满分20分 设计分析：满分40分 回答问题：满分20分 成绩： 课程设计总成绩：

5、 （说明书成绩0.6+答辩成绩0.4） 答辩小组成员签字：年 月 日2012-2013 秋季学期生物工程专业课程设计结题论文玉米深加工生产木糖醇的工艺优化学院（系）： 环境与化学工程学院年级 专业： 09级 生 物 化 工 学 号： 3 学生 姓名： 郭晓静 指导 教师： 崔红霞 张晓宇 教师 职称： 副教授 摘 要木糖醇属于低热量多元醇，无细胞毒性，可透过细胞膜供给组织利用。在机体代谢过程中不需胰岛素参与，反而可促进少量胰岛素分泌，促进葡萄糖向肝糖原转化，降低转氨酶水平，是辅助治疗糖尿病和肝病良好营养剂。传统的木糖醇生产采用纯木糖加氢的方法，原料价格昂贵, 且镍催化剂会污染环境每年农林业生产

6、都会产生大量的半纤维素废料，这些废料如果不处理或处理不当将造成环境污染。若利用其水解液发酵生产木糖醇，不仅可减少环境污染, 还能变废为宝， 取得良好的经济效益。目前报道的可以发酵木糖生成木糖醇的菌株很多, 主要为酵母菌株等。水解液发酵存在的主要问题是水解液中含有很多抑制酵母生长的有害物质, 如糠醛、乙酸等。采用离子交换树脂进行处理固然可以有效地去除发酵抑制物，但成本太高。要使微生物发酵生产木糖醇技术工业化， 必须找到玉米芯水解液低成本高效率的脱毒方法， 并提高菌株本身对水解液中有害物质的耐受力。本文主要进行菌种驯化以及采用玉米芯水解液发酵生产木糖醇的工艺条件优化方面的研究。关键词：木糖醇、发酵

7、、玉米、深加工目 录第一部分：文献综述1木糖醇发酵法生产途经11.1发酵法生产木糖11.1.1细菌11.1.2霉菌11.1.3酵母菌11.2发酵法生产木糖醇工艺流程21.3半纤维素原料前处理22发酵法生产木糖醇影响因素32.1通气量32.2 初始木糖浓度32.3 氮源42.4初始细胞浓度42.5温度和pH42.6其它单糖不同单糖对木糖转化有不同影响52.7金属离子53新技术在木糖醇发酵生产中应用63.1菌种选育63.2 固定化技术73.3人工神经网络和遗传算法84前景展望8第二部分：课程设计部分1. 材料101.1 菌种101.2 酶101.3 原料101.4 培养基111.5实验器材112.

8、 实验方法112.1化学法112.1.1 提取工艺路线112.1.2试验步骤122.2发酵法制木糖醇132.2.1 玉米芯酶水解液制备132.2.2 培养方法132.2.3 中和过滤132.2.4 蒸发142.2.5 脱色142.2.6 离子交换142.2.7 加氢142.2.8 浓缩、结晶、分离142.2.9 母液处理142.3 分析方法142.3.1木糖及木糖醇的测定142.3.2菌体干重的测定153.设计153.1 培养条件对发酵的影响153.1.1 种子龄的影响153.1.2 接种量的影响153.1.3 初糖浓度的影响153.1.4装液量的影响153.1.5 氮源浓度的影响153.1.

9、6 初始 pH 值的影响163.1.7 温度对玉米芯水解液发酵的影响163.1.8正交实验164.分析与总结164.1分析展望164.2总结体会18参考文献20第一部分 文献综述1木糖醇发酵法生产途经1.1发酵法生产木糖醇微生物菌种能利用木糖的微生物种类并不多，在细菌、霉菌和酵母中均有发现，但目前研究较多的是酵母。1.1.1细菌迄今为止，发现仅有Corynebacterum sp(棒状杆菌属)、Enterobacter liquefaciens (肠细菌属)，Mycobacteriumsm egmatis (分枝杆菌属)等种属中很少一部分细菌能将木糖转化为木糖1；但由于木糖醇只是这类细菌正常生

10、理代谢过程中一种中间产物，产量相当小，因此没有应用于生产。但Izumori等发现Msmegmatis可将木糖转化为木糖醇能力较强，转化率达402。1.1.2霉菌极少数霉菌能发酵木糖产生木糖醇，如Penicillium、Aspergillus、Rhizopus、Byssochlamys和Neuro.sporaspp等，在含有木糖培养基中能产生低浓度木糖醇 。Dahiya等将Petromyces albertensis接种在初始木糖浓度为100 g / L培养基中，培养10 d后，测得木糖醇浓度为39.8 g / L。1.1.3酵母菌在微生物中，酵母转化木糖生产木糖醇性能最为优越。Candida属

11、酵母转化能力较强，如C.tropicalis、C guilliermondii、C.mogii、C parasilosis。此外，还有：Debaryomyces属(如D.hansenii)、Pachysolen属(如Ptannophilus)、Saccharomyces属(如S.cerevisiae)、Schyzosaccharomyces属(如S.pombe)、ansenula属(如Hanomala)I Kluyveromyces属(如K.marxianus)等。1.2发酵法生产木糖醇工艺流程微生物发酵植物纤维原料生产木糖醇工艺流程如下：富含多缩戊糖植物纤维原料一(前处理)一催化剂(酸) /

12、 水解一半纤维素水解液一(提纯、脱毒)一木糖溶液一微生物发酵一木糖醇发酵液一(提取、分离、精制)一木糖醇产品。1.3半纤维素原料前处理采用发酵法生产木糖醇之前必须对半纤维原料进行前处理。一方面，通过前处理和酸水解可降低纤维晶体分子聚合度，改变空间构型，使其变得更易进行酶促反应；另一方面，通过脱毒除去有害物质，提高水解液发酵性能。对植物纤维原料前处理主要包括：粉碎、水洗、蒸汽爆破和氨处理。经粉碎，使原料粒径变小，通过水处理可去除其中灰分，但两者均对发酵效果影响不大 。蒸爆处理强度必须适当，条件过于温和，作用不明显；过于激烈，会导致半纤维素分解严重，同时产生抑制微生物生长副产物3。10 氨水处理，

13、作用条件温和，半纤维素损失也不大，但能提高原料水解效率，并可除去92 木质素和所有乙酸，显著提高水解液发酵性能。半纤维素水解过程中，盐酸催化活性最好，但其腐蚀性和挥发性很大，故多采用硫酸。酸度增加会加速水解反应，同时促进非糖杂质生成4。温度过低起不到加速作用，太高又会促进木糖分解，并产生过多有害副产物。水解时间越长，则原料水解越彻底；但副产物量也会越大。固液比越高水解越完全，糖得率越大，过高造成酸消耗增大；固液比太低，糖得率小，导致浓缩成本增加 叫 。水解过程要产生对微生物有毒物质，采用石灰乳或碳酸钙可去除水解液中单宁、重金属离子和硫酸根离子，还有部分乙酸和分子酚。活性碳除脱色外，还可吸附某些

14、酸溶性木质素衍生物和大部分乙酸。采用汽提和真空浓缩技术在提高水解液糖浓度同时，可去除糠醛、乙酸及挥发性有毒成分，提高水解液发酵性能。由于毒害成分复杂，加之毒害机理尚不清楚，寻求多种方法复合使用将会得到普遍重视。2发酵法生产木糖醇影响因素2.1通气量氧气是酵母菌转化木糖过程中一个重要因素。发酵液中溶氧量不仅影响木糖醇产量，且对副产物形成和菌体本身生长都有重要影响。迄今为止，虽对其作用机理尚不完全清楚，但通过大量实验分析，认为氧气可能在糖运输、辅酶再生和ATP合成几方面起着关键调控作用。需要指出的是，不同种属菌株关于木糖醇生产和氧气之间关系也不尽相同。Laplace等 提出，酵母产生木糖醇过程中氧

15、气影响作用分为几个阶段，在无氧或溶氧量极低条件下，机体电子传递系统不能完全氧化NADH，结果菌体内NADH / NAD 失衡5，木糖还原酶活性很低，导致木糖醇分泌。溶氧增加，作为电子终端受体有效调节上述不平衡，有利于木糖代谢，产物为木糖醇或乙醇。当通入过量氧气时，辅酶NADH被氧化，激活木糖脱氢酶，生成木糖醇进一步转化为木酮糖进入磷酸戊糖途径，此时生物量增加，发酵工业要有效生产木糖醇，首先要考虑菌体细胞快速积累，这就要求维持高水平溶解氧；其次，木糖醇需要在厌氧或微氧 条件下才可形成，以降低菌体呼吸率。有学者提出两段发酵法，即第一阶段采用较高转速和较大通气量，最大限度促进菌体高密度生长；第二阶段

16、采用低转速并限制通气量使木糖醇积累。Fabio等相关研究为之提供理论支持。2.2 初始木糖浓度发酵液中木糖浓度会显著影响酵母生长和木糖醇产量。低初始木糖浓度时，由于一部分碳源将用于细胞生长，从而减少用于转化木糖。耐高渗微生物，尤其是酵母菌能耐受较高渗透压，能在较高浓度 糖溶液中正常生长，提高木糖浓度，可增加木糖消耗量，最终使木糖醇累积量增加。Sirisansaneeyakul等 将初始木糖浓度从53 g / L升至533 g / L，木糖醇转化率也从0升至0.72 g，可能是由于木糖浓度升高，木糖还原酶活性也随之升高，但对木糖脱氢酶影响不高。在通气量不变前提下，增加木糖浓度会反馈阻遏酵母菌生长

17、，导致木糖醇生成减少，且阻遏现象会因酵母类型而异。木糖醇生成速率依赖于酵母种类，一般而言，对于大多数酵母菌， 合适初始木糖浓度一般在100200 g / L，耐渗酵母可达300 g / L。Prior等 认为高浓度木糖会促进木糖醇发酵活动，可能是在严格限氧生长条件下，高浓度木糖可诱导产生高密度细胞，而不单单是由于底物本身增加原因。2.3 氮源氮源种类对木糖醇产量和产率均有影响。酵母粉是最佳有机氮源，其能提供丰富维生素、氨基酸和生物素等酵母生长必须因子6。铵盐是最佳无机氮源，Jean等 报道使用尿素作为氮源得到很高木糖醇产量。通过考察无机氮与有机氮差别，发现使用无机氮源产醇量不比有机氮源低，这为

18、利用廉价无机氮源进行大规模生产木糖醇提供依据。木糖醇作为次生代谢产物，其形成、积累与菌体生长在某种程度上呈反相关。Silva等在常规发酵培养基中分别添加5 g和l0 g酵母粉进行对照实验，结果发现，生物量增加，但木糖醇产率急剧下降；可见，氮源浓度不可太高，否则只利于酵母生长而不利于木糖醇积累。此外，也要考虑C / N，往往高C / N更有利于多元醇形成7。2.4初始细胞浓度Cao等究初始细胞浓度对Candida sp B-22菌株发酵木糖过程影响，结果发现，在3.8-26g / L范围内，初始细胞浓度和木糖醇产量之间呈线形正相关。初始细胞浓度26 g / L时，木糖醇转化率达210 g / L

19、；且较高初始细胞浓度显著缩短发酵周期。Vmldeska等用Candida boidinf进行实验，设定木糖初始浓度为50 g / L，当初始细胞浓度由1.3 g / L增到5.1 g / L时，木糖醇产量翻了两倍，可见在一定条件下，较高初始细胞浓度有利于木糖醇产生8。研究还发现，通常情况下，菌龄只影响木糖醇产生速率和发酵时间，而不影响其最终产量。2.5温度和pH酵母菌转化木糖生成木糖醇最适温度通常在28 30 左右。较小范围温度变化不会对木糖醇生成速率造成明显影响。研究发现，对于多数非热敏型酵母菌，在30 37 范围内随温度升高9，木糖醇产量会随之升高：但超过37时，其产量会明显下降。Cand

20、 da sp.B-22生产木糖醇温度范围在3540较稳定；但当温度在45 或超过45 时，木糖醇产量将急剧减少。这可能是随温度升高，木糖还原酶依赖NADPH和NADH因子减少原因 。发酵液pH值对于酵母菌菌体代谢及产物形成具有重要影响。通常，酵母菌最适pH值为46，但不同种属也有差别，即使同一种属菌株生产木糖醇最适pH和生长最适pH也不尽相同。Fabio等 研究发现，pH范围在48时，Debaryomyceshansenii UFV-170木糖醇产量最大，木糖转化率在0.700.76 g / g，木糖醇产量达37.5481 g / L；且随pH增加，生物体异化代谢会减弱，木糖转化率有所升高。D

21、a Silva等报道，C tropicalisDSM 7524对pH并不敏感，在pH 2.5时木糖醇产量最大；当增到4时，木糖醇生产速率提高，但转化率会下降。酵母菌正常代谢产生乙酸等酸性物质会造成pH下降，并会毒害细胞抑制木糖醇生成，所以采用分批发酵时通常要适当提高发酵液初始pH，以减小影响。2.6其它单糖不同单糖对木糖转化有不同影响通常可利用木糖酵母也能选择性发酵某些单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、纤维二糖、阿拉伯糖和树胶醛糖等；研究发现，后几种糖在发酵过程中对木糖没有明显抑制作用。但当发酵液中存在葡萄糖、果糖或甘露糖时，往往出现“二次生长”现象，即葡萄糖、果糖或甘露糖等速效碳源消耗

22、完，然后才能利用木糖，从而延缓木糖转化。Silva等认为，酵母在无氧代谢时，将葡萄糖转化为乙醇，该反应和木糖还原成木糖醇同是还原反应，相互之间会竞争氧化还原电势，导致木糖还原酶活性受到抑制10，木糖醇产量降低。然而Walthe等 实验发现，少量葡萄糖可提高木糖醇产量，可能由于葡萄糖可促进NADPH产生。实验证实，上述糖类仅用于细胞生长和乙醇生产，在培养基中几乎没有发现这些糖相应多元醇。2.7金属离子钾、钙、镁、铜，锰、钴等都是酵母菌生长过程中必需金属元素，可激活木糖还原酶及其辅酶活性或直接参与生物合成反应。Azulna等分别在木糖发酵液中添加不同无机盐，结果发现，4 KC1、NaC1可促进木糖

23、转化；但浓度过高，反而抑制木糖还原酶活力，降低木糖醇生成速率，可能是由于金属离子过度激活酶促反应，不利于木糖醇积累。Gustavo等研究发酵木糖醇过程中镁离子影响效果，发现低浓度Mg：有益于木糖醇产生，而高浓度Mg。则有利于乙醇积累，认为低浓度Mg 造成氧化磷酸化过程中碳代谢失衡11，从而导致细胞内部NADH增加，促进木糖醇酶促合成反应。王步江等 在研究不同无机盐对Hansenula转化木糖时影响，发现添加4 KH2PO4明显促进木糖醇生成，与对照组0.91 g / Lh相比，速率达1.40 g / h。2.8发酵方式发酵工业通常采用分批发酵、连续发酵：和分批补料发酵三种方式，目前，木糖醇生产

24、研究较多是分批发酵和分批补料发酵。分批发酵特点是：允许初始木糖浓度高、产物浓度高(易于分离)，但产率相对较低。对于多数微生物而言，尽管连续发酵被认：为是最高效、最高产生产技术12：但由于该过程要求发酵液低稀释率，在实际生产中很难满足。在补料分批发酵整个过程中，木糖浓度始终可维持最佳水平，即：有利于木糖转化又不会对酵母产生抑制作用，同时高密度细胞提高体积产率。Vandeska等 研究发酵方式对木糖醇产量影响，采用分批补料发酵取得较好效果，相比较分批发酵最高理论产量53、生产率0.24 g / Lh，它可达到75、生产率046 g / Lh，小数点是前者两倍。3新技术在木糖醇发酵生产中应用3.1菌

25、种选育Fabio 采用传统方法分离得到270株酵母菌株，以木糖作为唯一碳源进行产木糖醇菌株选，发现DebaryomyceshansenfiUFV-170产量最好，24 h生产木糖醇5.84 g / L，产出比是054 g / g。在选育生产木糖醇菌种时，除采用传统菌种选育方法外，还利用基因重组技术构建工程菌。Mka等从革兰氏阳性菌分离出木糖醇磷酸脱氢酶基因，并在枯草杆菌中表达，实验发现，它将葡萄糖转化为木糖醇能力达23。Jenu等从P. stipitis和Azotobacter vinelandii中克隆得到木糖还原酶基因XP和转运酶基因STH，并将其导入到菌株13Scerevisiae BJ

26、 3505中得到重组株Scerevisiae BJ3505/xR/sTH，然后进行木糖发酵，木糖初始浓度为100 g / L，测得结果如下，木糖醇浓度600 g / L，生成速率158 g / Lh。远远高于出发菌株(7.50 g / L、020 g / Lh)。刘涛等 从瑞氏木霉(Trichoderma reesei)DNA文库中分离出木糖醇脱氢酶基因xdhl，以pLJC 19质粒为骨架14，反向插人构巢曲霉3一磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子Pgpd A和构巢曲霉仃p C基因转录终止子T仃p C之间，核对构建出新的表达载体pGTA-xdh，然后采用共转化法对Treesei原生质体进行转化，筛选到

27、一株具有较高木糖醇积累量阳性菌株Rut-LT 15。2 木糖液体培养基中培养4 d后，测得木糖醇积累量为2.37 mg / mL，达到出发菌株6倍。3.2 固定化技术固定化技术应用为微生物连续化发酵提供理论支持。与游离发酵相比，固定化处理后细胞密度高，且发酵稳定性增强，营养基质利用率提高，包括有毒物质在内转化物可不断排除，减少对菌体抑制作用，大大缩短木糖醇生产周期。de Silva等采用多孔玻璃作为载体，将C tropicalis DSM - 7524固定化处理后放在流化床反应器中发酵木糖，生产率达1.35 g / Lh。陈宏文等首次尝试用高压微胶囊成型装置制备莫格假丝酵母NaCSPDMDAA

28、C微囊体生产木糖醇。结果发现，采用2 PDMDAAC作为反应液，输液泵推进速度50 mm / h，选用7 针头，粒径2.0 mLT l微囊得到最大木糖醇浓度27.6 g / L，发酵时间从游离培养103 h缩短到75 h15，最大生产能力为037 g / Lh，比游离细胞提高9.1。Wan Ning等采用0.6 壳聚糖溶液制备直径为2.5 mm微囊体进行发酵，木糖转化率稳定在6070，高于游离细胞发酵(4863)；且木糖醇生产过程近似一直线，发酵过程能很容易进行控制。Carvalho等 将季也蒙假丝酵母经海藻酸钙包埋后再以浓缩5倍甘蔗渣水解产物为底物、300 r / m，空气流速1.3 1 /

29、 min，初始细胞浓度为1.4，pH 6.0，在搅拌式反应器中分批发酵120 h后木糖醇浓度达47.5 g / L，生物转化率为0.81 g / g。也有尝试用核磁响应进行固定化发酵，但效果并不理想。有关微生物细胞固定化方法还有很多，但生产木糖醇研究仍处起步阶段，进行大规模工业化生产尚不成熟16。3.3人工神经网络和遗传算法方柏山等利用人工神经网络(ANN)和遗传算法(GA)对木糖醇发酵过程中许多因素和条件进行数学建模。通过研究发酵过程中操作条件，如底物浓度、产物浓度与菌体浓度等，对其进行估算和预测，从而优化发酵工艺参数。特别是该模型可用于估计最大产物浓度出现时间，这对于发酵生产具有非常重要指

30、导意义。4前景展望目前全球木糖醇总产量约为6万吨，而年需求量在l0万吨以上。每公斤木糖醇报价为30 45元。主要生产国按产量排位依次有：中国、芬兰、俄罗斯、美国、意大利和日本。我国木糖醇生产已有40多年历史，目前主要有浙江华康、山东福田、河北奥翔和河南豫鑫等骨干企业，截至2003年末，我国木糖醇总产量已达2.6万吨，其中8090用于出口。据中国海关2006年末公布统计数字，木糖醇已占我国万吨级生物产品出口排名第3位，占国际市场总销量“半壁江山”。随着国内销售量以年约10速度递增，国内潜在市场令人乐观。国际上木糖醇商品化生产几乎全靠化学方法，其工艺也相对成熟。与之相比，木糖醇微生物发酵法以其条件

31、温和、操作简便、副产物少、环境污染低等优点成为研究热点；但木糖醇得率、质量浓度和生产能力一直是限制大规模发酵生产“瓶颈”问题。目前为止，尚无大规模发酵生产木糖醇报道，发酵罐放大技术仍停留在经验和中试阶段。木糖主要通过无机酸水解农业废料来制取。一般农业植物纤维废料如玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣、稻壳以及其他禾秆等均是制取木糖的好原料。其中农业植物废料玉米芯具有来源广泛、产量大、易于加工、木糖收率高等特点，是制取木糖的极好原料。目前，国内外工业生产木糖工艺都存在着不足。通过分析木糖醇合成代谢途径，加强代谢工程菌改造，同时研究影响木糖醇发酵生产因素及其相互关系，最终优化发酵工艺，是提高木糖醇产量和转化率、

32、进而扩大生产关键。可预见，微生物发酵生产木糖醇有着广阔市场前景和良好社会效益，最终将会改变木糖醇生产世界格局。第二部分 课程设计部分玉米深加工生产木糖醇的工艺优化 木糖醇是一种五碳醇，甜度与蔗糖相当，人体的木糖醇代谢无需胰岛素的参与，因此木糖醇可以作为糖尿病人蔗糖的替代剂时木糖醇具有良好的抗龋齿性能，所以木糖醇在食品， 医药工业都有特殊的应用价值而倍受人们的关注。目前工业上生产木糖醇均采用木糖化学催化加氢的方法，其设备和工艺复杂、成本较高，一定程度上限制了其应用。因为化学工艺首先必需从半纤维素水解物中制取纯净的木糖，才能用于加氢还原制备木糖醇。发酵工艺则无需纯化木糖的步骤，是一条可能有效降低生

33、产成本的工艺路线。但是，半纤维素水解过程伴随产生有毒的副产物，包括木糖的降解产物糠醛，半纤维素脱乙酰基生成醋酸，木质素降解生成酚类化合物。这些物质都能抑制酵母细胞生长， 影响半纤维素水解物的木糖醇发酵性能。针对酸水解会对酵母生长和发酵木糖醇产生抑制的现象，用木聚糖酶系对玉米芯进行水解。本文主要对酵母细胞发酵玉米芯酶水解液生产木糖醇的工艺条件进行优化。1. 材料1.1 菌种所用酵母为热带假丝酵母(Candida tropiocalis)菌株AS2.1776，购自中国微生物菌种保藏中心，接种保存于普通麦芽汁培养基上。1.2 酶木聚糖酶系由浙江省农业科学研究微生物研究所院提供。1.3 原料玉米芯产自

34、山西，粉碎至1020 目，该原料含半纤维素36%。1. 4 培养基种子培养基：木糖10 g / L，葡萄糖10 g / L，酵母浸膏10 g / L，MgSO4，0.2 g / L，KH2PO4，5 g/L，木糖醇发酵培养基：取玉米芯酶水解液(约木糖浓度为40 g / L) 100 mL， 加入酵母0.25 g 膏，蛋白胨0.25 g，KH2PO4 0.5 g， MgSO4 0.05 g，( NH4 )2SO4 40.5 g。将100 mL 的发酵液装入250 mL 三角瓶中，121 灭菌15 min。1.1.5实验器材采用无框表格超微粉碎机江阴万通药化机械设备厂压力水解釜泰安市泰山轻工机械厂

35、发酵罐镇江东方生物工程设备技术公司中和罐江苏泰兴兴达罐业有限公司升降膜蒸发器常州天瑞干燥设备有限公司脱色罐北京瑞纳旭邦科技有限公司电子分析天平上海精科天美科学仪器有限公司凯氏定氮仪上海沛欧分析仪器有限公司烘箱上海合恒仪器设备有限公司视差折光检测器HITACHI公司离心机湘潭离心机有限公司冰箱上海科菱威生物科技有限公司2. 实验方法2.1化学法2.1.1 提取工艺路线。用玉米芯提取木糖的工艺路线:把粉碎的玉米芯用标准分样筛筛滤，制成不同粒径的玉米芯颗粒(粒径分别为0. 35、0. 83、1. 65 mm)。把玉米芯用去离子水进行预处理，处理完毕进行抽滤后干燥； 把一定质量的干燥玉米芯放入500

36、ml 的圆底烧瓶中，加入硫酸溶液后进行超声波处理，再经高温水解制得木糖水解液; 水解液经中和脱色处理后得到木糖溶液； 然后用DNS 法对木糖液进行分析。2.1.2试验步骤。 选用当年无杂质、无灰尘、无霉变、水分含量低的干燥玉米芯，用粉碎机粉碎，筛滤成不同粒径的玉米芯。 用托盘天平称取50 g 玉米芯放入大烧杯中，量取400 mL去离子水，加水浸泡。温度控制为80 ，预处理时间为90 min，在处理过程中不断搅拌，以除去灰分、胶质等。进行抽滤后把玉米芯干燥至恒重，保存备用。 称取预处理的玉米芯25 g，放入500 mL的三颈烧瓶中，再取一定体积的硫酸与玉米芯混合。在室温下超声波处理90 min，

37、使酸充分进入玉米芯中。 水解超声波处理后的原料，在102 的条件下加热回流2.5 h，对反应后的混合物进行抽滤得到水解液。 在80 条件下，用配制的比重为1.10 1.16 的碳酸钙乳状液为中和剂对水解液进行中和，该试验在中和过程中用pH计来检测掌握，直到pH值达到3.8 4.0 时，中和液中的硫酸已全部中和掉，此时中和操作即达终点。在中和过程中不断搅拌，使反应充分，最后抽滤得到水解液。 把中和后的水解液进行脱色，除掉来自原料和水解液中的大部分色素和胶状物，在脱色时，用活性炭作脱色剂，活性炭质量取水解液质量的6%，在80 时搅拌1 h，脱色后的水解液颜色和稠度发生明显变化，由黄色稠状液变为无色

38、稀薄液体，进行抽滤后得到中性木糖溶液。 对得到的木糖溶液进行浓缩去杂处理，使硫酸钙析出；再进行抽滤;把木糖液稀释至500 mL。 利用DNS 法测出木糖溶液的吸光度，利用标准曲线计算出木糖液浓度，从而得到木糖质量。通过计算得出木糖产率。计算公式为:X = m/M 100% 式中，X 为木糖收率；m 为木糖质量；M 为预处理的玉米芯质量。2.2发酵法制木糖醇2.2.1 玉米芯酶水解液制备玉米芯经5% 氨水在60 条件下浸泡12 h，滤去浸泡液，用自来水反复冲洗，加水至固液比为110 的比例，于170 下密封蒸煮2 h，过滤，收集滤液。取玉米芯高温蒸煮液适量， 在45 下搅拌速度为200 r /

39、min 条件下， 用5 mol / L NaOH 和5mol / L HCl 溶液调节维持反应液pH 4.0， 加6% 的木聚糖酶， 酶活一般在(154.8 IU / mL)，反应8 h，过滤，得滤液。在旋转蒸发仪上，50条件下，真空浓缩。测定木糖浓度。2.2.2 培养方法种子培养：取斜面菌种一环，接入种子培养基中，250 mL 的三角瓶装液量30 mL， 于30下摇瓶培养1 d， 摇床转速为200 r / min。摇瓶培养：250 mL 摇瓶中加入100 mL 发酵培养基， 将液体种子以5% 的接种量接入发酵培养基中， 摇瓶转速180 r / min。30下发酵3 d测定。时取样测定木糖和木

40、糖醇的浓度。发酵罐培养；酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米芯酸(或酶解液)水解液(约含木糖浓度为40 g / L)2 L、KH2PO4 5 g， MgSO4 0.5 g，(NH4)2SO4 0.5 g。3.5 L 发酵罐装液2 L，调pH 值至6.0。121 灭菌15 min。2.2.3 中和过滤水解液加入波美度17 度碳酸钙进行中和.具体方法为:将上面水解液加入中和罐中并加温至7580 ，在此过程中 ，边搅拌边加入波美度17度的 CaCO3 乳液 ，调控至 pH3. 84. 0 ，为使沉淀充分 ，中和后保温1 h再过滤除渣.氢化后糖液含有少量催化剂粉 ，在蒸发浓缩前先进行过滤.浓缩分两

41、步 ，第一步 ，真空度 9. 33 104 Pa ，温度为 50 条件下将糖液浓缩至含木糖醇量为 50 %；第二步 ，采用升降膜蒸发器 ，将真空度提高到 10. 67 104 Pa ，温度升到 7075 ，糖液浓缩到含木糖醇 86 % 时。2.2.4 蒸发将除渣后的糖液减压蒸发，将糖液浓缩为原来的 1/ 6 倍( 按体积 ) ，并将析出的 CaCl2过滤排除。2.2.5 脱色浓缩后的浆液色泽较深 ，利用活性炭 ( 用量为糖液的 10% )进行脱色处理 ，将糖液加热到 7580 ，调控 pH 为 3. 5 左右，边搅拌边加入活性炭，过滤、脱色后糖液透明度(折光度)为 30 %40 %。2.2.6

42、 离子交换为了进一步净化糖液 ，提高产品质量 ，需进行离子交换 ，经试验测试选用 723 型强酸性阳离子树脂和强碱多孔阴离子树脂(阳树脂 阴树脂 阳树脂 阴树脂)配套使用.可使糖液透明度(折光度)达95% 97% ，使糖液呈无色透明状.2.2.7 加氢将糖液升温加压，通入 10 %的氢气催化，使木糖的羰基变成羟基。2.2.8 浓缩、结晶、分离出料压入结晶机，当温度降至65 左右时加入晶种，慢慢搅拌结晶，以每小时降1 至室温即可得产品。2.2.9 母液处理母液为结晶分离成品后的副产品，每1 t 成品可得70 % 浓度的母液 1 t ，母液。2.3 分析方法2.3.1木糖及木糖醇的测定发酵终止时，

43、取样品离心，用HPLC法分析上清液中木糖及木糖醇含量。检测条件为：HITACHI公司 L - 7490视差折光检测器：DIKMA公司Inerrtsil NH2色谱柱（4.6150 mm，5m）；柱温35 ；流动相：V（乙腈）：V（水）= 82.5:17.5，流速1.0 mL / min，进样量2.5 L。木糖和木糖醇标样均购自Sigma公司。木糖醇转化率为测得的木糖醇浓度与培养基初始木糖浓度之比。2.3.2菌体干重的测定取10 mL 发酵液，2500 r / min 离心10 min，去上清液。剩余菌体用去离子水洗涤，于120 烘箱中干燥24 h， 称重。3.设计3.1 培养条件对发酵的影响3

44、.1.1 种子龄的影响为了找到合适的种子龄，本实验取了20 h、22 h、24 h、30 h 分别进行对比实验， 发酵液的初糖浓度为9.53 g / L，3.1.2 接种量的影响接种量必须适中， 因为接种量过小， 会使发酵时间延长， 木糖醇的得率下降; 而接种量过大也会由于在发酵初期消耗过多的底物和其他营养成分而不利与木糖醇的积累。为了找到最适的接种量， 取培养了20 h 的液体种子5 mL、7.5 mL、10 mL 接入装有100 mL 玉米芯水解液的发酵培养基的250 mL 三角瓶。发酵液的初糖浓度为38.5 g / L，3.1.3 初糖浓度的影响初糖浓度对发酵也有很大的影响，初糖浓度大时

45、用于菌体生长的糖比例相对较小，有利于木糖醇的生产，但糖浓度过大又会导致底物抑制。实验中取40、60、80 g / L 的初始糖液，接入5% 的液体种子，初始pH 值为5.5， 装液量为100 mL，转速为200 r / min，发酵时间为3 d。3.1.4装液量的影响实验中采用，在250 mL 的三角瓶中50mL、75mL、100 mL 的不同装液量进行发酵，摇床转速为180 r / min，pH 值5.5，发酵液的初糖浓度为38.68 g / L， 发酵时间2 d。3.1.5 氮源浓度的影响为了确定比较理想的氮源浓度，在100 mL的水解液中分别加入2.5mL、5.0mL、7.5 mL 含有

46、50g / L 酵母浸膏和50 g / L 蛋白胨的氮源进行发酵。发酵液初始糖浓度为37.98 g / L。3.1.6 初始 pH 值的影响在保持其他条件不变的前提下，取初始pH值4.0、5.0、6.0，进行发酵实验。发酵液初始糖浓度为38.78 g / L。3.1.7 温度对玉米芯水解液发酵的影响在其他条件固定的前提下，采用不同的温度条件，取温度为28、30、32 恒温发酵。发酵液的初始糖浓度为38.21 g/L。3.1.8正交实验根据以上七个单因素实验，我们能确定并选择出合适的假丝酵母发酵生产木糖醇的工艺参数范围。为确定木糖醇生产工艺中各个参数的效应和交互作用，选择出最优水平组合，我们以木

47、糖及木糖醇的含量以及菌体干重做为评价指标，选择采用正交表进行正交试验，优化深加工玉米生产木糖醇的工艺参数，确定影响木糖醇生产效果的各因素的主次顺序，得出最佳的因素水平组合。表1 因素与水平设计正交表因子ABCDEFG水平种龄(h)接种量(mL)初糖浓度(g/L)装液量(mL)氮浓度（g/L）pH温度（）120540502.54.0282227.560755.05.03032410801007.56.032表格5号字正交实验的测定可帮助我们找出深加工玉米制木糖醇的有关七个变量(种龄、上接种量、初糖浓度、装液量、氮浓度、pH、温度)的最佳条件，得出木糖醇生产的优化参数，以及各因素对木糖醇生产量所起

48、作用的重要程度。4.分析与总结4.1分析展望目前全球木糖醇总产量约为6万吨，而年需求量在l0万吨以上。每公斤木糖醇报价为3045元。主要生产国按产量排位依次有：中国、芬兰、俄罗斯、美国、意大利和日本。我国木糖醇生产已有40多年历史，目前主要有浙江华康、山东福田、河北奥翔和河南豫鑫等骨干企业，截至2003年末，我国木糖醇总产量已达26万吨，其中8090 用于出口。据中国海关2006年末公布统计数字，木糖醇已占我国万吨级生物产品出口排名第3位，占国际市场总销量“半壁江山”。随着国内销售量以年约10 速度递增，国内潜在市场令人乐观。国际上木糖醇商品化生产几乎全靠化学方法，其工艺也相对成熟。与之相比，

49、木糖醇微生物发酵法以其条件温和、操作简便、副产物少、环境污染低等优点成为研究热点；但木糖醇得率、质量浓度和生产能力一直是限制大规模发酵生产“瓶颈”问题。目前为止，尚无大规模发酵生产木糖醇报道，发酵罐放大技术仍停留在经验和中试阶段。通过分析木糖醇合成代谢途径，加强代谢工程菌改造，同时研究影响木糖醇发酵生产因素及其相互关系，最终优化发酵工艺，是提高木糖醇产量和转化率、进而扩大生产关键。可预见，微生物发酵生产木糖醇有着广阔市场前景和良好社会效益，最终将会改变木糖醇生产世界格局。木糖醇属于低热量多元醇，无细胞毒性，可透过细胞膜供给组织利用。在机体代谢过程中不需胰岛素参与，反而可促进少量胰岛素分泌，促进

50、葡萄糖向肝糖原转化，降低转氨酶水平，是辅助治疗糖尿病和肝病良好营养剂。其作为食品工业重要甜味剂之一，常温下其甜度与蔗糖相当，且具有较大溶解热，口感清凉，广泛用于糖果、饮料和糕点等生产。作为微生物不良培养基，具有良好防龋齿功效；因本身不含羰基，具有较强化学稳定性，可有效延长食品保鲜期；具有一定吸湿性，可用于烟草调香和保湿，及作香精缓释剂；可合成重要非离子表面活性剂，如木糖醇硬脂酸酯、XO - 80等，还常常用作塑化剂、热载体和防冻液。此外，木糖醇还用于皮革加脂、蓄电池电极板浸渍等。总之，木糖醇在医药、食品、化工等领域具有极其重要应用价值 。木糖作为一种无热量糖，是所有食用糖中生理活性比较好的品种

51、。它在不增加血糖值、增值双歧杆菌作用方面都显示了比其他糖醇的优越性。此外，还具有减少体内游离脂肪酸，调整脂类代谢的作用，有利于控制体重，防止肥胖症。它除了用于制备木糖醇及饲料酵母外，还广泛用于化工、医药、染料等工业部门。木糖在国外从20 世纪90 年代起已得到广泛应用，但世界上生产木糖的国家主要是少数工业发达的国家，且产品价格较高，主要销往一些发达国家。木糖主要通过无机酸水解农业废料来制取。一般农业植物纤维废料如玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣、稻壳以及其他禾秆等均是制取木糖的好原料。其中农业植物废料玉米芯具有来源广泛、产量大、易于加工、木糖收率高等特点，是制取木糖的极好原料6。目前，国内外工业生产木糖

52、工艺都存在着不足木糖醇生产主要有直接萃取、化学合成和生物转化等三种方法。由于天然果蔬中木糖醇含量极低，直接萃取木糖醇成本昂贵，目前，商品木糖醇生产主要采用化学加氢法。该技术颇为成熟，但由于工艺复杂、耗能高、收率低(木糖转化率在5060)、污染环境等因素限制木糖醇工业化生产。若通过微生物发酵生产木糖醇可避免剧烈化学反应，也不需高压耐腐蚀设备，易于分离纯化，降低生产成本，其过程产生良好社会经济效益，因而受到广泛关注。4.2总结体会有关木糖醇生产工艺优化的课程设计此次是第一次做，但是很早之前就对该方面内容的研究有浓厚的兴趣，因为在工艺课中我们学到生产工艺优化的过程是生物产品生产中资金投入占比重很大的部分。工艺的好坏优劣直接决定了产物的收率和纯度，因此也直接决定了生产的效率。木糖醇具有很高的药用价值。包括辅助治疗糖尿病