青鳉的人工繁殖及胚胎观察

1、摘要泰 山 学 院本科毕业论文青鳉的人工繁殖及胚胎观察所在学院生物与酿酒工程学院专业名称生物技术申请学士学位所属学科理学年 级二一一级学生姓名、学号指导老师姓名职称完 成 日 期二一五年六月 摘 要本实验对青鳉的人工繁殖与胚胎观察进行了一定的研究。在光照对青鳉产卵的研究中，观察了日夜比18:6、16:8、12:12、8:16等不同光照时间下的青鳉的产卵状况，结果显示在日夜比为16:8的情况下，青鳉的日平均产卵量最大，因此16:8是青鳉产卵的最适宜的光照时间；在温度对青鳉产卵影响的研究中，记录了17、20、26、29和32等不同水温条件下青鳉的产卵状况，结果显示，在水温26条件下，青鳉的日平均产

2、卵量最大，26是青鳉产卵的最适水温；为了更好的了解青鳉胚胎的发育情况，在本次研究中追踪观察了胚胎发育的不同阶段，并详细介绍了不同时期胚胎发育的特点。关键词：青鳉,人工繁殖,生长发育,胚胎观察IAbstractABSTRACTThis experiment for study Medakas artificial propagation and Embryo observed .In the light of medaka spawn in the study, Observe the spawning of medaka with the ratio of day and night 18:6

3、、16:8、12:12 or 8:16, Results show that the ratio of day and night 18:6 is conditions which made Medakas the daily fecundity reached maximum. In the study of the temperature influence the medaka laying eggs, The artificial propagation test was done under the different temperatures of 20,23,26 ,29 and

4、 32 The results showed that under the conditions of 26 ,the daily fecundity of medaka was the largest, 26 is the best temperature for medaka reproductionIn order to understand medakas embryonic development situation, in this study, tracked and looked embryonic development in different stages , and i

5、ntroduced the characteristics of embryonic development in different periods.Key words: medaka, artificial propagation, Growth and development, embryonic observeII泰山学院本科毕业论文目录1引言12亲鱼的培育及鉴别2 2.1亲鱼的培育22.2种鱼的挑选32.3雌雄亲鱼的鉴别32.4产前的强化培育33亲鱼的配对与繁殖33.1人工繁殖33.2不同光照时间长短对青鳉产卵的影响43.3不同温度对产卵的影响54胚胎观察74.1胚胎的培养74.2青

6、鳉胚胎发育过程（26）74.3小结125讨论与结论125.1光照对青鳉亲鱼产卵量影响的实验125.2温度对青鳉亲鱼产卵量影响的实验125.3青鳉受精卵发育过程和图谱（26）12参考文献13致谢14IV泰山学院本科毕业论文（设计）1引言青鳉属于小型的淡水鱼类。成年个体体长一般在20-40 mm之间。其性皮实, 耐受温度和盐分的范围较广, 食性较杂, 极易饲养管理1。在小容器内进行人工饲养亦能正常生长、繁殖, 由于取材方便, 卵粒较大, 因此在日本广泛研究了这种鱼的胚胎发育、遗传变异及生理特征2。近年来又被广泛应用作水生毒理学的实验材料, 还被国际标准组织(ISO) 推荐为毒性实验的标准用鱼之一3

7、。在美国有专门的商店出售青鳉, 以用做实验材料或者养殖观赏。青鳉的英文名称叫Medaka 。其实它在我国华北、华东及华南各地有广泛的分布, 在河流、小溪中，甚至在稻田里，也能找到它们的踪迹。我们在实验室饲养青鳉已有多年历史, 经验证明在粗放的饲养条件下, 能年年繁衍不衰, 不失为毒性实验的好材料。可是, 在我国应用青鳉作为毒性实验研究的工作在过去基本上还没有开展过，估计今后将有序的开展起来。然而，要在实验室稳定的培育出青鳉的幼体和成体以及受精卵，是实施一系列生物实验的基础和关键。同时具资料显示，我国在1926年从菲律宾引进了食蚊鱼4，是为了消灭蚊子，阻断疟疾的传染途径，以达到预防恶性传染病疟疾

8、的目的。但是由于食蚊鱼其生存能力强，且以卵胎生作为繁殖方式，即雌鱼自身就可以产生仔鱼，且刚生产的小鱼就能立刻游泳，摄食。因此繁殖及抗害能力强，对水质要求非常低的食蚊鱼，可以在污水中繁衍生息，同时成群结队的食蚊鱼也会对比自身大一倍的其他鱼类进行攻击。现在，食蚊鱼的存在已经对当地的生态系统造成了严重的威胁。而且，由于食蚊鱼与青鳉鱼占有相同的生态层次且具有相同的食性，因此在生存空间上就产生了剧烈的竞争，但是由于食蚊鱼胎生的繁殖方式优越于青鳉卵生的繁殖方式，这种在繁殖方式上的优胜劣汰，使得青鳉越来越少，因此如何促进青鳉的产卵量与孵化率，已成为当前面临的难题。因此，本实验就是旨在研究光照和温度对青鳉亲鱼

9、产卵量是否产生影响，是否可以通过调节光照和温度来提高产卵量？以使青鳉更好的作为一种模式生物进一步用于实验室研究。同时还观察了胚胎各个时期的发育情况，以掌握胚胎各个时期发育特点， 以作为有关方面的参考。11.1.青鳉的生物学特性(一) 形态与分类 青鳉属鳉形目(Cyprinodontiformes) 青鳉科(Oryzia tidae )青鳉属（Oryzias）5。体长20-40mm,体重0.2-0.3g。口小, 上位; 眼大, 位于上侧, 河北白洋淀一带称之为“大眼贼” 。背部平直。各鳍条数如下: 背鳍6 根; 胸鳍9 根; 腹鳍5 根; 臀鳍16 一20 根。无侧线, 纵列鳞2 7一30 枚。

10、青鳉卵大且透明，卵具油球，卵径约0.9mm，吸水后膜径1.0mm。卵膜上具有长、短两类丝状物，其中短丝数目多，并均匀地分布在整个卵膜上；长丝20余根，集中在一个地方，形成一束。青鳉产卵时，长丝不会完全产出，一头联在卵巢膜上，另一头仍附着在卵膜上。这样，产出的卵不会与母体分离而沉入水中，使卵成串的挂在母体的生殖孔后面。在受精后，卵就粘在母体上进行发育，待大约2小时后就会脱离。青鳉受精卵的培育时间较长，卵内的胚胎在发育完成时才会出膜，是极好的鱼类胚胎发育实验材料。(二) 生长与繁殖 青鳉属卵生鱼类。鱼苗经过2 一5 个月的生长，待体长达到20 mm左右时开始性成熟。天然产卵在4一9 月之间, 6

11、、7、8 月为产卵高峰12。产卵温度范围在16一2 9 , 以2 1一2 6 较为适宜。产卵时间在每天早晨进行。每次产卵数在0一70 粒不等, 一般在2 0一3 0 粒之间居多。产卵多少与温度、光照及食物有密切关系。受精卵上有许多丝状物, 使卵粒互相缠绕在一起附着在腹鳍和臀鳍之间的泄殖孔外，约2 小时以后逐渐脱落。必要时人为取下受精卵, 对亲鱼和鱼卵不会产生什么影响。一条正常雌青鳉在繁殖的季节能产出约3000枚卵。水温控制在2 4 时, 受精卵经过11天左右的培育时间就可以破膜孵出。仔鱼阶段一般进食原生动物或轮虫等,之后逐步转为吃小型的浮游甲壳动物、藻类或其它碎屑等。2亲鱼的培育及鉴别2.1亲

12、鱼培育亲鱼在40x23x25的水族箱中培育，用5W压缩式增氧机一台增氧。青鳉的食性复杂, 摄食广泛。但需要注意的是, 每天要投喂2次, 每次投喂量适中,一定要注意不要过量, 不仅会造成水质污染还会对青鳉的生长产生不利影响。同时，培育箱中的水温变幅为20-27。2.2 种鱼的挑选 当鱼苗喂养至第11周龄时，在同一批次鱼中挑选出成熟的种鱼以供实验所用。挑选时需要注意的是，要挑选的雌鱼要求腹部明显膨大、身体健壮，全长约2-4厘米，平均3.4厘米；雄鱼要求体色鲜艳、身体健壮，体长2.5-4.5厘米，平均3.8厘米。2.3 雌雄亲鱼的鉴别性成熟时, 雌雄鱼有明显的外形差异: 雌鱼体较肥胖, 腹部膨大;

13、产卵季节, 腹鳍与臀鳍之间常附着若干粒受精卵。雄鱼体较细长, 背鳍的后两鳍条之间有明显的凹陷; 且臀鳍较长, 臀鳍和腹鳍上聚集着大量的小黑点, 比雌鱼相应部位的颜色深。且处于繁殖期的雌雄个体是非常容易区分的。(见图1)图一：青鳉雌雄鉴别图2.4 产前的强化培育当青鳉经过一段时间的饲养后待接近性成熟时, 第二性征就会更加明显。从水族箱中网取一部分青鳉亲鱼，然后在筛网布上进行区分雌雄, 之后分别放入培育箱中进行强化培育。水温控制在24 左右, 喂以轮虫、丰年虫等饵料, 投饵率为4% 一6%, 日换水量1/2，以保持水质清新。另外，每天用虹吸管将缸底沉积物清除干净，如发现死鱼，要及时清除掉。避免过量

14、食物和过度拥挤，青鳉一般不易生病。如发现青鳉感染疾病，则要把水族箱彻底清洗，消毒，待注入清水后再把健康青鳉个体放入。3亲鱼的配对与繁殖3.1 人工繁殖人工繁殖定义为在人工控制条件下促使亲体的性产物达到成熟、排放和产出，并使受精卵在适宜的条件下发育成为苗种的过程6。本实验就是控制光照时间的长短和水的温度来研究光照及温度对青鳉亲鱼繁殖的影响。将性成熟青鳉按6 雌4雄及1.5：1的比例放养在适当大小的水族箱中，控制好光照和温度, 即可进行人工繁殖。同时，每个水族箱中都放置捆绑好的水藻，以供亲鱼在其上产卵。水藻的密度要大，且每天早晨要及时进行收卵，以防亲鱼食之。3.2 不同光照时间长短对青鳉产卵的影响

15、3.2.1 分组将性成熟的亲鱼进行随机分组，每组10尾，在相同的温度（24）、食物和水质条件下，改变不同的光照条件。实验共设4组，分别给以以下不同的光照时间：A组（16:8）：白日控制在16小时，黑夜控制在8小时。B组（14:10）：白日控制在14小时，黑夜控制在10小时。C组（12:12）：白日控制在12小时，黑夜控制在12小时。D组（10:14）：白日控制在10小时，黑夜控制在14小时。实验所用的容器为400mm230mm250mm的方形玻璃缸，初始水位高度为200mm。每个玻璃缸放养繁殖期亲鱼10尾，实验连续进行4d。每天定时采用虹吸法将桶底废物吸出，换水50，投饵2次，保证1h之后有少

16、许饵料剩余。实验在温度为 26 下进行繁殖。不同组之间所用的吸管、鱼网等工具要分开使用，以防交叉污染。3.2.2数据实验期间每天观察各组亲鱼的活动情况，记录各组亲鱼的产卵数量。在第 1、2、3d 及时收卵，进行计数并取平均值每天每鱼产卵量（a）=每天产卵总量/6日均产卵量=（1da+2da+3da）/31da表示第一天平均每条鱼的产卵量，其他同理3.2.3 不同光照条件下青鳉的产卵数量表1不同光照条件对青鳉的产卵量的影响1d2d3d平均A38.236.435.336.6B26.73128.628.8C24.922.72624.5D06.753.93.2.4 结果在本实验中，除光照时间不同外，饵

17、料投喂量，温度高低等在各组中保持相同，但在繁殖3天后，各自青鳉的产卵量有所差异。由表1可以看出，青鳉的日均产卵量受光照时间长短影响明显。日均产卵量从大到小排列顺序为A组B组C组D组,其中A组的产卵最大，为40.3粒，大于其他各组；B组与C组两组相近，分别为28.8粒和24.5粒；D组产卵量最小，为3.9粒，同时在实验中发现，光照条件达不到一定要求，青鳉不产卵，或者6条中仅有1、2条产卵且产卵量非常低。实验表明A组的光照时间长度是青鳉最佳的产卵时间且光照达到一定时间，青鳉就可以产卵。3.3不同温度产卵实验3.3.1 分组将性成熟的亲鱼进行随机分组，每组10尾。在相同的光照（日夜比为16:8）、饵

18、料和水质条件下，改变不同的温度条件。实验共设5组，分别设置温度为：1组：水温控制在172组：水温控制在203组：水温控制在264组：水温控制在295组：水温控制在32与控制光照时间实验一样，也是用容器为400mm230mm250mm的方形玻璃缸，初始水位高度为200mm。每个玻璃缸放养亲鱼10尾，且雌雄比例为1.5:1。实验连续进行3d，每天定时做出相应处理，工具分开使用，以防交叉污染。3.3.2 数据实验期间每天观察各组亲鱼的活动情况，记录每组的产卵量。由于青鳉的产卵时间在每天早晨进行，如果取卵不及时会被亲鱼食之，所以取卵时间定在每天7点进行。由于亲鱼所产的卵都是粘着在水藻上，一般是用镊子轻

19、轻的折断水藻进行取卵，并放如清洁的孵化池中，进行计数。为了保证计数准确，我们采取取用亲鱼3天产卵的平均值进行对比，用以减小误差。公式同上。3.3.3 不同温度条件下青鳉的产卵情况表2不同温度对青鳉日均产卵量的影响1d2d3d平均1组10.28.77.58.82组17.320.118.618.73组30.534.931.332.24组18.121.919.219.75组9.87.18.58.53.3.4 结果在本实验中，除水温不同外，饵料投喂量，光照时间的长短等在各组中基本相同，但在繁殖3天后，各自青鳉的产卵的平均量有所差异。这就是说明在其他条件保持不变的情况下，水温的高低，对青鳉的产卵量也有重

20、要的影响。 从表2中我们可以观察到，青鳉的日均产卵量受水温影响明显。日均产卵量从大到小顺序为3组4组2组5组1组,其中26组日均产卵量最大，为32.2粒，大于其他各组；2组与4组两组相近，分别为18.7粒和19.7粒，无明显差异；1组和5组日产卵量最小，分别为8.8粒和8.5粒，也无明显的差异；最终实验表明26是青鳉最适的产卵温度。4胚胎的观察4.1 胚胎的培养本研究采用人工取卵，待青鳉排卵并受精后，用小网兜将雌鱼捞出水面，用手、胶头滴管或镊子将卵串与亲鱼分离开，并将亲鱼重新放入水中。本次实验受精卵采集时间为2015年5月11日早晨，采集数量50枚并放如清洁干净的培养皿中，加水量为培养皿的2/

21、3，放置在温度26的恒温培养箱中，光照为30w的日光灯下进行培养。每天进行取样，并放在体式显微镜下进行观察，记录受精卵的发育状况并连续拍照留存。4.2 青鳉胚胎发育过程（26） 图4.2-1四细胞时期 图4.2-2 桑椹胚期 图4.2-3 原肠胚期 图4.2-4 早期神经胚 图4.2-5 晚期神经胚 图4.2-6 六肌节期 图4.2-7 十二肌节期 图4.2-8 二十四肌节期 图4.2-9三十肌节期 图4.2-10 发眼期 图4.2-11肌节完成期 图4.2-12 心脏发育期 图4.2-13 脾发育期 图4.2-14 出膜期表3 青鳉受精卵发育过程（26）发育时期主要特点发育起止时间1受精卵精

22、子进入青鳉卵子开始，完成受精止，原生质层的皮质小泡开始破裂，动物极先破，后为植物极破裂，受精卵开始变透明0h2 胚盘期原生质移向动物极形成胚盘，上为植物极，此时期油球开始富集。动物极在下有利于胚胎发育0-0.5h3 四细胞期第一次是径向卵裂，胚盘被平分为2个细胞第二次分裂也是径向卵裂，胚盘被平分为四个细胞，细胞直径变小1.5-2h4 桑椹胚期细胞数量增加2倍，细胞变小3.5h-5h5 囊胚期囊胚期时胚盘下陷进入卵黄球，此时某些卵裂球开始不同步的分裂迁移5h-8h6 原肠胚期包括3个时期，在早期原肠胚之前，胚盘开始外包卵黄，早期原肠胚是指胚盘可以覆盖卵黄球的1/4，细胞向外延伸形成胚盾。中期原肠

23、胚是指胚盘可以包围1/2的卵黄球，并在胚盾可以发现神经脊，此时，卵黄开始波动。最后就是卵黄球完全被包裹8h-20.5h7 神经胚期神经胚期分为早期神经胚与晚期神经胚，早期时，神经胚开始出现，同时头部显现。晚期时，大脑和神经索开始出现，头的两侧出现眼囊原基20.5-23.5h8肌节期此时期包括9个不同的小肌节期。二肌节期时，肌节出现在胚胎躯干中，眼芽出现凹痕，耳囊出现，胚孔封闭。四肌节期时，可以辨认前、中、后脑。六肌节期时，视囊分化出视杯和透镜，胚体中央出现神经褶。九肌节期时，心原基呈管状出现在脑下，体腔向后部扩展，黑色素细胞出现，眼睛上出现不完全透镜。十二肌节期时，眼睛的透镜完全形成。十六肌节

24、期时，胚胎可以环绕卵黄球的1/2，心脏开始跳动，居维叶管半循环形成。十九肌节期时，血液循环开始。二十四肌节期时，棕红色的鸟粪素细胞出现，眼睛开始变黑。三十肌节期时，胚胎包围卵黄球2/3，视网膜上色素开始沉积。1d-2d10h9 器官形成期前期时，眼睛的视杯开始变黑，但中央透镜透明，肉眼可观察，腮弓出现血液循环，前肾出现，耳囊内的半视管出现，眼球变得很黑，强光下可以观察到，尾鳍尖还没触碰到瞳孔。中期时，尾鳍尖触碰到眼球且有黑色素集聚，胸鳍内开始出现血液循环，脑部和内脏中都出现了血管，后续尾鳍尖可达到眼睛后缘。后期时，此时心脏发育完全且尾鳍尖已触碰到耳囊，此时消化管开始出现血液循环且围绕心脏的围心

25、腔特别明显，经继续发育尾鳍超过耳囊，胆囊出现2d10h-8d10出膜期此时胚胎已可以破膜而出且尾鳍可以伸展到胸鳍的后方8d-8d15h4.3 小结我国近年来已经进行了剑尾鱼、稀有如卿、金卿、唐鱼等的鱼类实验动物化研究, 并取得进展。经查阅资料我发现，唐鱼胚胎发育(从受精到出膜)划分为7 个阶段: 受精卵胚盘形成阶段, 卵裂阶段, 囊胚阶段, 原肠胚形成阶段,神经胚形成阶段, 器官形成阶段, 孵化出膜阶段等。整个发育过程可以划分为28个时期，而青鳉受精卵经过六大时期（卵裂时期、囊胚形成时期、原肠胚形成时期、神经胚形成时期、器官形成时期、出膜期）和32个具体小时期后，才能顺利发育最终破膜孵化。可见

26、不同的鱼种其胚胎发育时期是不相同的，但主要的阶段是相似的。对青鳉胚胎的观察，可以进一步运用到更深入的研究中，列如低温保存胚胎对胚胎发育的影响，或者用做毒理性实验时可以用来检测某种毒素对胚胎发育的影响等等。5讨论与结论5.1光照对青鳉亲鱼产卵量影响的实验光照对青鳉的繁殖行为非常重要，从本实验中可以看出，光照对青鳉的产卵量影响显著。在光照与黑夜时间为16:8时，达到青鳉亲鱼产卵量的最大值，日均产卵量可达36.6粒；当光照时间长度小于A组时，日均产卵量随之下降，当光照时间为8h时，日均产卵量仅3.9粒；实验结果表明，光照时间小于或等于10h时，青鳉几乎不产卵或产卵极少，可见青鳉是一种喜光照的生物。5

27、.2温度对青鳉亲鱼产卵量影响的实验同时，温度对青鳉的繁殖行为也十分重要，从本实验可以看出，温度对青鳉的产卵量影响显著。26是青鳉鱼产卵的最适温度，26时日均产卵量可达32.2粒；当温度高于或低于26时，青鳉鱼的日均产卵量都会随之下降，温度升至32时，日均产卵量仅8.5粒；当温度下降至17时，日均产卵量仅为8.8粒；实验结果表明，水温高于29或低于20时均不适合青鳉的繁殖。5.3青鳉受精卵发育过程和图谱（26）本实验对青鳉胚胎的发育做了连续的观察，并对每个时段的特点做了简要的描述。结果表明:青鳉受精卵经过了六大时期，即卵裂期、囊胚形成期、原肠胚形成期、神经胚形成期、器官形成期、孵化期，此后才会孵化出仔鱼。参考文献1.陈学文，陈再忠，中华青鳉胚胎低温保存研究，江苏农业科学，201