液质联用分析多肽

1、IWNANJING UNIVERSITY JINLING COLLEGE本科毕业论文院 系化学与生命科学学院专业应用化学题目液质联用分析多肽实验条件的探索年 级2013级专转本 学号2013070499030学生姓名彭秋晨2015. 4. 24指导老师陈守发 职称工程师论文提交日期京大学金陵学院开题 简 况中期检査本科生毕业论文（设计）指导情况记录论文题目：液质联用分析多肽实验条件的探索1、选题质量论文选题有新意，有实际应用价值，论文有独到的观点，与专业知识息息相关，难 度也较适中，总体来说符合规范要求。2、开题意见论文符合本科生答辩要求，难度适中，资料填写充实，计划详尽、淸晰，对液质联 用的

2、研究有一泄意义，允许开题。指导教师签名：年 月 日指导教师检查论文的进展情况：查阅了大量的相关资料，包括国内外相关文献，国内外众学者的相关论文、专著等, 对所要着手研究的课题作全面地了解与认识。在对所搜集资料认真研究的基础上， 拟定论文题目，设计研究方案。能够将所学知识运用到实验中，能够从反应现象中 思考可能的原因并作出结论。指导教师签名:年 月曰京大学金陵学院本科生毕业论文（设计）评阅意见指导教师评语：彭秋晨同学在对文献调研的基础上，充分了解了液质联用的原理，通过对多肽序列的分 析，运用LC-MS仪对多肽进行了产品性质认定和分析杂质性质，摸索出液质联用的最佳条件, 建立一套完整的液质联用体系

3、。全文结构基本合理科学，逻借思路淸晰，观点表达准确，语 言流畅，达到了本科生培养的目标。综合以上分析，该文达到了学士学位论文水平，同意答 辩。指导教师签名：评阅时间：年 月 日评阅教师评语：论文选题适当，有一左的独立见解，论证充分，占有资料广泛，语言表达基本顺畅,有足够理论和实例支撑，主要观点突岀，逻辑关系淸楚，论文格式符合规范要求。评阅教师签名：评阅时间： 年 月 日南京大学金陵学院本科生毕业论文（设计）答辩记录、成绩评定答辩记录:答辩记录人签名: 答辩小组评语：答辩小组成员：成绩 组长签名:答辩时间：论文题目:液质联用分析多肽实验条件的探索系部：化学与生命科学学院专业：应用化学 2013专

4、转本级姓名：彭秋晨指导教师(姓名、职称):陈守发工程师摘要高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术是近儿年来发展起来的一项新的分 离分析技术。它将应用范围极广的分离方法一一液相色谱法与灵敬、专属、能提 供结构信息的质谱法结合起来，成为一种重要的现代分离分析技术。液质联用为 生产和科研提供了许多有价值的数据，解决了许多在此之就难以解决的分析问 题。本文主要探索液质联用的条件，并运用LC-MS仪对多肽进行了产品性质认 定和分析杂质性质，希望能建立一套完整的液质联用体系。关键词：高效液相色谱-质谱，联用的条件，产品性质认定，杂质分析AbstractHigh-performance liquid

5、chromatography - mass spectrometry (HPLC-MS) in conjunction with technology in recent years developed a new separation analysis techniques It a very wide range of applications of separation methods - liquid chromatography with sensitive, proprietary, can provide information on molecular weight and s

6、tructure of the combination of mass spectrometry has become an important separation of modern analysis techniques.HPLC-MS provide lots of valuable data for production and scientific research, and solve many previously difficult problems.This papermainly explores the LC-MS conditions, and the use of

7、LC-ESI-MS instrument and analysis of impurities on the properties of the product to determine the nature of the polypeptidehope to establish a complete set of liquid chromatography-mass spectrometry systemKey Words : HPLC-MS, in combination with the condition, nature of the product identification, i

8、mpurity analysis目录摘要IAbstractII丄F*冃iJk-l III第二章实验部分62 1II 白勺 622 62.3实验仪器与试齐lj82.4实验步骤82.4.1管道连接8242流动性制备82.4.3 一般参数配置82.4.4实验步骤9第三章结果与讨论103.1第一个实验103.2第二个实验123.3第三个实验15第四章结论与展望24参考文献26致谢27第一章前言蛋白质是生物体中含量最高、功能最重要的一类生物大分子。它存在于所有生物细胞 中，约占细胞干质量的50%以上，它在生命科学中所占重要位置可想而知。Linus Pauling 于1937年阐述蛋白质的重要性时曾经说过

9、：“生命的奥秘就在于揭示蛋白分子是如何从无 序基质形成的，又如何依据其自身映像复制新的蛋白分子的。”用今天的标准来看，当时 对蛋白质的功能和结构还知之甚少。当然，现在人们已经了解蛋白质在生物学中数不胜数 的功能，而且还获得了一些重要蛋白质的髙分辨结构，人们的知识范囤正以更快的速度不 断扩展着。质谱法在这方而愈来愈显出威力，也愈来愈引起人们的重视。质谱能够左性、左量分析有机小分子、肽、蛋白质以及核酸等各种分子，是一种强有 力的分析技术。质谱技术的特点是快速、准确和灵敏度髙。从JJ.Thomson制成第一台质 谱仪到现在为止已有90年历史了，早期的质谱仪主要是用来进行同位数测左和无机元素分 析，在

10、20世纪40年代之后就开始用于分析有机物，而60年代出现的气相色谱-质谱联用 仪使得质谱仪的应用领域大大扩展起来。开始成为有机物分析的重要仪器。伴随着计算机 的快速发展，这又使质谱分析法发生了飞跃的变化，使其技术更加成熟，应用更加方便。 80年代以后又岀现了一些新的质谱技术，如：1) 电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometr)r, ESI-MS)2) 基质辅助激光解吸电离质谱(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry, MALDI-MS)3) 快原子轰击质谱

11、(fast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS)4) 离子喷雾电离质谱(ion spray ionization mass spectrometry, ISI-MS)5) 大气压电离质谱(atmospheric pressure ionization mass spectrometry, API-MS)以及随之而来的较成熟的液相色谱-质谱联用仪、感应耦合等离子体质谱仪、傅里叶变 换质谱仪等。这些新产生的电离技术与新的质谱仪器使质谱分析又取得了较大的进展。在以上的电离技术中，近年来研究的最多的是前而三种，他们在蛋白质和多肽方而的 应用上较为广泛。

12、应用质谱研究肽和蛋白质刚有几十年的历史，研究范围从作为蛋白质最 基本组成部分的氨基酸，到生物大分子的多肽和蛋白质，从分子质量范围的不断扩展可以 衡量质谱的飞速发展。1981年，Barber等首先提出用FAB质谱测左肽的分子量，他们采用双聚焦质谱仪， 以甘汕为基质，分析一个十一肽。但是FAB质谱分析只适用于分子量小于6000Da的肽或 小蛋白质，如果分子量再大的肽用此技术分析就十分困难。所以FAB质谱只适用于分析化 学降解或酶水解的蛋白质以及人工合成的寡肽。到了 80年代左右,随着快原子轰击(FAB)、电喷雾(ESI)和基质辅助激光解析(MALDI) 等新软电离”技术的岀现，质谱已经能用于分析髙

13、极性、难挥发和热不稳定样品，这直 接导致生物质谱飞速发展是之成为现代科学前沿的热点之一。质谱由于具有迅速、灵敏、 准确度高的优点，并能进行蛋白质序列分析和翻译后修饰分析，生物质谱已经无可争议地 成为蛋白质组学中分析与鉴定肽和蛋白质的最重要的手段。质谱法在一次分析中可提供丰 富的结构信息，将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一项突破性进展。如用质 谱法作为气相色谱(GC)的检测器已成为一项标准化GC技术被广泛使用。由于GC-MS不 能分离不稳左和不挥发性物质，所以发展了液相色谱(LC)与质谱法的联用技术。LC-MS 可以同时检测糖肽的位程并且提供结构信息。在众多的分析测试方法中，质谱学方法

14、被认为是一种同时具备髙灵敏度和髙特异性并 且得到了广泛应用的普适性方法。质谱的发展对基础科学研究、国防、航天以及英他工业、 民用等诸多领域均有重要意义。有关LC-MS在蛋白质分析方而的应用的回顾文章已有很多，本文的目的在于探索液 质联用的条件，并运用LC-MS仪对多肽进行了产品性质认泄和分析杂质性质，希望能建 立一套完整的液质联用体系，我将用实验室的一些数据来展示LC-MS对多肽的分析检测。第二章实验部分21实验目的1）学习并掌握LCMS的工作原理2）研究液质联用的条件3）利用LCMS的高灵敏性、快速性对多肽物质进行立性分析4）建立一套完整的液质联用体系，以实现通过LC/MS认左产品和分析杂质

15、性质的目的2.2实验原理质谱分析是将样品转化为运动的带电气态离子碎片，在磁场中按质荷比（m/z）大小分离 并记录的分析方法。质谱的样品一般要汽化，再离子化。通常不纯的样品要用色谱和质谱联 用仪，是通过色谱进样的。即色谱分离，质谱是色谱的检测器。离子任电场和磁场的综合作 用下，以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我 们常见的质谱图。英过程为可简单描述为：苴中，z为电荷数，c为电子电荷，U为加速电压，m为碎片质量，V为电子运动速度。 质谱仪一般由进样系统、离子源、分析器、检测器组成，还包括真空系统、电气系统和数据 处理系统等辅助设备。在本次实验中，通过对液质联用

16、条件的摸索，找到了较适合于多肽的 分析方法，通过建立LC-MS的分析条件，实现了部门内部对于产品的分析以及杂质认泄 的目的，希望能建立一套完整的液质联用体系其中，常用术语有： 质荷比：离子质量（以相对原子量单位计）与它所带电荷（以电子电量为单位计）的比值， 写作m/Z. 峰：质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰. 离子丰度：检测器检测到的离子信号强度.基唸：在质谱图中，指左质荷比范围内强度最大的离子屹称作基唸. 总离子流图；质量色谱图：准分子离子：碎片离子；多电荷离子：同位素离子质谱仪由以下几部分组成:数据及供电系统进样系统离子源质量分析器检测接收器111真空系统质谱仪一般由进样系统、禽子

17、源、分析器、检测器组成。还包括真空系统、电气系统和 数据处理系统等辅助设备。常用分子疑检测条件：(1) 流动相:Pump A： 100% water; Pump B:100% methanol(2) 梯度：0-0.5min :乙腊浓度：50%(3) 流速：0.2ml/min(4) 离子扫描模式：正离子或负离子如果是正离子模式检测，MS图谱中有明显M/Zil金，其通过M/Z值推算出实际的MWMW=M/Z*Z-Z如 Z=l,则 MW=M/Z*1-1如 Z=2,则 MW=M/Z*2-2如 Z=3,则 MW=M/Z*3-3如不乂，则 MW=M/Z*X-X如果是负离子模式检测，MS图谱中有明显M/Z峰，

18、英通过M/Z值推算岀实际的MWMW=M/Z* (-Z) -Z如 Z=l,则 MW=M/Z*1 + 1如 Z=2,则 MW=M/Z*2+2如 Z=-3,则 NdW=M/Z*3+3如 Z=X,则 MW=M/Z*(-X)-X如果计算岀的实际分子量比理论分子量大16,则可能的原因是M (Met)或者C (Cys) 在切割时被氧化，如果讣算出的实际分子量比理论分子量大48,则可能的原因是C (Cys) 在切割时被氧化，形成磺酸，如果讣算出的实际分子量比理论分子量小2,则可能的原因有 两种，一是序列中含有2个C (Cys),形成分子内二硫键，二是序列中含有1个C (Cys), 形成分子间二硫键，如果汁算出

19、的实际分子量比理论分子量小17,则可能的原因是序列N 端含有Q（Gln）.Q脱氧，如果计算岀的实际分子量比理论分子量小18,则可能的原因是 D（Asp）-G（Gly）拖一分子水，如果计算岀的实际分子量比理论分子量大114或是96,则可能 的原因是TFA导致，如果计算出的实际分子疑比理论分子量大92或是148,则可能的原因 是C （Cys）在切割时与EDT产生反应，如果计算出的实际分子量比理论分子量大56,则 可能的原因是Tbii保护基团未切干净，如果讣算出的实际分子量比理论分子量大100,则可 能的原因是Boc保护基团未切干净，如果计算出的实际分子量比理论分子量大222,则可能 的原因是Fmo

20、c保护基团未切干净,如果计算岀的实际分子量比理论分子量大242,则可能的 原因是Trt保护基团未切干净,如果计算出的实际分子量比理论分子量大252,则可能的原因 是Pbf保护基团未切干净,如果讣算出的实际分子量比理论分子疑大22,则可能的原因是+Na 离子峰如果讣算出的实际分子量比理论分子量大38,则可能的原因是+K离子峰，如果汁算 出的实际分子量比理论分子量大41,则可能的原因是+ACN离子峰在本次实验中，通过对多次改变液质联用的参数Event Time, nVz扫描范围，扫描速度 等条件，找到了较适合于多肽的分析方法，通过建立LC - MS的分析条件，实现了部门内 部对于产品的分析以及杂质

21、认泄的目的，希望能建立一套完整的液质联用体系。2.3实验仪器与试剂实验仪器：岛津LCMS-2010EV实验试剂：乙尉（南京化学试剂有限公司），超纯水（SIGMA - ALDRICH Co ）,甲酸（TEDIA Company Inc.）2.4实验步骤2.4.1管道连接按照标准，整套液质的管路连接首先从泵接入混合器，英次进入六通阀，再接入色谱柱，色 谱柱后接入二极管阵列检测器，在经过检测器后，接入ESI离子源，最后进入MS检测器。2.4.2流动性制备第1次实验：Pump A超纯水（0.065%甲酸）、Pump B乙腊（0.05%甲酸）：第2次实验：Pump A超纯水（0.1%甲酸）、Pump B

22、乙（0.1%甲酸）：第3次实验:Pump A超纯水（0.1%甲酸）、Pump B乙謄（0.1%甲酸）;2.4.3 一般参数配置流速：0.2ml/min检测器电压：l.lOkv干燥气流速：lODminI碰撞气流速：1.50 L/minDL 温度：250 C加热模块：200 C时间程序:LC Time ProgramTime/minModuleComma ndValue25.00PumpsPump B Cone.6525.01PumpsPump B Cone.9532.00PumpsPump B Cone.9532.01PumpsPump B Cone.540.00PumpsPump B Cone

23、.540.01ControllerStop2.4.4实验步骤(1) 用试剂来溶解多肽样品：(2) 将溶解样品进行髙速离心；(3) 分别将样品取至样品瓶中，并放入样品板中：使用LCMS仪器来检测样品板中的多肽，检测出M/Z牟Lux*r：】 R.Tunc：6.】63(Scg:lB5O)MS SpecuuuiI 7 COOOMiiconno i oconnn9COOUU-scoooo-a兀0000=6coc)noi JCOOOOj 4COOOO；uoonn2COOOO-*lC000-=45：.20903.30j i k | i i i T | i b | t b 100200300400717.25

24、S060OCT 101204.603.65 isgo.os500600?00sJo 9001(X)01100120Fig.3-5 MS for R. Time 16.660min of Order ALur* 4 R Titur. 17200000-100006-563201125 40179 0041 1.751273701470 W I V V V | I V V V I 100 200 300 400 500 600 700 fiC-0 900 1000 1100 1200 1300 14 1500 1600uizFig.3-6 MS for R. Time 17.873min of O

25、rder A产品认是：Order A的图谱中，从质谱图(Fig.3 - 3)来看，TIC中6.163min(Fig.3 - 2)的出峰是目标 物，质谱图对应M+HJ1+, M+2HJ2+, PDA对应的是5.993min (Fig.31)的出峰,说明该 条多肽绝大部分含量是目标物：产品中杂质的分析：17.873min(Fig.3 - 2)的质谱图(Fig.3 - 6)有较高且淸晰的物质响应，主要物质是1125.10, 比目标物大222.15,近似于Fmoc的保护基，这说明多肽N端脱Fmoc保护基的反应未进 行完全，还有一小部分残留。英余两个质谱图(Fig.3 - 4 & Fig.3 - 5)响

26、应很低，且非常杂，怀疑是切割试剂所致。 分析小结：从第一次的实验来看，HPLC和TIC图谱基本上能够识别出不同物质的出峰，MS图 谱上对应的也较好，但是TIC图谱从响应上来看比较不理想，HPLC图谱的基线也有点不 正常，估讣是将流动相中的TFA换成甲酸后，流动相中离子强度过小导致仪器对TIC色谱 峰不敏感,下一步实验将会在此基础上进行改进。3.2第二个实验第二次实验，在样品选择上，我们选取了在HPLC分析比较差的样品进行左性测试， 其中参数Event Time为(Msec, m/z扫描范HI 400-1800,扫描速度15000Da/sec,其中扫描 速度已达仪器极限，同时测试仪器的性能。Or

27、der IDSequeneeM.W.Conc./ppmInjection vol./ u 1第二次实验BXX2146.23none20CLcaUUQS41UFig.3-7 Chromatogram of Order BTKr)iMS C*hfomatogiam(xlOC.OOO) dz9$ArISO15.516 0HS17 017.5ISO minFig.3-8 TIC of Order BILineal R.Tmic.l6.C37($ca.9623)MS Spectrum100200300100500600刀 0SOO 900100011001200 BOO 1100mzFig.3-9 MS

28、 for R. Time 16.037min of Order BLineal RTimc 16 350(Scao-9$l)20000-68.5010009-1啊，点二100200300400500600787.35871.301021.601154.501346.45700800900100011001X01300】400mzFig.3-lO MS for R. Time 16.350min of Order BLine=:3 RTuue: 16.5lXScaa:990$)Fig.3-11 MS for R. Time 16.513min of Order BLine=,4 R.Tmie.l

29、6.722(Scani. 10034)Fig.3-12 MS for R. Time 16.722min of Order B产品认泄：Order B的图谱中，TIC中16.037min(Fig.3 - 8)的出峰对应的质谱(Fig.3 - 9)与理论分 子量吻合,同时对应PDA中15.845min的色谱峰。产品中杂质的分析：16.350min的质谱图(Fig.3 - 10)经推算，主要分子量应为2041.20,比目标物小105.03, 可能是半胱氨酸(Cys)缩合不完全所致；16.513min的质谱图(Fig.3 -11)响应非常低，只有3 个数量级，而且表现出完全不同的分子量，经过推算，主

30、要分子量可能有几种：1331.35、 1253.30、1193.65、1036.50,与目标物分子量相差很大，估计是多肽在缩合过程中所产生的 缩合不完全的多肽碎片；16.513min的质谱图(Fig.3 - 12)和(Fig.3 - 11) 样，响应很低，且 整个图谱非常杂，英较高的分子量有1095.05、904.30,是一些小肽的碎片，也可能是218&10、 1806.60,由于难以判断，所以需要通过英它分析手段进行鉴左； 分析小结：从整个实验结果来看仍然不理想，具体表现为TIC强度低，峰形很差，同时MS响应 也变得非常低，后来发现在二极管阵列检测器后分流是导致这一现象的原因，下一步实验即

31、将对此展开。33第三个实验该次实验我们在检查是否是分流导致离子强度下降的同时，对样品进行初步的定量检测，其中参数 Event Time 为 05sec, m/z 扫描范50-1800,扫描速 15000Da/secoOrder IDSequenceM.W.Con c./ppmInjection vol./ M 1第三次实验cXXX3069.3211105DXXXX1661.9516202uAU15900JWJW)-1PDA Multt 1 214nni-liin%i i i i i i ii i i0025 YD 75 i i I I ii i i i i i i i i i i i i i1

32、0012515 C 175?(r)22.5250mmFig.3-13 Chromatogram of Order CyJW)-Ms Chmnuro护tnETmrlHO5(Scai45O3)MS 4ectr.mi989)COG-960)n75 IS丿穿爲爲惟c：嚣-血山皿L1002003)040C500600700 O $06 1OC0 11D01203 DOO H0015(016X)S6P0? SO 146270Fig.3-15 MS for R. Time 11.505min of Order Cnr- 2 R Tim- 11 69S(S aii 4680)30000C-：7000H60U0

33、C-j50004O0giOOOOCH为oog1000 心1023 401534701$6：45 302.10 您.60 622.05 呼也 877.3$ 輸口【令.351463上血35t i | i i jit j i i j i i i i | i i i k fr i T k tf i i | I i j i i fcT k j ri f b T b b j i i V i |1X2003- 12 US(Sci：.4S44)WOOK300lXi-2coa-i60tr-10Q20C300 ICC 530 SQ 700 OOP XJO LOCO 11OO 123 LJOO 11001500 1

34、GCCFig.3-17 MS for R. Time 12.108min of Order C产品认泄:Order C中的质谱图中，Fig.3 - 16为11.698min的TIC出峰(Fig.3 - 14),经过计算是 目标物，对应M+2HJ2+, M+3HJ3+, PDA 中对应 11.631 min； 产品中杂质的分析：12.108min的TIC出峰(Fig. 317)经过计算，是多肽二聚的产物，可能是由于C端 含有Cys的原因，但是含量不高，这说明在合成和纯化中都要注意对Cys的保护，否则时 间越长，产品全部变成二聚物的可能性就越大9： 11.5O5min的TIC出峰(Fig.2 -

35、15)的分子 量推测为1937.8,可能是多肽不完全缩合中产生的碎片。mACOOFig.3-18 Chromatogram of Order D?4S ClauUMtOgMLUTic(hi(xl CCO.GOOi1.60MS ChioniMiciKni1.00-i i16.0L6.14.014.515.015.517.017518.0nwn(xl 009,000)Fid 9 TIC of Order DbTiono-047.9550000-225.35372.35 494;-632.30781.75 廻5每倪475i i I I (* iIf i|1 r i I丁1419.603氓：R7ime

36、:14.$33(Scan? 58l-l)MS Spectnun100mz40050060S)70080090010031100120013XFig.3-20 MS for R. Time I4.533min of Order D91613.45210.80362.00 483.15尿25864也65| 厂 1108.75 1901393.5010C00A1002003005008M K850.35297.95416.75 评:汽 峯沪300400 JOQ GOO 700942.50167S.2O10fi4.051377.10I638 9075S.05打屮亠“气卄牛屮T r严丫卄尸r呻rr卜別卞

37、4厂-尸- 8QQ 900 JQOQ 1100 1200 13CG 1400 15001700 1800 l?30mzFig.3-24 MS for R. Time 15.318min of Order DLinerr.5 R.Time. ；5.505(ScmzFig.3-25 MS for R. Time 15.5O5min of Order DLiner/ R Time 15 $O(XS“Z 6561)155S0779.9510(X00-1550.10363.8553 107233(.”301023.552663 1421.00LmuLT 1 1 rfI f3C040050Q6C0700i

38、Oj 9 贏 1GW 1100 12GD 1305 1400 1500厂iOCO 1700 1800 1W0Fig.3-26 MS for R. Time 15.900min of Order DLxwi.S JLTime.l6.CS3(Scai)i：M34)roixxhSI JS1501.301101X0 icoixxii80000;joooot60阴500W4orm300C0-iJOOXh919.05318.9551935300 的 072351441.2532,05554.80956.00严 1357.801551.551761.20300 4OU MX) 60D700800900 lO

39、O) MOO 12001300 I-WO D(X) 160U170C18W1900Fig.3-28 MS for R. Time 15.055min of Order DLme-：；O R.Tne:16.57$ Scair7：6J2Fig.3-29 MS for R. Time 16.578min of Order DLme-ll RTime lS.87g(Sca$752)111 L851387.3030000-705.4091390lOOta：1668.8014S4.50808.55329.30 471 15 609.701795 40300400500603700 SOO 9001000

40、HOT 1200 13C0 140C 1500 1500 1700 1803 1900Fig.3-30 MS for R. Time 16.878min of Order DLiac.12 R.T：ou.l7 503(Scou*；7002)110：7520000匕166.20-1114.95100000-831.053-150 25.65 66S.95一匸ii i i rr r i r j1 r r it r 11 r rr r r | fr i it r r r r r i ! rTi1i 1239.801434.051630.25 1784.50tr丁ri r rrrrH300400586

41、C0700800900100： H00 12CO 1300 1400 1500 1600 1700 180D 1900rozFig.3-31 MS for R. Time 17.503min of Order D产品认泄:Order D中的质谱图中，纵观Fig.3 - 20到Fig.331,总共12个峰，只有Fig. 3 - 28中 含有目标物分子量契合的物质,也就是TIC中的16.345min, PDA中的16.270min所出的 峰,但是同一峰中还含有1443.9这种物质，从序列中看，很有可能丢失了一个Asn和Leu, 因为杂质和目标物性质过于相似，导致两种物质包含在一个U犀内：产品中杂质

42、的分析：其余 11 个峰,分子量分别为 1893.9(Fig.3 - 20)、1837.3(Fig.3 - 21)、1573.7(Fig.3 - 22)、 1539.0(Fig.3 - 23)、1698.7(Fig.3 - 24)、1779.9(Fig.3 - 25)、1557.9(Fig.3 - 26)、1500.9(Fig.3 - 27)、1614.0(Fig.3 - 29)、1387.3/1408.8/1825.8/3335.6(1668.8 的二聚物) (Fig.3-30)、3320.4(1661.2 的二聚物)(Fig.3 - 31)：需要指出的是，Fig.3 - 31 是目标物的二

43、 聚峰，应该跟多肽链C端含有Cys有关，这和91502 - 2很相似，同时在PDA和TIC上 都表现岀了很高的物质信号强度，也说明多肽中目标物的二聚物含量很髙，这点需要合成和 纯化共同注意对Cys的保护和重视：分析小结：上而2个样品的实验表明，在撤掉分流阀后，无论是TIC还是MS,在离子强度上都 有了非常明显的提髙，同时第2个样品的HPLC谱图非常复杂，在这种情况下TIC图谱依 然表现出了很好的分辨率和灵敏度。第四章结论与展望在该系列实验中，通过不断调整仪器的局部参数和管路连接，得到了较好的图谱，并 保持了相当好的分辨率和灵敏度。但是分流阀给实验带来了非常大的影响，因为液质联用 的色谱柱是直径

44、较窄的柱子，且流速较低，在分流后，只有很少的样品进入ESI离子源， 导致色谱图离子强度较低，同时甲酸这种离子对试剂在流动相中离子强度上不如三氣乙酸, 也是TIC灵敏度下降且分辨率不髙的原因。期外，通过LC-MS分析，部门建立了产品性 质认左以及杂质分析的能力，并能以此配合合成组和研发组进行合成工艺的改进和研发。 最后，经过实验得出的较佳分析条件如下： 管路：撤去分流阀，英余按照正常连接 流动相：Pump A超纯水（0.1%甲酸）Pump B乙睛（0.1%甲酸）流速：0.2ml/min色谱柱：岛津VP-ODS色谱柱（2OX15Omin5pm）检测器电压：l.lOkvMS 参数：Event Time 05sec m/z Range 50-1800 Scan Speed 15000Da/sec 干燥气流速：lOUmin 碰撞气流速:1.50 L/minDL 温度：250 C加热模块：200 C时间程序：LC Time ProgramTime/minModuleComma ndValue25.00PumpsPump B Cone.6525.01PumpsPump B Cone.9532.00PumpsPump B Cone9532.01PumpsPump B Cone.540.00PumpsPump