基因的克隆与表达-2005

1、基因的克隆与表达基因的克隆与表达山东大学医学院免疫学研究所 马春红基因工程（基因工程（Genetic engineering,Ge)Genetic engineering,Ge): :通通过体外重组技术过体外重组技术, ,人为操作基因、改造基人为操作基因、改造基因，改变生物遗传性状的过程。因，改变生物遗传性状的过程。 基本手段基本手段：分子生物学技术：分子生物学技术 （体外重组、杂交、电泳等）（体外重组、杂交、电泳等） 目的目的：基因克隆：基因克隆 基因表达基因表达主要内容基因工程的克隆载体基因工程的克隆载体(genetic cloning vector)基因克隆基因克隆(gene clong

2、ing)基因表达基因表达(gene expression) -原核基因表达原核基因表达 -真核基因表达真核基因表达 第五章第五章 基因工程的克隆载体基因工程的克隆载体Genetic Cloning VectorGenetic Cloning Vector基因工程的目的基因克隆基因克隆-获得目的基因基因表达基因表达-使受体的新性状表现，获得大量目的蛋白In vivo expressionIn vitro expression。载体载体-基因工程中的重要工具基因工程中的重要工具载体载体(vector)(vector)：携带外源DNA进入宿主细胞的工具载体的功能载体的功能 1.运送外源基因高效转入受

3、体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供条件 载体的两种扩增方式载体的两种扩增方式-自主复制型载自主复制型载体和附加载体体和附加载体克隆载体（克隆载体（cloning vector) 定义定义 特点特点 常用载体介绍常用载体介绍第一节第一节 概述概述一、概念一、概念克隆载体（克隆载体（cloning vector)cloning vector)：用于携：用于携带目的基因（外源基因）进入受体带目的基因（外源基因）进入受体细胞进行复制、扩增的工具。细胞进行复制、扩增的工具。二、特点二、特点1、能独立复制，具有复制子（、能独立复制，具有复制子（replican)rep

4、lican：基因组中能独立复制的最小单：基因组中能独立复制的最小单位，含复制起始点（位，含复制起始点（ ori)和复制终点。和复制终点。 DNA的复制由的复制由ori控制控制原核细胞的染色体和质粒有固定的原核细胞的染色体和质粒有固定的ori真核细胞的染色体有多个真核细胞的染色体有多个ori2 2、属于松弛型复制子、属于松弛型复制子3 3、具有、具有复制非必需区复制非必需区4 4、有一个或多个单一酶切位点，即多克隆位点、有一个或多个单一酶切位点，即多克隆位点多克隆位点（多克隆位点（Multiple cloning site,MCSMultiple cloning site,MCS）：一段人工合成

5、的一段人工合成的DNADNA序列，其上含有密集排列序列，其上含有密集排列的多种单一限制性内切酶位点，以利于不同来的多种单一限制性内切酶位点，以利于不同来源的外源源的外源DNADNA插入载体。插入载体。5、具有筛选标记、具有筛选标记6、分子量合适（、分子量合适（3-10kb)7、高拷贝数、高拷贝数 拷贝数（拷贝数（copy):一个细胞内存在的一个细胞内存在的 分子数分子数8、生物安全性好、生物安全性好三、常用克隆载体种类三、常用克隆载体种类质粒（质粒（plasmid)plasmid) 噬菌体（噬菌体（bacteriophage bacteriophage ) )粘粒（粘粒（cosmidcosmi

6、d）M13M13噬菌体（噬菌体（bateriophage M13bateriophage M13）人工染色体人工染色体第二节第二节 常用克隆载体介绍常用克隆载体介绍一、质粒（一、质粒（plasmid)（一）（一） 一般特性一般特性Plasmid：染色体外能够进行自主复制的遗传单位。染色体外能够进行自主复制的遗传单位。 包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)分子。现在习惯上用来专指细分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNADNA分分子。

7、在基因工程中质粒常被用做基因的载体子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体 多为环状双链多为环状双链DNA 可自我独立复制可自我独立复制 天然存在：天然存在：F质粒、质粒、R质粒等质粒等（二）分类（二）分类 大小：小型质粒大小：小型质粒( 15kb ) 大型质粒大型质粒( 60kb) 功能：功能：F质粒、质粒、R质粒质粒 宿主：窄宿主范围质粒：宿主：窄宿主范围质粒：ori特异，仅能特异，仅能在一种宿主中复制在一种宿主中复制 宽宿主范围质粒：宽宿主范围质粒：ori不特异，可不特异，可在多种宿主中复制在多种宿主中复制 复制类型复制类型： 严紧型质粒：复制受宿主细胞的严格控制严紧型质粒：复制受宿主细胞

8、的严格控制 低拷贝数（低拷贝数（1-2copies/cell)松弛型质粒松弛型质粒：拷贝数高：拷贝数高(10-200 copies/cell) 复制仅需复制仅需DNA聚合酶聚合酶I，不，不 需蛋白质合成需蛋白质合成 宿主细胞蛋白质合成及染色宿主细胞蛋白质合成及染色体复制停止时，可大量扩增至上千份体复制停止时，可大量扩增至上千份（氯霉素氯霉素） 构型构型： 超螺旋型（超螺旋型（supercoiled circle,SC)supercoiled circle,SC)or or 共价闭环双股共价闭环双股DNA( covalently DNA( covalently closed circle,CCC

9、)closed circle,CCC) 开环型（开环型（opened circle,OCopened circle,OC） 线形（线形（linear circle,LC)linear circle,LC)（三）克隆质粒的构建（三）克隆质粒的构建1 1、构建质粒的目的、构建质粒的目的调整质粒结构、提高转化率调整质粒结构、提高转化率2 2、常用手段、常用手段：减小分子量减小分子量引入引入MCSMCS引入具有多种用途的辅助序列引入具有多种用途的辅助序列向天然质粒中引入选择标记向天然质粒中引入选择标记, pSC101多个质粒重组，增强选择标记，过大，多个质粒重组，增强选择标记，过大，pBR313减小复

10、制非必需区，减小复制非必需区，缩小分子量缩小分子量，pBR322调整质粒结构，提高载体序列调整质粒结构，提高载体序列（减小分子量、引入（减小分子量、引入MCS及辅助序列）及辅助序列）3 3、克隆质粒的发展趋势、克隆质粒的发展趋势单标记、复制效单标记、复制效率低率低双标记，双标记，50%以上以上的复制非必需区的复制非必需区 物理图谱物理图谱（phisical map) 物理图谱（物理图谱（physical physical map): map): 在在DNADNA分子上标分子上标明限制性内切酶位点、明限制性内切酶位点、数目、排列顺序及特数目、排列顺序及特征性功能标记的图形。征性功能标记的图形。又

11、称为限制图谱又称为限制图谱（restriction map)restriction map)载体物理图谱识图要求载体物理图谱识图要求1 1、载体大小、载体大小2 2、载体类型、载体类型3 3、载体组成、载体组成4 4、载体主要元件（特点）、载体主要元件（特点）及其应用及其应用（四）常见人工构建质粒的分类（四）常见人工构建质粒的分类: :人工构建的质粒根据其功能及用途分为人工构建的质粒根据其功能及用途分为: :1.1.多拷贝质粒多拷贝质粒 复制子经过人工突变，除去控制拷贝数复制子经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用

12、于扩增外源基因。扩增外源基因。2.2.测序质粒测序质粒3.3.整合质粒整合质粒 装有整合促进基因及整合特异序列，便于装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上4.4.穿梭质粒穿梭质粒 含有两个不同的复制子，能在两种不同的含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制受体细胞中复制5.5.表达质粒表达质粒 装有强的启动基因，合适的顺序以及有效装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达达（五）常用质粒介绍五）常用质粒介绍质粒命名原则质

13、粒命名原则4.36kb双标记双标记分散的多个单一酶切位点分散的多个单一酶切位点插入灭活插入灭活双抗菌素对照实验双抗菌素对照实验1 1、 pBR32277pBR32277年年BoliverBoliver构建构建插入失活、双抗菌素对照实验插入失活、双抗菌素对照实验pBR322衍生质粒衍生质粒2 2、 pUC18/19pBR322pUC18/19pBR322的重要衍生质粒的重要衍生质粒1983年构建：年构建：pBR322+M13基本元件：基本元件：ori Ampr MCS 辅助序列：辅助序列： lacZ基因编码基因编码 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶lacI基因编码阻遏蛋白基因编码阻遏蛋白,使使lacZ不能

14、表达不能表达 诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,lacZ表达表达乳糖操纵子乳糖操纵子乳糖操纵子的表达调控乳糖操纵子的表达调控pUC载体载体(含含lacZ、lacI基因）基因）诱导物诱导物(IPTG)lacZ表达表达 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端片段（端片段（ -肽）肽）宿主细胞宿主细胞lacZ M15缺陷型缺陷型 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶X-gal变兰色变兰色pUCpUC载体蓝白斑筛选的原理载体蓝白斑筛选的原理-插入失活插入失活1 1pUC载体载体(含含lacZ、lacI基因）基因）外源基因插入外源基因插入lacZ失活失活不产生不产生 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端端片

15、段（片段（ -肽）肽）X-gal不变色，呈白色不变色，呈白色pUCpUC载体蓝白斑筛选的原理载体蓝白斑筛选的原理-插入失活插入失活2 23 3、 pGEMpGEM系列系列pGEM-1pGEM-1MCSMCS两侧有两侧有SP6SP6、T7RNAT7RNA聚合聚合酶启动子酶启动子pGEM-1MCSpGEM-1MCS两侧有两侧有SP6SP6、T7RNAT7RNA聚合酶启动子聚合酶启动子1 1、可进行体外转录、可进行体外转录转录具有特异性转录具有特异性可分别转录插入片段的两条链可分别转录插入片段的两条链转录产物可制备转录产物可制备体外翻译的模板、体外翻译的模板、探针及反义探针及反义RNARNA2 2、

16、为插入片段的测序提供特异引物位、为插入片段的测序提供特异引物位点点pGEM-3/4Z-MCS位于位于lacZ基因内部基因内部插入失活插入失活蓝白斑筛选蓝白斑筛选具有具有SP6、T7启动子启动子pGEM-3Zf(+)/(-)-引入丝状噬菌体引入丝状噬菌体f1(+)/(-)复制起始点复制起始点 可以产生单链可以产生单链DNA，并，并分泌至上清中，便于对分泌至上清中，便于对插入片段进行测序插入片段进行测序 F1的方向的方向(+/-)决定复制决定复制哪一条链哪一条链4 4、 T-vectorT-vector用于用于PCRPCR产物的直接克隆产物的直接克隆载体DNA两条链的5端有一个游离的T：PCR产物

17、的直接克隆SP6、T7启动子：体外转录、为克隆产物的测序提供特异性引物插入位点两侧的酶切位点：为回收克隆片段进行亚克隆提供便利的酶切位点5 5、pCDNA3-pCDNA3-穿梭载体穿梭载体穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector)shuttle vector) 即可以携带外源基因在原核细即可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体中表达的载体。小小 结结质粒的发展趋势：质粒的发展趋势：调整质粒结构、提高载体效率：减小分子调整质粒结构、提高载体效率：减小分子量、引入量、引入MCSMCS引入多种用途的辅助序列引入多种用途的辅助序列: :

18、lacZlacZ、lacIlacI基因：基因：蓝白斑筛选蓝白斑筛选SP6SP6、T7RNAT7RNA聚合酶启动子：聚合酶启动子：体外转录体外转录F1F1复制起始点：复制起始点：产生单链产生单链DNADNA真核启动子：真核启动子：穿梭载体穿梭载体二、二、 噬菌体载体噬菌体载体（一）（一）噬菌体的分子生物学噬菌体的分子生物学1 1、噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和白和-DNA-DNA组成组成2 2、-DNA-DNA：线状双链线状双链DNADNA分子，全长分子，全长48.5kb48.5kb两端各有一个两端各有一个1212核苷酸的互补单链（粘性末核苷酸的互补

19、单链（粘性末端，端，GGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGA，称为，称为 CosCos位点（位点（cohesive endcohesive end）或或coscos区。区。功能相近的基因在基因组中聚集在一起。功能相近的基因在基因组中聚集在一起。 噬菌体生物学性状介绍噬菌体生物学性状介绍3 3、基因组成：、基因组成： CosCos位点（位点（cohesive end)cohesive end)： DNA DNA分子两端各有一个分子两端各有一个1212碱基长的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称碱基长的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称

20、 coscos位点位点 左臂（左臂（编码外壳蛋白编码外壳蛋白）：头部基因（）：头部基因（7 7个）、尾部基因个）、尾部基因（1111个）个） 右臂（右臂（负责裂解宿主细胞、负责裂解宿主细胞、DNADNA自主复制以及调控自主复制以及调控) )：裂：裂解基因（解基因（2 2个）个） 中间段中间段( (控制基因组整合到寄主基因的基因控制基因组整合到寄主基因的基因) )：DNADNA复制复制及溶菌生长非必需区及溶菌生长非必需区（重组基因、正调控基因、负调控（重组基因、正调控基因、负调控基因）、基因）、DNADNA合成基因合成基因coscos位点的作用位点的作用4 4、生活周期、生活周期温和性噬菌体温和

21、性噬菌体（二）（二）DNADNA载体的构建载体的构建建立建立克隆载体前需要解决克隆载体前需要解决2 2个问题：个问题：1 1）包装容量有限）包装容量有限：DNADNA分子只能增加分子只能增加5%5%的大小，意味着只能插入的大小，意味着只能插入3kb3kb的的DNADNA分子。分子。2 2）酶切位点复杂）酶切位点复杂： 基因组非常大，基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过对于每一种酶来讲都含有超过1 1个的识别序个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成列，酶切后产生多个片段，连接不能形成基因组。基因组。 两种解决方案：两种解决方案：1 1）缩短长度）缩短长度：DNADNA上约有上约有40

22、-50%40-50%的的DNADNA片段是片段是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。2 2）修饰酶切识别位点：）修饰酶切识别位点：利用自然选择法获得限制利用自然选择法获得限制性位点缺失的性位点缺失的品系。品系。天然的天然的-DNA-DNA上有多个酶切位点，如：上有多个酶切位点，如：EcoRI 5EcoRI 5个，个，HindIII 7HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。个，这些多余的酶切位点必须被修饰。自然选择法：利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的 DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬

23、菌体，其EcoRI位点缺失了。（三）（三） 噬菌体载体噬菌体载体1 1、基本组成元件、基本组成元件 CosCos位点位点 左臂（头尾基因）左臂（头尾基因） 右臂（裂解基因）右臂（裂解基因） 酶切位点酶切位点噬菌体载体噬菌体载体2 2、类型：、类型：插入型载体：插入型载体：含有单个或多个单一酶切含有单个或多个单一酶切位点供外源基因插位点供外源基因插替换型载体：替换型载体：含有一对或多对酶切位点含有一对或多对酶切位点便于外源基因替换便于外源基因替换插入型载体插入型载体(insertion vector)(insertion vector) 该类载体经改造后的长度为该类载体经改造后的长度为37kb3

24、7kb，为包装，为包装的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段的下限，它本身也能被包装，其允许的插入片段最大为最大为13.9kb13.9kb（54.9-37kb54.9-37kb）。）。 由于该类载体重组与否均可包装，因而为由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（区分重组子与非重组子必须携带标记基因。（0-0-13.9kb13.9kb）gt10gt10：可以携带可以携带8kb8kb的的DNADNA分子，插入位于分子，插入位于cIcI基基因内的单一的酶切位点因内的单一的酶切位点EcoRIEcoRI。插入失活导致。插入失活导致裂解循环，从而很容易识别重组子。裂

25、解循环，从而很容易识别重组子。ZAPIIZAPII：含有多聚接头，可以使用六种不同的含有多聚接头，可以使用六种不同的限制性内切酶插入约限制性内切酶插入约10kb10kb的新的的新的DNADNA分子，通分子，通过过lacZlacZ基因的插入失活鉴定重组子，不能形基因的插入失活鉴定重组子，不能形成蓝色的噬菌斑。成蓝色的噬菌斑。 替换型载体替换型载体(replacement vector)(replacement vector)该类载体经改造后的长度约为该类载体经改造后的长度约为40kb40kb，在非必需，在非必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为1

26、4kb14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb14kb长的长的DNADNA片片段，然后用外源段，然后用外源DNADNA片段取代之。片段取代之。特点：特点：容量大，且有一个下限容量大，且有一个下限：40-14kb=26kb40-14kb=26kb包装下限包装下限为为36.4kb36.4kb，因此其载装下限为，因此其载装下限为10.410.4而上限为而上限为25.5kb25.5kb。 不再需要标记基因不再需要标记基因，因为空载的载体，因为空载的载体DNADNA只有只有26kb26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去。，不可能被包装，因而无法进入受体细

27、胞中去。WES. BWES. B：两个两个 EcoRIEcoRI位点跨越替换位点跨越替换区域，根据分子大小筛选重组子。区域，根据分子大小筛选重组子。 EMBL3EMBL4EMBL4：可以插入可以插入20kb20kb的的DNADNA分子，可利用分子，可利用EcoRIEcoRI、BamHIBamHI、SalISalI替换填充片段，因此替换填充片段，因此可以插入不同粘端的可以插入不同粘端的DNADNA片断。片断。噬菌体载体噬菌体载体3 3、体外包装、体外包装将重组的噬菌体将重组的噬菌体DNADNA分子与噬菌体头、分子与噬菌体头、尾部蛋白混合，通过自动包装，体尾部蛋白混合，通过自动包装，体外组成完整的

28、具有极强感染性噬菌外组成完整的具有极强感染性噬菌体颗粒的过程。体颗粒的过程。噬菌体载体噬菌体载体 外源基因外源基因重组噬菌体重组噬菌体DNADNA替换替换/ /插入插入噬菌体头、尾蛋白噬菌体头、尾蛋白子代病毒颗粒子代病毒颗粒体外包装体外包装宿主宿主转染转染大量扩增目的大量扩增目的DNA DNA 感染力较低感染力较低感染力极强感染力极强噬菌体载体噬菌体载体4 4、用途：、用途： 构建文库，容量大构建文库，容量大5.-DNA5.-DNA作为载体的优点作为载体的优点 1) -DNA1) -DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌能高效感染大肠杆菌2) -DNA2)

29、 -DNA作为载体，其装载外源作为载体，其装载外源DNADNA的的能力为能力为25kb25kb，远远大于质粒的装载量，远远大于质粒的装载量3) 3) 重组重组-DNA-DNA的筛选较为方便的筛选较为方便4) 4) 重组重组-DNA-DNA分子的提取比质粒容易分子的提取比质粒容易 三、三、 粘粒（粘粒（cosmid)cosmid)19781978年构建年构建（一）考斯质粒（一）考斯质粒( (粘粒，粘粒，cosmid)cosmid) ：即含有：即含有-DNA-DNA两端两端coscos区的质粒。区的质粒。-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，约1.5kb长将此DNA片段与质粒连

30、在一起，即cosmid,就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象-DNA一样，被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌考斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞，它的制备与质粒相同。进入细胞后，质粒上的复制子进行复制。由质粒和噬菌体构建而成，同时具备二者的特点：质粒ori-环状复制单一酶切位点选择标记Cos位点体外包装构建DNA文库，容量为2945kb（二）（二） 考斯质粒的优越性考斯质粒的优越性1) 1) 能象能象-DNA-DNA一样体外包装，并高效导一样体外包装，并高效导入受体细胞入受体细胞2) 2) 容量大，如容量大，如coscos区及附近顺序长为区及附近顺序长为1.7 1.7

31、 kbkb，质粒长为，质粒长为3.3kb3.3kb，则该考斯质粒最大可，则该考斯质粒最大可装载装载46.5kb46.5kb的外源的外源DNADNA3) 3) 由于携带质粒的选择标记，便于筛选由于携带质粒的选择标记，便于筛选4) 4) 由于质粒上的多种单一酶切位点，便由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。于克隆。以以cosmidcosmid为载体克隆为载体克隆DNADNA的技术路线的技术路线 四、四、 M13M13噬菌体载体噬菌体载体M13M13噬菌体：噬菌体：E.coliE.coli的丝状噬菌体的丝状噬菌体 闭环正链闭环正链ssDNAssDNA，6.4kb6.4kbM13 M13 生殖周期生殖周期向胞外分泌单链向胞外分泌单链DNADNAM13M13噬菌体载体的构建：噬菌体载体的构建：主要是插入标记基主要是插入标记基因如，因如，lacZlacZ、多克隆位点，消除多余的、多克隆位点，消除多余的酶切位点。酶切位点。M13M13噬菌体载体：用于制备单链噬菌体载体：用于制备单链DNADNA、测序、测序噬菌粒（噬菌粒（Phagemid