凌丹康复方配合DC-CIK治疗白血病临床研究概要

1、凌丹康复方配合 DC-CIK治疗白血病临床研究刘清池吴维海 李刚荣 胡晓东冯新旺 梁春耕武大勇李慧慧宋淑花 马传宝 李建英王荣孝 张慧敏牛景月摘要目的 观察中药凌丹康复方配合树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)治疗白血病的临床效果和安全性。方法 病例选择血液学缓解但未达到分子生物学缓解的白血 病患者或残留白血病检测阳性患者，其中急性白血病19例，慢性粒细胞白血病1例。用血细胞分离机采集患者的外周血单个核细胞,分别培养D(和CIK，然后再混合培养获得DC-CIK,将 DC-CIK经静脉回输给患者，每1520天回输一次，共输注46次。同时服用扶正祛邪中药凌丹 康复方。观察治疗效果与

2、安全性。结果 凌丹康复方配合DC-CIK治疗20例缓解期白血病患者， 达分子生物学缓解，标志基因转阴4例，其中1例为AML1/ETO , 1例CBF/MYH11 , 1例IgH基 因重排，1例bcr/abl;微小残留白血病转为阴性者3例。治疗后3年CR为75 %，中位CR期25月 (1037月)。DC-CIK输注后除5例出现一过性发热，畏寒,无其它严重副作用。结论 中药 凌丹康复方配合DC-CIK细胞治疗血液学缓解后白血病，具有明显清除微小残留白血病细胞的 作用,是血液学缓解后白血病患者合适的选择，静脉输注安全，有较好的临床应用前景。【关键词】白血病，免疫治疗，树突状细胞，杀伤细胞/细胞因子诱

3、导，中药Clinical study of Chinese herbs -ingdan kangfu fang and DC-CIK(dendritic cells and cytok in e-i nduced killer)combi ned treatme nt for leukemiaLIU Qin g-chi,WU Wei-hai,LI Ga ng-ro ng,HU Xiao-do ng,FENG Xi n-wan g,LIANG Chu n-ge ng WU Da-yo ng,LI Hui-hui,SONG Shu-hua,MA Chua n-bao,LI Jia n-yi ng,

4、WANG Ro ng-xiao, ZHANG Hui-min,NIU Jing-yue1,Department of Hematology, Ping an Hospital, 2, Molecular Biology Laboratory of Ping an Hospital, Shijiazhua ng 050021 , ChinaAbstract: Objective: To evaluate the effective ness and safety of Chin ese herbsi ngda n kangfu fang and DC-CIK(de ndritic cells a

5、nd cytok in e-i nduced killer)combi ned treatme nt of leukemia patie nts Methods: Selected 20 patie nts achieved hematological complete remissio n(HCR) but not achieved molecular biological remissio n(MBR) or mi ni mal residual Leukemia (MRL) positive.Am ong 20 patie nts 19 cases with acute leukemia

6、 and one cases with chronic myelocytic leukemia. Used COBE Separator to separate the peripheral blood mono cyte of the patie nts to Culture DC and CIK respective,a nd the n mixed to Culture, and the mixed cultures were in trave nous injected to the patients self. Once every 1520days to intravenous i

7、nject,and the total were 46. All patie nts were adm ini stered orally with Chin ese herbsl in gda n kangfu fang every day. To observed the effective ness and safety R esults:I n 20 patie nts received the treatme nt of Chin ese herbs -in gda n kangfu fang and DC-CIK ,4 case achieved MBR,that marked g

8、ene cha nge n egative including 2 AML1/ETO,1 CBF B /MYH11and 1 bcr/abl,and 3 case (all were acute non-lymphocytic leukemia-M 2) MRL change negative. The 3 yearsCR probability after Chinese herbs-ngdan kangfu fang and autologous DCCIK s therapy was 80 % in 20 cases in hematological remissio n whe n t

9、he Chin ese herbs-ngda n kangfu fang and autologous DC-CIK were in fused , with the medium CR period 25 mon ths (1C37 mon ths) . Except tran sie nt fever , chill etc , no remarkable作者单位： 1. 河北省石家庄平安医院（ 050021）通讯作者：刘清池， TelEmai:side effects happened during or after AutoC- IKs infusion.

10、C. onclusion:The combined treatment of Chin ese herbsT in gda n kangfu fang and autologous DC-CIK can clear out MRL in patie nts with HCR,and is proper for curing Leukemia. Intravenous infusion of autologous DC-CIK is demonstrated to be safe and has potential clinical prospect.Key words:Leukemia;Den

11、dritic cell; Cytokine induced killer; Chinese herbs； Immunotherapy近年来随着细胞免疫学和分子生物学的发展 , 细胞因子诱导的杀伤细胞 （cytokine induced killer cells , 简称 CIK） 是一种高效、新型免疫活性细胞 ,CIK 细胞用于治疗白血病已经成为白 血病过继免疫治疗的重要手段之一 1-4 。树突状细胞 （dendritic cells, DC） 是目前发现的功能 最强的抗原提呈细胞 ,它通过处理、呈递抗原而介导机体免疫应答。由于许多白血病患者缺乏 功能性 DC 而不能诱发抗原特异性 T 细胞应

12、答 ,故在体外诱导功能性 DC 用于主动免疫治疗 具有重要的临床应用价值5-6。 DC-CIK是分别培养DC与CIK，然后再共同培养，使 DC诱 导 CIK 特异性应答，较单纯 CIK 更完善 2,7。现代中药药理研究发现，许多中药可调节 DC 和 T 淋巴细胞功能 8-9。现今急性白血病的缓解率已达 5090%，但多数患者最终因为残留 白血病（ MRL ）的存在会复发而死亡 10。清除 MRL 是治愈白血病的关键。本研究观察中药 凌丹康复方配合树突状细胞调节联合细胞因子诱导的杀伤细胞（简称 DC-CIK） 治疗血液学缓解后白血病，清除 MRL 的临床效果和安全性。资料与方法1临床资料 20例

13、为 2005年 3 月至 2007年 3 月期间我院收治的白血病患者 （本组病例 不含PML/RAR a阳性急性髓系白血病），均为血液学缓解（CR）期，诊断标准按照 WH急性白 血病诊断分型标准 11。但未达分子生物学缓解，或流式细胞仪检测微小残留白血病阳性。其 中男16例，女4例，年龄1563岁，平均29.6土 10.2岁，病程848个月，平均26.5 9.1月。 包括急性 B 淋巴细胞白血病 （ALL） 5 例,其中复发 ALL1 例,化疗缓解 14年后仍持续 IgH 基因 重排阳性患者 4例；急性非淋巴细胞白血病 14例，其中急性髓性白血病 （AML） M2 型 10 例, AML/ET

14、O阳性急性髓性白血病2例，BCFB /MYH11基因阳性急性髓系白血病 1例,AML-M4 型 1 例；血液学缓解期 bcr/abl 阳性慢性粒细胞白血病 1 例。 DC-CIK 治疗前患者均接受了反 复化疗 ,其中 4 例接受自体造血干细胞移植。2DC-CIK 培养、扩增2.1DC、CIK 细胞的体外分离 在平安医院细胞培养室完成。用 COBE SPECTRA 机 按 Auto-PBSC 程序行血细胞分离 ,采集外周血单个核细胞 （MNC） 。并用淋巴细胞分离液 （ Ficoll ） 再次分离出MNC，用AIM-V无血清培养基调细胞浓度为（46）X106个/ ml，置于37C、5 %CO2培

15、养箱中培养2h。收集非贴壁细胞用于诱导培养 CIK细胞，贴壁细胞诱导分化出成 熟 DC。2.2CIK 细胞培养、 扩增 用含 10%人 AB 血清的 IMDM ，将收集的非贴壁细胞调细胞 浓度为（12）X 106个/ml ,并加入1000U/ml的IFN- a悬浮培养,24h后加入1卩g/ml的CD3单 抗和1000U/ml的rh IL-2 ,每隔3天半量换液1次补充rh IL-2 ,调整细胞浓度始终为（12）X 106 个/ ml 。2.3DC 的体外培养、扩增 MNC 培养 2 h 后的贴壁细胞中 ,加入含 1000 U/ml 的 GM-CSF和1000U/ ml的IL-4的AIM2V 培

16、养液,37C、5 %C02培养箱培养。每3天换液1 次并补充细胞因子，第6天加入上述细胞因子的同时还加入 IL-1 B、TNF-a、PGE-2等细胞 因子诱导 DC 成熟,共培养 89 天。2.4DC与CIK细胞共培养 收获的DC计数后和CIK,按1 : 5混合培养，共培养3天。2.5DC/CIK细胞群表型检测 在DC培养的第9天应用流式细胞仪进行免疫表型分析, 在CIK细胞培养的第9、14、21天分别取少量细胞应用流式细胞仪测细胞表型 QC-CIK培养 物共培养 3 天后测细胞表型。由平安医院分子生物学实验室完成，采用荧光标记的单抗（International Immunotech公司）进行

17、染色，用COULTER EPICS XL型四色流式细胞仪检测， 用 Cell Quest 软件分析数据。3DC-CIK 细胞回输 做细菌、霉菌培养均阴性 ,活性细胞占 95 %,淋巴细胞比例 70 % , 则准备回输DC-CIK细胞。将37 C恒温箱中的DC-CIK回输液（约250 mL）运至病房，立即 快速静脉回输。回输前,地塞米松 5 mg 静脉注射（防止过敏） ,生理盐水 250 mL 回输时前后冲。 当天回输后46 h再输入生理盐水100 mL+白细胞介素2 20万U ,次日起输入生理盐水100 mL+白细胞介素2 20万U , 1次/ d共4 d。每15天20天回输一次，输注46次后

18、判断疗效。4 药物治疗 采用凌丹康复方（组成冬凌草 30、漆谷草20、白英20、 猫抓草 20、旱莲 草30、墓头回 15、丹皮 20、太子参20、黄芪 20、生地黄 20、白术20、当归 20等）。每日 1 剂，水煎服， 90 天以上。5 观察指标及检测方法5.1 临床安全性监测指标 在每次 CD-CIK 输注前后检查肝肾功能、心电图、尿液常规、 大便常规。5.2疗效监测CD-CIK输注次数和输注量；疾病状态；白血病特异基因；残留白血病免疫表型组合。 CD-CIK 回输后复查白血病特异基因、残留白血病免疫表型组合， 如连续2 次均为阴性,每36 个月再检测 1 次; 持续阴性1 年以上,每6

19、12 个月检测1 次， 再检测 2 次。5.3 不良反应监测 在回输 DC-CIK 过程中及回输后每天观察出现的毒性反应。观察项 目及分级参照世界卫生组织规定的急性及亚急性毒性反应标准 12。6疗效判断 血液学缓解标准采用 1987 年全国白血病化疗讨论会制定的标准 13,分子 生物学缓解标准为白血病特异基因阴转，残留白血病免疫表型组合阴转标准为，经四色流式 细胞仪多抗体组合检测白血病细胞w 10-4为阴转。6.1白血病特异基因检测 包括AML1/ETO, CBF 3 /MYH11 , bcr/abl基因，IgH、TCRs 基因重排，由平安医院分子生物学实验室完成，采用多聚酶链反应（ PCR）

20、方法14,15。6.2残留白血病免疫表型组合检测 残留白血病免疫表型组合的设计参照患者发病时 或复发时的免疫表型设计，检测由平安医院分子生物学实验室完成。结果1DC-CIK 输注次数及输注量 20 例共接受 63 次 DC-CIK 治疗,其中 1 例接受 7次治 疗,1 例接受 5 次治疗,15 例接受 3 次治疗,3例接受 2 次治疗。每次回输的 DC-CIK 总数为 1 X 109 26.5X 109,平均（8.7土 3.4）X 10902DC-CIK回输后患者疾病状况本组化疗或/和自体造血干细胞移植治疗后血液学缓解者20例,经用灵丹康复方配合DC-CIK细胞输注，15例CR达3年以上，C

21、CR为75 %。20例中 位CR期28月（1057月 ），3例在两年内复发。灵丹康复方配合DC-CIK治疗后6例患者未再 接受化疗，其余14例患者延长化疗间歇期。说明灵丹康复方配合 DC-CIK治疗有延长缓解期防止复发的作用。3白血病特异基因 白血病特异基因阴转，达分子生物学缓解 4 例，其中 1 例输注 DC-CIK1 次后阴转， 3例3次以上输注后转阴，达分子生物学缓解所需时间 1560天，平均 41.2 18.9天。4例特异基因转阴患者包括1例AML1/ETO阳性急性髓性白血病、1例BCF3 /MYH11基因阳性急性髓系白血病、1例IgH基因重排B细胞急性淋巴细胞白血病（曾间断 化疗4年

22、IgH基因重排仍为阳性）、1例bcr/abl基因阳性慢性粒细胞白血病患者。 达分子生物 学缓解的这例BCFB /MYH11基因阳性急性髓系白血病患者，男性， 24岁，化疗取得缓解后只巩固1个疗程，即采用灵丹康复方配合DC-CIK治疗，DC-CIK细胞输注3次后BCF 3 /MYH11阴转，至今保持阴性达 28个月。 1 例缓解后巩固治疗的 B 细胞急性淋巴细胞白血病患者，坚 持间断化疗 4年， IgH 基因持续阳性， 停用化疗，采用灵丹康复方配合 DC-CIK 治疗 3次， IgH 基因阴转，保持阴性至今达 28个月。可见采用灵丹康复方配合 DC-CIK 治疗白血病 ,对促进 白血病特异基因阴

23、转，取得分子生物学缓解有确切的作用。4残留白血病细胞免疫表型组合 转为阴性水平者 3 例，均为输注 DC-CIK3 次以上者， 阴转所用时间分别为 45 天、 45 天， 60 天。 3 例残留白血病免疫表型组合转为阴性者均为 ANLL-M 2患者。残留白血病细胞免疫表型组合检测表明采用灵丹康复方配合 DC-CIK 治疗白 血病有清除微小残留白血病细胞的作用。5不良反应发生情况回输后4例（4/20）发热，T37. 5C40. 2C。多发生于细胞输注后0. 52h，持续13h消退。可伴有全身乏力、肌肉酸痛，用地塞米松能很快缓解。未见 导致外周血红细胞、白细胞及血小板的明显降低。无肝功、肾功、心肌

24、酶、血糖及电解质的 异常变化。讨论目前, 化疗可使50%90%的急性白血病获得 CR10 。 CR 后如继续化疗或自体造血干细胞移 植治疗,除M3型及儿童标危组B细胞ALL外，其它患者的长期CC率50%，多数单位30%。自 体造血干细胞移植治疗 ALL 1 年内复发率为 50%以上, 甚至可高达 70%。异基因造血干细胞移植 治疗的复发率虽然低 , 但大多数患者不能找到 HLA 配型相合的供者 , 且并发症较多 , 费用高。因 此急性白血病CR后微小残留白血病的清除仍是治疗的难点。 本组化疗或/和自体造血干细胞移 植治疗后血液学缓解者20例,经用灵丹康复方配合DC-ClKffl胞输注，3年CC

25、R概率高达75% 4 例白血病特异基因阴转， 3例残留白血病细胞免疫表型组合达阴性水平，说明灵丹康复方配合DC-CIK治疗有延长缓解期，促进白血病特异基因阴转，清除微小残留白血病细胞，防止复发的作用。新近研究证实，DC与CIK共培养过程中,CIK细胞中CD3+CD8+、CD3+CD56+的比例 较单纯 CIK 细胞有不同程度的增高 ,说明大量成熟 DC 进一步促进了 CIK 细胞的成熟 16,17。 DC-CIK 细胞抗白血病机理 （1）CIK 细胞对白血病细胞的直接杀伤：在体内受某些淋巴因子作 用后， CIK 细胞大量释放具有细胞毒性的胞浆颗粒到胞外，这些颗粒直接破坏瘤细胞。（2）进入体内活

26、化的DC-CIK细胞分泌多种细胞因子如干扰素r、肿瘤坏死因子（TNF-a ）和白介素-2（IL-2）等，不仅对白血病细胞有直接抑制作用，而且还可通过调节免疫系统间接杀伤白血病 细胞。（3）CIK细胞通过表达Fasl可诱导白血病细胞凋亡，CIK细胞由于有抗凋亡基因表达， 因此在体内能抵抗Fasl阳性白血病细胞对CIK的反作用，故CIK能对白血病细胞能持久的发 挥作用。 DC 在体外的培养条件 , 加入当归多糖诱导 CML 原始细胞分化生成的 DC 更成熟 , 激活 T 细胞能力更强 18。大剂量黄芪可提高急性白血病患者外周血单核细胞诱导生成 DC 的 数量并增强 DC 的抗原呈递功能 19。黄芪

27、总甙可调节 T 细胞亚群的比例 ,促进肿瘤细胞的凋 亡20。亡。白血病患者邪毒内蕴，耗气伤阴，加之反复应用化疗，患者脾胃受损，故中医辨证为邪 毒内蕴，气阴两虚。治以益气养阴，清解毒邪。本研究将中医辨证用药与现代药理研究相结 合，组成具有益气养阴、清解毒邪作用的凌丹康复方。本研究表明益气养阴解毒祛邪中药凌 丹康复方配合自体 DC-CIK 细胞免疫治疗血液学缓解期白血病有较好的临床疗效，能够促进白血病分子生物学缓解， 有很好的清除残留白血病 , 防止白血病复发的作用。 其中输注 3 次以 上，疗效更佳。其作用机制不同于化疗，可以清除微小残留白血病，是继造血干细胞移植之 后，又一肿可以治愈白血病的方

28、法，但无造血干细胞移植的风险，无明显毒副反应，医疗费 用低，有很好的应用前景。参考文献1 童春容 ,耿彦彪 , 陆道培 . 自体细胞因子诱导的杀伤细胞治疗急性白血病的临床研究. 北京医科大学学报 ,2000,32(5):473-477.2 Linn YC,Hui KM. Cytokine-induced killer cells:NK-like Tcells with cy-totolytic specificity against leukemiaJ .Leuk Lymphoma, 2003, 44 (9) :1457.3秦福丽综述，张绍林，孙慧审校 CIK细胞的特点及临床应用.2004,3

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