PUB动物抗血清及其制备技术要点与应用进展

1、 AnimalAnimal Anti-serumAnti-serum andand itsits pointspoints ofofPreparationPreparation TechnologyTechnology andand ApplicationApplicationProgressProgress(WANG Zha n-we，SHAO Guo-qi ng1 )(1. Institute of Veterinary Medicine, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences Key Laboratory of AnimalDiseases D

2、iagnostic and Immunology, Ministry of Agriculture National Center for Engineering Research ofVeterinary Bio-products, Nanjing 210014 China)AbstractAbstract: It is a very important role for anti-serum to control animal disease. This paper are focused on differe nt aspects of ani mal an ti-serum, such

3、 as the developme nt course, prese nt situati on of the products and tech no logy,research progress of preparati on tech no logy and facing problems,etc.KeyKey wordswords : An ti-serum, an ti-serum products,a nti-serum preparati on, preparati on tech no logy动物抗血清及其制备技术要点与应用进展王占伟S邵国青1*(1.江苏省农业科学院兽医研究

4、所农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏 南京210014)摘要：抗血清对于控制动物疫病具有很重要的作用。本文综述了动物抗血清的发展历程，产品技术现状、制备技术要点与最新研究应用进展以及面临的问题等方面。关键词：抗血清，抗血清产品，抗血清制备，制备技术作为动物疫病预防控制的有力武器，兽用生物制品在畜牧业的发展中发挥着越来越重要的作用。而随着科学技术的飞速发展，兽用生物制品也发生了翻天覆地的变化，新技术、新方法的不断出现和广泛应用，为我国兽用生物制品的发展进步提供了强大的助力。兽用生物制品可以分为以下四类：预防用生物制品；治疗用生物制品；诊断检测用生物制品；

5、 免疫调节类生物制品。其中，治疗用生物制品包括抗血清、高免蛋黄抗体、免疫球蛋白及干扰素等。各种生物制品的种类比较多，但是有些产品的质量却不是很高，有待于进一步改进。本文就治疗用生物制品中的抗血清及其在最近几年的研究应用进展做一综述。抗血清又称高免血清或抗病血清，是一种含有高效价特异性抗体的动物血清。抗血清包基金项目：公益性行业(农业)科研专项经费项目(200803020)作者简介：王占伟(1981)，男，河北张北人，硕士，主要从事动物重大疫病研究。通讯作者：邵国青，研究员，TelE-mail: 括抗毒素、 抗细菌、 抗病毒血清。 抗毒素血清： 用细菌类毒素或毒素免疫

6、异源动物所取得的 血清， 如破伤风抗毒素；抗菌血清：用细菌免疫异源动物所取得的血清，如抗炭疽血清； 抗病毒血清：用病毒免疫异源动物所取得的血清，如抗猪瘟血清。1 抗血清的发展历程两个世纪前， 人们将白喉杆菌培养上清中分离到的可溶性毒素注入马体内， 得到的抗血 清可以治疗白喉， 这是第一个用抗体治疗的例子。 经过两百多年的发展， 人们已经可以通过 各种免疫手段来获得针对毒素、 病毒、 细菌乃至癌细胞的特异性抗体。 在我国， 抗血清的研 究利用也比较早。上世纪初，当时的中华民国筹建第一个血清所 青岛商品检验局血清所，一直到抗日战争的先后 20年中， 研究和生产了多种兽用抗血清， 有：牛瘟抗血清、

7、猪瘟抗血 清、猪肺疫抗血清、牛出败抗血清、禽霍乱抗血清、猪丹毒抗血清等1 。建国后，经过近 60年的发展， 抗血清的研究和应用也已经相当成熟。 目前， 对血清抗体的研究已进入新的发展 阶段，即免疫球蛋白的研究和应用。2 产品及技术现状据新版的中华人民共和国兽药典 （以下简称“兽药典” ）可知，国家已经批准生产应 用的抗血清有： 抗气肿疽血清、 抗炭疽血清、 抗绵羊痢疾血清、 抗猪羊多杀性巴氏杆菌病血 清、抗猪瘟血清、破伤风抗毒素、抗猪丹毒血清等，以及抗犬瘟热血清、抗细小病毒病血清 等“非兽药典”产品 2 。与抗血清相并列的高免卵黄抗体也比较成熟，现在市场上的产品有 小鹅瘟精制蛋黄抗体、 鸭病毒

8、性肝炎精制蛋黄抗体、 鸡传染性法氏囊病精制蛋黄抗体， 其中 前两种在药典中已有详细的质量标准。 而针对于动物疫病的免疫球蛋白， 在市场上还没有相 关的产品。 而国外抗体方面的研究和应用要较国内还要早， 且已经上市的产品比国内的产品 更多更全面 3 。相对于人的治疗性的抗体产品，动物的抗血清产品也显得相对不足。虽然抗体产品比较少， 但专利技术却比较多。 经国家知识产权局专利查询网站查实， 到 目前为止，已经公布的动物性抗血清的专利技术已有20余种，卵黄抗体的专利技术 40多种，而免疫球蛋白的专利技术也近 20种。而查询美国知识产权局的网站得知， 近10年美国在抗血 清相关方面的专利有 10多项。

9、3 制备要点及相关技术的研究进展谈到抗血清， 无论是在科学研究中还是在应用实践中， 它都起着很大的作用。 如在研究 中，可用作标准阳性血清； 在临床应用中， 则是一种很好的治疗性抗体。 抗血清的制备技术 虽说目前比较成熟， 但是还会在不同层面上出现各种各样的问题。 结合前人的研究成果， 依 托本项目组的相关研究课题， 总结了一套抗血清制备技术的关键点， 并对最近几年相关的研 究应用进展进行概述。3.13.1 抗血清的作用及其制备理论特异性抗血清可提供相应疫病短期（12周）的被动免疫，效果确实，广泛使用于疫病早期治疗和疫病流行早期与未感染动物的短期预防， 也可抑制引起器官移植死亡的淋巴细胞 活动

10、， 特异性抗血清还可用于疾病诊断与微生物鉴定。 但存在剂量要求大， 保护期短， 价格 昂贵等缺点， 而且需在隔离条件下进行， 以防散毒。 通常对紧急预防的动物， 仍需进行常规 的免疫接种 4。抗血清既可以利用病原微生物抗原免疫同种或异种动物后采血提取血清制备,也可以提取耐过的自然感染动物血清制造。 通常是给动物适当反复多次注射特定的病原微生物或其代 谢产物等物质 （抗原、 免疫原） ，促使动物不断产生免疫应答反应 （体液免疫与细胞免疫） ， 从而使血清中含有大量相应的特异性抗体，然后采（放）血、分离血清制成。具体的制备过 程，各种疾病略有不同， 且已有大量的文献报道 511。下面将着重对作者制

11、备抗血清过程的 各个环节中总结的一些经验进行阐述。3.23.2 抗血清的制备技术要点及研究进展3.2.1动物的选择抗血清制备的第一步，也是比较关键的一步是免疫动物的选择。可作为免疫用的动物多为哺乳类和禽类，主要有家兔、绵羊、马、牛、猪、驴、豚鼠和 鸡等，其中实验常用家兔、绵羊、鸡和豚鼠。张振兴 12总结出，大批抗血清是多用马、牛 生产的，因为一般情况下马、牛具有产量大、成本低、饲养管理方便等优点，在高免中具有 不受接种途径、 接种量与接种次数的限制。 而且最好选择年龄 38岁（或310周岁的阉牛） 经检疫健壮的马、牛进行，且能经采血后继续高免循环利用。根据报道的研究文献， 结合对抗血清制备研究

12、的经验， 在选择动物时要注意以下几个方 面：抗原与动物种系的关系：动物性抗原的免疫原性，随动物种系远近而有差别。近缘动物的蛋白质免疫原性弱， 反之则强。 因此选择动物时应选用亲缘关系较远的动物。 抗血清 的用量： 根据所需要免疫血清的量， 来选择免疫动物。 如是经常大量使用， 选择免疫动物时 则应选择大动物； 若所需的免疫血清量不大， 则以选择小动物为宜。 动物的个体状态： 用 于免疫的动物必须是适龄、健壮、无感染的动物。免疫过程中应特别注意营养和卫生管理。 注射抗原 1 个月后， 动物仍无良好的抗体反应， 或在规定注射日程后抗体效价不高， 可再注 射 l 2 次，若仍不佳者立即淘汰。3.2.

13、2免疫原制备事实说明，选择具有良好的反应原性和免疫原性的抗原， 是作为制备优质抗血清的基础； 而制备优良抗原的关健是选择优良的菌（毒）株，所以应挑选形态、培养、生化特性、血清 学与抗原性、毒力等具有典型性的菌（毒）株作为抗原制造用毒株。张振兴等13 在其文章中指出，抗原制备方法随免疫途径、程序、毒株的特性而异。而按照病原性区分，可分为两 类，一类是病毒性抗血清，一般是用本动物的含毒组织（发病鸡胚或病变细胞）作抗原，首 先把强毒接种本动物（鸡胚或细胞），使其发病（或病变），采取其含毒性组织（发病鸡胚 或病变细胞） 作为抗原， 注射于免疫动物。 另一类是细菌性血清， 是用抗原性好的强毒或弱 毒菌种

14、，接种于规定培养基内，于 37C培养，细菌发育良好者，经纯粹检验后用作抗原。3.2.3免疫接种据报道148，由于病原体的特点、免疫机理等不同，其制备抗血清的免疫方案也不尽相同， 即使是同一疫病， 也有不同的免疫方案； 而且用不同的免疫方案制备的抗血清， 其效 价亦有差异。因此， 为了获得高效价的免疫抗体， 动物的免疫程序一般分为基础免疫与高度免疫。 基 础免疫一般是注射疫苗， 然后再以递增量强毒抗原进行高免； 或者用佐剂抗原进行连续免疫。 每次注射剂量， 要随着注射次数的增加而增加。 接种抗原的次数和剂量， 应根据制造抗血清 的品种和动物健康情况加以调整。为了获得效价高的抗血清，动物饲养条件必

15、须保持良好。免疫剂量、 次数、 间隔， 在各种抗血清制造中差异极大， 如抗猪丹毒血清全程要注射抗原 20 次，历时60100 d ;抗猪瘟血清要注射6次以上，全程约50 d，且以获得高抗体效价为佳。3.2.4血清抗体的检测免疫程序接近结束时， 测定血清的抗体效价， 如果效价已达规定的要求， 即可视作免疫 成功，开始采血。若经试血，血清效价不合格，则可继续增加注射抗原次数或剂量，如再试 血仍不合格，应将动物淘汰。测定免疫血清效价是及时掌握采血时机的重要步骤。 在“兽药典” 中规定了各种血清抗 体的检测方法。 目前， 关于抗体效价不同检测方法的报道也很多， 有血凝试验和血凝抑制试 验19，20、间

16、接ELISA试验21, 22、斑点ELISA试验23、琼脂扩散试验24，25等。如果用琼脂扩 散试验测定血清效价时， 若在抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线者， 即为阳性。 最高稀释倍数 血清孔出现沉淀线， 即为该血清的抗体效价。 琼脂扩散试验的效价通常比环状沉淀反应稍低。3.2.5血清采集与提取经验得出，通常在末次免疫后 710 d采血样检测抗体效价，抗体滴度达到要求后再按 体重采血( 10 mL/kg )。不论免疫动物是大动物或小动物，采血方法均分一次放血和多次放 血法两种： 一次放血： 绵羊或其他大动物可用颈动脉放血， 家兔、 豚鼠和鸡等小动物则可 通过心脏直接采血；多次少量放血法：大动物可通

17、过静脉采血，小动物可通过心脏采血， 在第1次采血后35 d可进行第2次采血，经35 d后进行第2个免疫程序。注意，动物采血应在 上午空腹时进行，提前禁食 1d,可避免血中出现乳糜而获得澄清的血清。血清提取常采用自然凝固加压法和枸橼酸盐血浆分离血清法。在操作过程中， 应该注意的是， 血清的分离应在无菌条件下进行， 并应尽量防止溶血。 采血用的器械、 容器等用前要 进行灭菌，以无菌操作采血，分离的血清加防腐剂经检验合格后分装，保存。3.33.3 抗血清的检验按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准 (以下简称“质量标准” )的要求，每一 种生物制品都需要进行检验 26。抗血清的检验包括物理性状检验、

18、无菌检验、支原体检验、 外源病毒检验、 安全检验、 效力检验和苯酚或汞类防腐剂残留量测定。 物理性状检验、 无菌几乎所有动物传染病的病原微生物特别是细菌和病毒） 及其代谢产物都可制造相应的抗血清， 用于疾病的紧急预防与治疗，部分高免血清可以用于疾病诊断和病原鉴定，这在我国目前的国情下仍具有重要的经济意义。特别是针对于宠物、 珍稀动物以及易患突发性疾病检验、支原体检验、外源病毒检验均按“质量标准”中成品检验的有关规定进行。其中，外 源病毒检验时检查的病毒有：禽类：鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、禽腺病毒、 禽A型流感病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、禽网状 内皮

19、组织增生症病毒、 鸡马立克氏病病毒、 禽淋巴白血病病毒、 禽脑脊髓炎病毒、 鸡痘病毒；家畜：牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、蓝舌病病毒、 马传染性贫血病毒、 狂犬病病毒。安全检验通常用体重1822g的健康小白鼠5只，各皮下注 射血清0.5ml，用体重250450g的健康豚鼠2只，各皮下注射血清10ml，观察10天，均应健 活。效力检验则按不同病原的抗血清规定方法和剂量进行。 苯酚或汞类防腐剂残留量测定应 符合兽用生物制品通则的规定。4 抗血清中病原体的处理对于新制备的抗血清， 如果没有对外源病原体的检测和相应的处理， 则其应该是一种不 合格的产品。因此，处理抗血清

20、中的病原体（主要是病毒）成为抗血清安全性的首要问题， 也是提高抗血清产品质量的一个关键环节。 一般情况下， 处理病毒需进行以下三个方面的程 序：病毒排除、病毒去除和病毒灭活。排除病毒的最主要的工作是对材料的筛选， 它至少防止了抗血清分离混合物中过高的病毒负荷 27 。而去除病毒则是确保抗血清成品安全的一个重要程序。 其去除过程主要依据的是传统物 理法， 如膜过滤法等。 膜过滤法去除病毒的原理是利用病毒颗粒体积大于膜平均孔径而使病 毒载留在滤膜上。通过这一步，可使抗血清制品得到进一步纯化 28 。最具有技术难度的是病毒灭活技术。 因为所选的灭活方法必须满足以下条件： 灭活技 术本身或其致活因子与

21、血液成分反应的产物应无急、 慢性毒性作用； 不使血清成分发生变 性，不产生新的免疫原， 或不使长期使用者发生免疫反应性疾病； 灭活后的终产品仍然具 有正常理化活性和免疫学性质；灭活方法要简便、可行，无需大量人力、设备和空间29目前， 已经开发利用的方法很多， 但只有其中一些比较适合抗血清制品的病毒灭活， 如亚甲 蓝/光化学（MB）法30、丫 -射线辐照法31,32、以核酸为靶点的光化学技术33，34以及流体力 学高压法 35等。5 抗血清的应用的动物具有非常重要的应用价值。首先， 在疾病的紧急预防与治疗方面的作用就非常突出。 目前， 市场上的疫苗和治疗药 物都有各自的缺点， 如疫苗的免疫力保护

22、力不高， 治疗药物易产生耐药性等等。 与疫苗和治 疗药物相比， 抗血清具有其无可比拟的优点。 当动物接种相应抗血清后， 机体迅速得到大量 非自身免疫抗体， 从而快速中和了侵入机体的病原， 或者抵御了致病病原的攻击， 如抗猪瘟 血清有效的控制了猪瘟的疫情， 抗犬瘟热血清对犬瘟热有独特的疗效。 当前， 被批准的产品 还有：抗气肿疽血清、抗炭疽血清、抗绵羊痢疾血清、抗猪羊多杀性巴氏杆菌病血清、破伤 风抗毒素、抗猪丹毒血清等 2 。在疾病诊断和病原鉴定方面， 主要体现在作为阳性血清上。 发展到现在， 尽管有新的疾 病诊断和病原鉴定方法不断出现， 但是血清学诊断方法仍占主要地位。 而在用血清学方法时，

23、必须要用到阳性血清作为反应的诊断物。因此，具有高效价特性的抗血清成为首选。目前， 已批准生产的有： 炭疽沉降素血清、 布鲁氏菌病试管凝集试验阳性血清、 衣原体病间接血凝 试验阳性血清、 口蹄疫细胞中和试验性血清、 蓝舌病琼脂扩散试验阳性血清、 日本吸血虫病 凝集试验阳性血清等 38种2 。6 抗血清研究及应用中的问题及解决方案首先是抗血清产品的安全性问题。要使一种抗血清成为合格产品面市，必须保证制备 的抗血清安全， 无外源病原。 如何清除抗血清中的外源病原则是目前抗血清研究应用中面临 的一个难题，这就需要各种病毒处理技术去解决。病毒处理技术已经在上面介绍过。但是， 还需要发展更有效的处理技术。

24、其次是抗血清抗体效价降低的问题。血清抗体效价在很多情况下都会降低，如血清处 理、保存血清的温度、期限等等。在处理血清过程中，如外源病原处理时，难免会影响血清 抗体效价， 因此， 一种有效且不造成抗体效价改变的病原处理方法将是以后的研究的一个方 向。再就是抗血清本身具有的缺点，如用量大、成本高、质量低等。鉴于此，提高抗体表 达量，降低生产成本以及提高产品质量等问题将成为以后解决的重点。7 总结与展望综上所述， 动物抗血清制备的常规技术已经比较成熟， 但目前市场上的产品却很少， 主 要是因为安全性问题、 抗体效价变化以及抗血清的缺点造成的。 因此， 以后的研究重点也将 集中在这些方面。经研究和临床

25、应用表明，抗血清在特殊的情况下具有很重要的治疗价值， 如治疗宠物、 珍稀动物等的疾病， 以及用于重大疫病的突发性事件的应对和预防，可见， 抗血清产品还是具有很大的市场潜力。 随着生产抗体的新方法的不断出现、 抗体生产工艺的日 趋成熟， 抗血清的研究和应用将迈入新的阶段。 因此， 可以相信在不久的将来， 抗血清处理 技术将会更加完善， 动物性免疫球蛋白将应用于临床， 新技术抗体研究将成为热点， 如基因 工程抗体、小分子模拟抗体等。参考文献：1宁宜宝，王明俊 . 我国兽用生物制品技术的发展历程与展望 . 中国动物保健 .2001， 3：29-31 .2中国兽药典委员会中华人民共和国兽药典二00年版

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