实验二--显微镜油镜的使用及细菌的简单染色法1

1、实验二 显微镜油镜的使用及 细菌的简单染色法 一、实验目的：一、实验目的：1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术；2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握细菌的 简单染色法及无菌操作技术； 3.观察细菌的基本形态。 二、实验原理：二、实验原理：1、染色原理：、染色原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性 染料和中性染料三大类。染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷碱性染料的离子带正电荷，能和，能和 带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生 长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，

2、所以通长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通 常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿 等）使其着色。等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷，能与带正电荷 的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细下降时，细 菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等 酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染 料，如伊红美蓝、伊红天青等。料，如伊红美

3、蓝、伊红天青等。简单染色法简单染色法:是只用一种染料使细菌着色以是只用一种染料使细菌着色以 显示其形态的染色法，简单染显示其形态的染色法，简单染 色不能辨别细菌细胞的构造。色不能辨别细菌细胞的构造。2、显微镜油镜工作原理：、显微镜油镜工作原理： 利用油镜不但能增加照明度，更主要是能利用油镜不但能增加照明度，更主要是能增加数值口增加数值口 径径，因为显微镜的放大效能是由其数值口径决定的。所，因为显微镜的放大效能是由其数值口径决定的。所 谓数值口径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜谓数值口径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜 口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所口角）的一半正弦

4、，乘上玻片与物镜间介质的折射率所 得的乘积，可用下列公式表示：得的乘积，可用下列公式表示： NA=nsin NA:数值孔径数值孔径 n:介质折射率介质折射率 ：镜口角的半数：镜口角的半数 显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。两点之间最小距离的能力。它与接物镜的数值口径成正比，与光波长度成反比，因此接物镜的数值口径愈大，光波波长愈短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明显地区别出来。 能辨别两点之间最小距离= 1/2光波长度数值口径 = 1/2NA 三三 、实验器材、实验器材1、活材料：、活材料： 培养培养18-24h的的金黄色葡萄

5、球菌金黄色葡萄球菌( (S.aureusS.aureus) ) 和枯草芽孢杆菌（和枯草芽孢杆菌（B.subtilisB.subtilis）。）。2、染色液和试剂：、染色液和试剂： 复红、美兰、二甲苯、香柏油。复红、美兰、二甲苯、香柏油。3、器材：、器材： 载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。四、实验步骤：四、实验步骤：1、涂片涂片： 取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌，右，右边涂芽孢杆菌，做成薄的涂面，

6、注意取菌不要太多。边涂芽孢杆菌，做成薄的涂面，注意取菌不要太多。 整个过程中要注意无菌操作。（示范无菌操作技术）整个过程中要注意无菌操作。（示范无菌操作技术） 2、干燥干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文 火烘干。 3、固定固定：手执玻片一端，让菌膜朝上， 通过火焰 2-3次固定（以不烫手为宜）。4、染色染色：将固定过的涂片加复红或美兰染色：将固定过的涂片加复红或美兰染色1-2min。5、水洗水洗：用水洗去涂片上的染色液。：用水洗去涂片上的染色液。6、干燥干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。7、镜检镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找

7、出适当的视野：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野 后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将 油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。8、绘图：绘图：简单染色实验步骤简单染色实验步骤涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色 水洗水洗 干燥干燥 镜检镜检结果与思考题：结果与思考题：1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应注意些什么？2、按比例绘出你所观察到的细菌的形态，并显示两菌的排列 方式。复红或美蓝复红或美蓝1-2min9、实验完毕后的处理：、实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净：将浸过油的

8、镜头按下述方法擦拭干净： a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦23次。次。 c.再用干净的擦镜纸将镜头擦再用干净的擦镜纸将镜头擦23次。注意擦镜头时向一个次。注意擦镜头时向一个 方向擦拭。方向擦拭。看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，再用洗衣粉清洗。看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，再用洗衣粉清洗。五、五、结果与思考题结果与思考题1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应 注意些什么？ 2、按比例绘出你所观察到的细菌的形态，并显 示两菌的排列方式。六、注意事项六、注意事项1、油浸物镜的工作距离（指物镜前

9、透镜的表面到被检物体、油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体 之间的距离）很短，一般在之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般以内，再加上一般 光学显微镜的油浸物镜没有光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置弹簧装置”，因此使用油浸，因此使用油浸物物 镜时要特别细心，避免由于镜时要特别细心，避免由于“调焦调焦”不慎而压碎标本片并不慎而压碎标本片并使使 物镜受损。物镜受损。2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上 的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。实验报告的撰写要求实验报告的撰写要求 实验报告必须以实事求是、严肃认真的科学态度，按照指实验报告必须以实事求是、严肃认真的科学态度，按照指导书的要求按时完成。实验报告应该简明扼要、叙述准确、数导书的要求按时完成