miRNA21对其靶基因PTEN在前列腺癌中表达调控机制的研究VIP

1、miRNA-21对其靶基因PTEN在前列腺癌中表达调控机制的研究肖黎 【1】 金艳阳【2】 佟明【2】 （1.辽宁医学院，辽宁锦州 121001； 2.辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001）通讯作者：佟明(1967-)，男，教授，医学博士，主要从事泌尿系肿瘤及相关研究。E-mail：tongmingir【摘要】 目的 观察前列腺癌组织和细胞中miRNA-21和 PTEN的表达情况，探讨miRNA-21对PTEN的调控。 方法：应用实时荧光定量PCR和Western blot 检测正常前列腺组织、前列腺癌组织、非依赖性前列腺癌PC-3细胞中miRNA-21和PTEN的mRNA表和蛋白质表

2、达水平。在前列腺癌PC-3细胞中通过转染miRNA-21 inhibitor成功抑制MiRNA-21表达后，实时荧光定量PCR和Western blot 检测PC-3细胞中PTEN表达水平。结果：miRNA-21在前列腺癌组织中的相对表达量为0.4210.166，明显高于正常前列腺组织0.0330.018，（t=6.6，P005）。miRNA-21 inhibitor转染PC3细胞后miRNA-21在空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为0.5160.213,0.1170.044,0.3920.171, 转染组与空白组及阴性对照组比较差异有统学意义（F13.1，q =7.05、4.89，

3、P0.05）。PTEN mRNA在正常前列腺组织、前列腺癌组织的相对表达量分别为1.5340.385,0.3760.232，正常前列腺组织高于前列腺癌组织差异有统计学意义（t=5.8，P005）；PTEN蛋白在正常前列腺组织、前列腺癌组织中的相对表达量分别为2.0100.386和0.5710.143，差异具有统计学意义（t =12.3，P005）。miRNA-21 inhibitor 转染PC-3细胞后，PTEN mRNA在空白组、转染组和阴性对照组组织中的表达差异不显著，但其蛋白的相对表达量分别为0.3990.185,0.8260. 197,0.4420.149，转染组与空白组及阴性对照组比

4、较差异有统学意义（F13.9，q = 4.79、4.2，P0.05）。结论 前列腺癌组织中miRNA-21的表达上调，在转录后水平抑制PTEN表达，；miRNA-21有可能成为前列腺癌治疗的新靶点。【关键词】 前列腺癌；miRNA-21；PTEN前列腺癌的发生发展涉及一系列的基因组的改变，抑癌基因PTEN（ phosphatase and tensin homologue）丢失在前列腺癌的发生及进展中起关键的调控作用1-2。miRNA（microrRNA）广泛存在于动植物中，它对生物体生长发育和分化调控起着重要作用，其失衡表达亦可促进多种肿瘤的发生发展3； 。大样本筛查证实miRNA-21在多

5、种实体肿瘤中均出现高表达现象4。miRNA-21的高表达可以提高前列腺癌细胞的凋亡抵抗、活力、及侵袭力5，而我们以前的研究也证实下调miRNA-21在前列腺癌表达后，细胞增殖能力减弱。本研究中旨在探讨miRNA-21对抑癌基因PTEN在前列腺癌中可能的调控作用。资料方法1、.组织收集及细胞培养 11份正常前列腺组织、6份前列腺癌组织均取自本院电切手术或前列腺穿刺标本并经病理证实。全部病例术前均未接受放化疗，标本采集后迅速放至液氮中-80冷冻，-80。前列腺癌PC-3系细胞（中国医学科学院基础医学研究所细胞中心），用含有用含有10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，37

6、温箱培养，隔日换液。2、.RT-PCR：Trizol法提取细胞及组织中的总RNA，紫外分光光度计检测总RNA的吸光度A260和A280值，并保证A260/A280比值1.8-2.1以控制其纯度。取2u希文，勿与英文混用。下同g总RNA作为模板，miRNA-21、U6及编码基因PTEN的逆转录反应体系：2.5mmol/L dNTP 2ul ,1umol/L逆转录引物1ul，4U/ul Quant反转录酶（Takara公司）1ul, 5逆转录酶缓冲液4ul，加无RNA酶水至反应体积为20ul。37温浴60 min，955 min，收集cDNA，-20保存。miRNA-21茎环状逆转录特异引物和mi

7、RNA内参照U6引物由Takara公司合成。miRNA-21及PTEN PCR反应体系：取l ul cDNA为模板，SYBR GreenReal Time PCR Master Mix(Takara公司)9ul，上下游引物各2ul，无RNA酶水加至20ul。PCR反应参数：预变性95 30s（1次）；变性95 10s 退火60 20s 延伸70 2min（共30循环）；70 10min延伸、补全。miRNA-21逆转录引物序列5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCGCAGGTATTCGCACTGGATACGACTGAACA-3；内参照U6引物序列5-GTCGTATCGTGAGCAGCGT

8、CCGAGGTATTCGCACTGGATAGCACAAAAATATG-3。miRNA-21 PCR反应的上下游引物分别为5-GCGCGCTAGCTTATCAAGCTGATG-3和5-GTGCAGGCTCCGAGGT-3；内参找U6的上下游引物5-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3 和5-GTGCAGGGTCCGAGG-3。PTEN上、下游引物序列分别为5-GAGGGAATAAACACCATG-3和 5-AGGGGTAGTGAGTGACACAGTA-3。内参照-actin上下游引物序列分别为5-CAGAGCCTCGCCTTTGCC-3和5-GTCGCCCACATAGGAATC-3。按目的基

9、因的表达量=2-Ct计算各个样本中的miRNA及mRNA的含量。Ct=目的基因Ct值-内参基因的Ct值。3 、.Western blot检测蛋白的表达：将收集组织或细胞加入500ul裂解液 含150 mmolL NaCl、10 mmolL TrisHCI(pH7.5)、01SDS、1NP- 40和蛋白酶抑制剂复合中匀浆后超声波室温破碎10min，12000r/min离心10min，收集裂解物的总蛋白。BCA蛋白定量法测定蛋白质的浓度。取40ug总蛋白进行Western blot，PTEN一抗为鼠抗人单克隆抗体（1:300稀释，美国XYMED公司）及3-磷酸甘油脱氢酶（GAPDH）一抗羊抗鼠（1

10、:400稀释，美国Promad公司）。辣根过氧化物酶偶联的二抗为羊抗鼠（1:5000稀释，美国Abcam公司），按步骤进行曝光、显影及定影，然后扫描胶片，用GENE GENIUS凝胶图像处理系统分析各条带谱带强度值。4、.细胞转染：取稳定生长的对数期PC3细胞，消化后以3105/孔种植于6孔细胞培养板。设置空白组、转染组及阴性对照组。空白组加无血清培养基，转染组加50nmol/L的miRNA-21 inhibitor（广州锐博公司），阴性对照组加入浓度为50nmol/L阴性对照剂（广州锐博公司），按Lipofectamine 2000转染试剂（美国Invitrogen公司）说明书进行。24小时

11、后提取PTEN总RNA进行实时PCR反应，48小时后提取蛋白质进行Western blot检测。5、.统计学方法：采用SPSS18.0统计软件进行数据分析。实验所得数据以均数标准差(s)表示；独立样本采用t检验；单因素方差分析采用SNK-q进行多样本均数的两两比较。以P0.05为差异有统计学意义。结果1、.miRNA-21和PTEN的表达：miRNA-21在正常前列腺组织、前列腺癌组织中的相对表达量分别为0.0330.018和0.4210.166，正常前列腺组织低于前列腺癌组织，差异有统计学意义（t=-6.6，P005），表明miRNA-21在前列腺癌中高表达；见图1。PTEN mRNA在正常

12、前列腺组织、前列腺癌组织的相对表达量分别为1.5340.385,0.3760.232，正常前列腺组织高于前列腺癌组织，差异有统计学意义（t=5.8，P005），见表2。PTEN蛋白在正常前列腺组织、前列腺癌组织中的相对表达量分别为2.0100.386和0.5710.143，差异具有统计学意义（t =12.3，P005）见图2，3。2、.转染miRNA-21 inhibitor后miRNA-21和PTEN的表达： miRNA-21 inhibitor转染PC3细胞后，miRNA-21在空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为0.5160.213,0.1170.044,和0.3920.171,

13、 转染组与空白组及阴性对照组比较差异有统学意义（F13.1，q =7.05、4.89，P0.05）表明转然后成功抑制了miRNA-21在PC3细胞的表达；。见图4; 。 PTEN mRNA空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为0.4740.188,0.4910. 289,和0.3880.151,三组间表达差异无统计学意义（F=0.515，P005）；PTEN蛋白在空白组、转染组和阴性对照组的相对表达量分别为0.5090.244,0.8510. 166,和0.4220.191，转染组与空白组及阴性对照组比较差异有统学意义（F9.7，q = 5.92、4.79，同时也P0.05），见图5、6

14、。 图1 mRNA-21在不同前列腺组织中的表达 图2 PTEN在不同前列腺组织中的表达图3 Western Blot检测PTEN蛋白在不同前列腺癌组织中的表达 图4 转染后PC3细胞各组中miRNA-21的表达 图5 转染后PC3各组中PTEN表达图6 Western Blot检测转染后PC3细胞中PTEN蛋白的表达结论讨论miRNA是一类长度约21个核苷酸左右的非编码单链小分子RNA，通过特异性的识别靶mRNA的3-非翻译区（3-UTR）的方式参与生物体内各个阶段的表达调控，自发现以来便引起了广泛的关注，特别是其在肿瘤发生发展中的调控机制是目前研究的热点4-8。鉴于miRNA和mRNA为非

15、特异性的结合，一个miRNA可以有众多的靶向基因，一个靶向基因也可接受多个miRNA的调控9-10。目前已证明miRNA-21已证明的靶向基因包括PTEN12-13 ，MARCKS（myristoylated alanine-rich protein kinase c substrate） 5 ,TPM 1（ tumorsuppressor gene tropomyosin l)14, and programmed cell death 4 (programmed cell death 4)15。Li5等的研究显示表明，miRNA-21的高表达除增强前列腺癌细胞的增殖和侵袭外，还在雄激素依赖性

16、前列腺癌向非依赖性前列腺癌的转化过程中起到非常重要的作用； Riabs16等随后通过小鼠模型实验证明了高表达miRNA-21促进前列腺癌的形成及癌细胞的增殖，并成功诱导前列腺癌激素非依赖表型的出现。这都以上研究均提示miRNA-21在前列腺癌发生发展中起到重要作用。PTEN是迄今发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因17。PTEN基因编码的蛋白可以使三磷酸肌醇去磷酸化而负调节PI3K/AKT/mTOR通路。PTEN的功能缺失将使PI3K产物增加，直接导致信号蛋白AKT的持续活化，mTOR作为PI3K/Akt信号通路下游的一个效应分子，AKT激活使得mTOR信号途径的上调，引起细胞异常增殖1

17、8。mTOR是一个丝氨酸和苏氨酸激酶, 它的激活可以引起前列腺癌的发生和促进前列腺癌肿瘤的生长3。而Sircar19等对患者前列腺癌患者组织检测发现超过70%出现PTEN的丢失，并且这种丢失与前列腺癌的恶性程度相关。鉴于miRNA-21与PTEN在前列腺癌的发生发展中都有重要作用，且miRNA-21相关的PTEN通路在肺癌12 、肝癌13已被证明，我们推测miRNA-21的高表达也可能通过调控抑癌基因PTEN在前列腺癌中发挥作用。为明确前列腺癌中miRNA-21是否通过调控PTEN发挥作用，本实验通过在PC3细胞中转染miRNA-21抑制剂成功抑制miRNA-21表达后，发现实验组PTEN蛋白

18、表达量较对照组明显增高（P0.05），表明PC3细胞中miRNA-21抑制PTEN的表达，即miRNA-21在转录后水平通过影响蛋白翻译作用于PTEN基因的表达；结合正常前列腺组织与前列腺癌组织中miRNA-21及PTEN的表达差异，证实了在前列腺癌中PTEN是miRNA-21的下游靶基因，同时也表明miRNA-21在前列腺癌中高表达增强了其对抑癌基因PTEN表达的抑制，导致PTEN在前列腺癌中的丢失而引起癌症的进一步发展。但由于实验条件的限制，miRNA-21的高表达与PTEN在前列腺癌中的丢失是否为浓度依赖关系还有待进一步的研究。综上所述，miRNA与其靶基因mRNA为非特异性的结合，导致

19、miRNA-21不仅作用于MARCKS5，还通过调控PTEN在前列腺癌中发挥作用，而这种可以同时调控多个下游靶向因子的优势，可能使得miRNA-21可能成为未来前列腺癌靶向治疗的重要位点。参考文献1. Majumder P K, Sellers W R. Akt-regulated pathways in prostate cancerJ. Oncogene.2005; 24(50): 7465-7474.2. Vanchier i C. Scientists hopeful as they uncover molecularlues to prostate cancerJ. JNCI. 20

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