实验十 植物DNA抽提

1、实验实验10、植物、植物DNA的抽提和酶切的抽提和酶切掌握植物总DNA的抽提方法和原理一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理 植物的各个部位都可用作总DNA的抽提材料，但常用的材料为植物叶片和幼苗。为了获得高纯度的DNA，用作抽提材料的植物幼苗，最好先在黑暗的条件下放置几天，以消除叶绿素的影响。 植物总DNA的抽提方法有多种，不同的植物都有最合适的抽提方法。但各种方法的基本原理都一样，其原理是先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基肌酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadeyltrimethyl ammomum bromide，CTAB）、十二烷基硫酸钠（

2、sodium dodecyl sulfate，SDS）等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂，进入细胞核内的表面活性剂解聚核中的核蛋白（并与蛋白质形成混合物）；再加入酚和氯仿等表面活性剂，使蛋白变性；经离心除去植物的组织和变性蛋白；上清液中加入无水乙醇或异丙醇使DNA沉淀；沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。植物植物DNA提取主要方法：提取主要方法：SDS法、法、CTAB法法CTAB：十六烷基三乙基溴化铵，是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与十六烷基三乙基溴化铵，是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7

3、mol/L）是可溶的，当降低盐浓度）是可溶的，当降低盐浓度到一定程度（到一定程度（ 0.3mol/L ）时，从溶液中沉淀，通过离心就可以将）时，从溶液中沉淀，通过离心就可以将CTAB与与核酸的复合物同蛋白质、多糖等物质分开，然后再将核酸的复合物同蛋白质、多糖等物质分开，然后再将CTAB与核酸的复合与核酸的复合物溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀（物溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀（CTAB能溶于乙醇）。能溶于乙醇）。与与SDS法相比，最大的优点就是能很好的去除糖类杂质。多糖类杂质的去法相比，最大的优点就是能很好的去除糖类杂质。多糖类杂质的去除主要是通过高盐缓冲液的选择性沉淀。除主要是通过

4、高盐缓冲液的选择性沉淀。SDS法：法：十二烷基磺酸钠，操作简单、温和，也可提取到分子量较高的十二烷基磺酸钠，操作简单、温和，也可提取到分子量较高的DNA，但所得产物含糖类杂质较多，所提，但所得产物含糖类杂质较多，所提DNA也可直接用于也可直接用于Southern杂杂交，但内切酶消化时需加大限制性内切酶用量，并适当延长反应时间。交，但内切酶消化时需加大限制性内切酶用量，并适当延长反应时间。PVP：聚乙烯吡咯烷酮，可与多酚类物质结合。聚乙烯吡咯烷酮，可与多酚类物质结合。水稻基因组大小约水稻基因组大小约400Mb四、仪器设备四、仪器设备五、实验用具五、实验用具恒温培养箱 高速台式离心机（冷冻式或非冷

5、冻式） 旋涡振荡器 电泳装置2套 液氮罐冰盒 微量离心管 移液器 吸管头若干1.5毫升离心管架1个 研钵三、实验材料三、实验材料转基因和非转基因水稻叶片六、试剂六、试剂无水乙醇, 70%乙醇 氯仿 琼脂糖 异丙醇TBE电泳缓冲液 TE缓冲液（pH 8.0） 10 mg/ml的RNaseA溶液3 M 乙酸钠（NaAc）SDS法DNA抽提缓冲液（配方如下）：水稻基因组水稻基因组DNA的微量抽提的微量抽提DNA细长，因为分离纯化过程不可避免有降解，无法分离纯化出其细长，因为分离纯化过程不可避免有降解，无法分离纯化出其完整分子，得到的只是完整分子，得到的只是DNA分子的片段。用于分子的片段。用于Sou

6、thern杂交的植物杂交的植物DNA样品在长度上应不小于样品在长度上应不小于50 kb，即琼脂糖凝胶电泳中与，即琼脂糖凝胶电泳中与 DNA迁迁移率一致（并非大小一致，而是普通琼脂糖凝胶分辨率所限）。移率一致（并非大小一致，而是普通琼脂糖凝胶分辨率所限）。为避免机械剪切为避免机械剪切DNA分子，提取分子，提取DNA时应该把吸头的尖端剪掉一部时应该把吸头的尖端剪掉一部分（剪刀用分（剪刀用70%乙醇清洁），而且吸取上清的时候动作要轻缓。乙醇清洁），而且吸取上清的时候动作要轻缓。1.将水稻叶片约0.10.2 g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将叶片研磨成粉状；将粉末倒入2ml离心管中。注意：动作迅速，不

7、要让粉末解注意：动作迅速，不要让粉末解冻。冻。2.加入0.8毫升在65水浴中预热的抽提缓冲液，混匀，放入65水浴中保温2030分钟 (期间每隔5分钟轻轻摇动一次离心管)。3.加入0.8 ml氯仿:异戊醇:乙醇（76：4：20），混匀后，平放在振荡器上摇动10分钟（振荡频率以抽提液与氯仿完全混合为度）。4.离心15分钟（12000 rpm、20），将上清液吸入一个新的2 ml离心管（记录体积）。5.加入1/10体积的3M NaAc和等体积的冷异丙醇，轻轻混匀，静置5 min。6.12000 rpm离心5 min收集沉淀。弃上清，用0.5 ml 70%乙醇洗沉淀两次，每次12000 rpm离心5

8、min。弃乙醇后短暂离心用移液器除去乙醇后于热板上（45 ）干燥1 min。7.加入100 ul 1TE溶解沉淀，并与65下保温10 min，期间混匀几次。加5 l 10 mg/ml 的RNaseA，37度消化1小时，之后直接纯化或于-20冰箱保存。 水稻基因组水稻基因组DNA的微量抽提的微量抽提-SDS法法七、实验步骤七、实验步骤1.合并所提DNA，调整体积到300ul，然后加入等体积的酚/氯仿，充分轻柔上下翻转混匀10分钟，之后于12000rpm离心10min。吸取上清到另一支1.5mL离心管，加入等体积氯仿抽提10分钟，之后于12000rpm离心10min （4度） 。2.吸取上清到另一

9、支1.5mL离心管，再加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍上清体积的预冷的无水乙醇，混匀后置于-20冰箱中15min，取出后12000rpm离心10min（4度）。3.去尽酒精，用500L 70乙醇洗涤沉淀，12000rpm离心2min（4度） 。4.去尽酒精，风干，溶解于20L-30uL 1TE（可先在热板上预热到65 ）中。5.电泳检测，取1ul DNA稀释10倍，之后取1ul 稀释的DNA配制点样体系：1L DNA8L dH2O1L 10loading buffer。用未酶切的 DNA作为DNA分子量标记和定量marker。注：氯仿抽提时，要保证抽提液中有一定的盐溶液，否则注：氯仿

10、抽提时，要保证抽提液中有一定的盐溶液，否则DNA进入沉淀。进入沉淀。水稻基因组水稻基因组DNA 纯化纯化在氯仿中加入0.3%乙醇可以消除挥发在空气中的毒性。氯仿毒性主要体现在两个方面：（1）本身是有毒的，其蒸汽挥发到空气中造成污染；（2）在光照下会和氧气缓慢反应，产生毒性更大的气体光气。所以，氯仿在成品售出前，首先要用深色玻璃瓶封装，防止产生光气；其次要加入少量的乙醇，乙醇会和光气反应生成无毒的碳酸二乙酯。另外，乙醇等无毒物质覆盖在氯仿的液面上还能防止氯仿本身的挥发。氯仿氯仿水稻基因组水稻基因组DNA的酶切的酶切酶切体系：40-50ul （用1.5ml的离心管）10M-buffer：4ulHi

11、nd III: 2ul (15U/ul)水稻基因组DNA：5ug（同位素方法3ug即可）ddH2O：补平体积到40ul 酶切条件：37 过夜酶切（注：不同物种酶切时间不同，如小麦4个小时足够了！)KanrLBRBpBR322 oripVS1 ori35st HPT P35SNos3pOxEcoRIEcoRIPubiScaIgtttggtgttacttctgcagggtaccggcgcgccaagcttactagtacgcgttatggatcctatcaPst KpnSpeHindMluBamH注： Pubi与克隆位点之间没有起始密码，因此正义表达的目的基因要保留起始密码ATGcaga原Ubiquitin的起始密码位置用于转基因的植物双元载体：用于转基因的植物双元载体：pOx思考题思考题1、简述SDS法抽提植物DNA的原理。抽提过程中