第二章提取、分离与鉴定的方法与技术8

1、第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术第一节 提取方法与技术第二节 分离精制和鉴定的方法与技术第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术第二节 分离精制和鉴定的方法与技术一、系统溶剂分离法第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术二、两相溶剂萃取法三、沉淀法四、结晶与重结晶法五、透析法六、分馏法七、色谱法七、色谱法柱色谱法第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术薄层色谱法纸色谱法高效液相色谱法气相色谱法柱色谱法吸附柱色谱法第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术分配柱色谱法离子交换柱色谱法凝胶柱色谱法学习目标： 掌握分配色谱法分离的原理和常用支持

2、剂的类型。 2.掌握正相色谱法和反相色谱法选择固定相和移动相的原则 。 3.熟悉分配柱色谱法的适用范围。1.3.了解离子交换柱色谱法和凝胶色谱法分离原理、操作技术和适用范围 。 2 2 分配柱色谱法分配柱色谱法 分配色谱是在柱状容器中，利用被分离成分在固定相和流分配色谱是在柱状容器中，利用被分离成分在固定相和流动相两相间的分配系数不同进行分离的色谱方法。动相两相间的分配系数不同进行分离的色谱方法。 (1)(1)基本原理基本原理 由于各成分在固定相由于各成分在固定相( (液液) )和流动相和流动相( (液液) )中的分配系数不同中的分配系数不同, ,当流动相流经固定相时，各成分就在两相之间连续不

3、断地当流动相流经固定相时，各成分就在两相之间连续不断地发生发生“分配分配”，易溶于流动相中的成分，易溶于流动相中的成分( (在流动相中分配的在流动相中分配的多多) )，移行快；易溶于固定相中的成分，移行快；易溶于固定相中的成分( (在固定相中分配的在固定相中分配的多多) )，移行慢。，移行慢。 (2)(2)支持剂支持剂 支持剂又称载体、担体。支持剂又称载体、担体。作为分配色谱的支持剂应为中性作为分配色谱的支持剂应为中性多孔的粉末，无吸附作用，不溶于两相溶剂中，与被分离多孔的粉末，无吸附作用，不溶于两相溶剂中，与被分离的物质不发生化学反应，并能吸着一定量的固定相，流动的物质不发生化学反应，并能吸

4、着一定量的固定相，流动相能自由通过而不改变其组成。相能自由通过而不改变其组成。 常用的载体常用的载体*有：有：硅胶硅胶 含水量含水量17%以上的硅胶已失去吸附性，可作为载以上的硅胶已失去吸附性，可作为载体。硅胶可吸收其本身重量的体。硅胶可吸收其本身重量的50%的水分，而不显湿状。的水分，而不显湿状。硅藻土硅藻土 是现在应用最多且效果很好的一种载体。可吸是现在应用最多且效果很好的一种载体。可吸收相当于自身重量的收相当于自身重量的100%的水分。的水分。色谱滤纸或纤维素粉色谱滤纸或纤维素粉 是一种常用的支持剂，靠滤纸上是一种常用的支持剂，靠滤纸上的纤维素可吸收自身重量的纤维素可吸收自身重量100%

5、的水分。的水分。反相分配色谱多采用碳十八烷基反相分配色谱多采用碳十八烷基(-C18H37)、辛基、辛基(-C8H17）或乙基（或乙基（-C2H5）键合硅胶作固定相。）键合硅胶作固定相。 （3 3）溶剂系统）溶剂系统分配色谱中的固定相和移动相一般由二元或三分配色谱中的固定相和移动相一般由二元或三元甚至三元以上溶剂按一定比例组成复合的两元甚至三元以上溶剂按一定比例组成复合的两相溶剂系统。选择适当的溶剂系统可提高分离相溶剂系统。选择适当的溶剂系统可提高分离效率。效率。一般用纸色谱法选择分离的条件，寻找合适的一般用纸色谱法选择分离的条件，寻找合适的溶剂系统。溶剂系统。 根据固定相与流动相的相对极性大小

6、，分配色谱根据固定相与流动相的相对极性大小，分配色谱可分为正相分配色谱和反相分配色谱。可分为正相分配色谱和反相分配色谱。 （1 1）正相分配色谱）正相分配色谱固定相：固定相：常用的有水、各种水的酸、碱、盐的缓冲溶液、常用的有水、各种水的酸、碱、盐的缓冲溶液、甲醇、甲酰胺等；甲醇、甲酰胺等；流动相：流动相：用与水不相混溶（或很少混溶）的有机溶剂，用与水不相混溶（或很少混溶）的有机溶剂，如石油醚、苯、丁醇、戊醇等。如石油醚、苯、丁醇、戊醇等。适用范围：适用范围：分离亲水性成分和弱亲脂性成分。分离亲水性成分和弱亲脂性成分。 （2 2）反相分配色谱）反相分配色谱固定相：固定相：用与水不相混溶（或很少混

7、溶）的有机溶剂，用与水不相混溶（或很少混溶）的有机溶剂，如石油醚、苯、丁醇、戊醇等；如石油醚、苯、丁醇、戊醇等；流动相：流动相：常用的有水、各种水的酸、碱、盐的缓冲溶液、常用的有水、各种水的酸、碱、盐的缓冲溶液、甲醇、甲酰胺等。甲醇、甲酰胺等。适用范围：适用范围：分离强亲脂性成分时分离强亲脂性成分时, ,须采用反相分配色谱法。须采用反相分配色谱法。（4 4）被分离成分）被分离成分一般在正相色谱中，因移动相极性比固定相小，被分离一般在正相色谱中，因移动相极性比固定相小，被分离成分中极性较小的的成分迁移速度较快；在反相色谱中成分中极性较小的的成分迁移速度较快；在反相色谱中则相反。则相反。（5 5）

8、操作技术）操作技术1 1）装柱；）装柱；2 2）加样；）加样；3 3）洗脱）洗脱（6 6）特点）特点应用广泛，分离效果好。应用广泛，分离效果好。（7 7）适用范围）适用范围正相色谱法常用于分离极性较大的成分。反相色谱法主正相色谱法常用于分离极性较大的成分。反相色谱法主要用于亲脂性成分的分离，但分离效果不如吸附色谱。要用于亲脂性成分的分离，但分离效果不如吸附色谱。（8 8）提示）提示操作前，必须使固定相和移动相预先饱和；使用过程中操作前，必须使固定相和移动相预先饱和；使用过程中保持恒定温度；合理控制上样量。保持恒定温度；合理控制上样量。柱色谱法吸附柱色谱法第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的

9、方法与技术分配柱色谱法离子交换柱色谱法凝胶柱色谱法 3 离子交换色谱法离子交换色谱法以离子交换树脂为固定相，以水或含水溶剂为流动相，以离子交换树脂为固定相，以水或含水溶剂为流动相，由于各成分与树脂的交换能力不同而分离。由于各成分与树脂的交换能力不同而分离。应用：酸性、碱性及两性基团，在水中多呈解离状的成应用：酸性、碱性及两性基团，在水中多呈解离状的成分。分。 （1）基本原理）基本原理 离子交换树脂本身含有解离的阳离子或阴离子，可与水溶液离子交换树脂本身含有解离的阳离子或阴离子，可与水溶液中相同电荷的离子发生交换作用，而被吸附到柱上，再用适中相同电荷的离子发生交换作用，而被吸附到柱上，再用适当流

10、动相洗脱，即可分离混合物中离子型的化合物。当流动相洗脱，即可分离混合物中离子型的化合物。阳离子交换树脂阳离子交换树脂 阴离子交换树脂阴离子交换树脂 式中式中R-H+、R+OH-分别代表阳离子和阴离子交换树脂，可交分别代表阳离子和阴离子交换树脂，可交换的基团是换的基团是H+ 和和OH-。 HClRH BHClHRBH lClNaOHROH RCOO NaRRCOO Na OH (2)(2)离子交换树脂的类型离子交换树脂的类型 性质：性质：离子交换树脂外观为球形颗粒，不溶于水，离子交换树脂外观为球形颗粒，不溶于水，但可在水中膨胀。但可在水中膨胀。 组成：组成：离子交换树脂由树脂母核和离子交换基团。

11、离子交换树脂由树脂母核和离子交换基团。母核部分是苯乙烯通过二乙烯苯交链而成的大分子网状母核部分是苯乙烯通过二乙烯苯交链而成的大分子网状结构。网孔大小用交联度（即加入交联剂的百分数）表结构。网孔大小用交联度（即加入交联剂的百分数）表示。交联度越大，则网孔越小，质地越紧密，在水中不示。交联度越大，则网孔越小，质地越紧密，在水中不易膨胀；反之亦然。不同交联度适于分离不同大小的分易膨胀；反之亦然。不同交联度适于分离不同大小的分子。子。根据离子交换树脂中交换离子的性质不同，离子交换树根据离子交换树脂中交换离子的性质不同，离子交换树脂分两大类。脂分两大类。 1）阳离子（酸性）交换树脂）阳离子（酸性）交换树

12、脂 含有活泼的酸性基团，能交换阳离子。分为：含有活泼的酸性基团，能交换阳离子。分为：强酸型：强酸型：R-SO3H；中等酸型：中等酸型：R-COOH，R-PO3H2；弱酸型：弱酸型：R-SH。 2）阴离子（碱性）交换树脂）阴离子（碱性）交换树脂含有活泼的碱性基团，能交换阴离子。分为：含有活泼的碱性基团，能交换阴离子。分为：强碱型：强碱型：R-NR1R2R3OH；弱碱型：弱碱型：R-NH3OH，R-NH2R-OH，R-NHR1R2OH；中等碱性主体结构上既结合有强碱型离子交换基团，又中等碱性主体结构上既结合有强碱型离子交换基团，又含有弱碱性离子交换基团。含有弱碱性离子交换基团。 离子交换树脂的交换

13、能力（交换容量），取决于离离子交换树脂的交换能力（交换容量），取决于离子交换基团数量，其单位是毫摩尔子交换基团数量，其单位是毫摩尔/克（克（mmol/g）。）。强酸性阳离子交换树脂如强酸强酸性阳离子交换树脂如强酸17，表示交联度为，表示交联度为7%,其交换容量为其交换容量为4.5mmol/g，对分子量为，对分子量为166的麻的麻黄碱来说，黄碱来说，1g上述阳离子交换树脂，理论上应能交上述阳离子交换树脂，理论上应能交换换1664.5mg的麻黄碱。的麻黄碱。 样品与树脂的用量比，需根据交换容量来计算，对样品与树脂的用量比，需根据交换容量来计算，对阳离子交换树脂来说，样品的用量为总交换量的阳离子交换

14、树脂来说，样品的用量为总交换量的1/2；对阴离子交换树脂来说，样品用量为交换容量的对阴离子交换树脂来说，样品用量为交换容量的1/41/3。 (3)操作技术操作技术1）树脂的预处理：溶胀）树脂的预处理：溶胀 洗除杂质洗除杂质 树脂的转型树脂的转型2）上样）上样3）洗脱）洗脱4）再生）再生 (4)特点：特点：应用范围广，树脂可反复使用。应用范围广，树脂可反复使用。 (5)适用范围：适用范围：酸性、碱性或酸碱两性化合物的分离。酸性、碱性或酸碱两性化合物的分离。 (6)提示：提示：试样的用量由所选择的树脂的交换容量决定，试样的用量由所选择的树脂的交换容量决定，若用阳离子交换树脂，样品量可加至全交换容量

15、的若用阳离子交换树脂，样品量可加至全交换容量的1/2，若，若使用阴离子交换树脂，样品量可加全交换容量的使用阴离子交换树脂，样品量可加全交换容量的1/41/3。柱色谱法吸附柱色谱法第二章 天然药物化学成分提取分离和鉴定的方法与技术分配柱色谱法离子交换柱色谱法凝胶柱色谱法 4 4 凝胶滤过柱色谱法凝胶滤过柱色谱法 凝胶色谱法也称凝胶渗透色谱法、分子筛过滤色谱及排阻色谱凝胶色谱法也称凝胶渗透色谱法、分子筛过滤色谱及排阻色谱法等。是以凝胶为固定相，选择适当溶剂进行洗脱，使混合物法等。是以凝胶为固定相，选择适当溶剂进行洗脱，使混合物中分子量大小不同的物质分离的方法。中分子量大小不同的物质分离的方法。 （

16、1 1）基本原理：）基本原理：分子筛原理分子筛原理* * * * 凝胶是一种多孔性球形颗粒，具网状结凝胶是一种多孔性球形颗粒，具网状结 构，不溶于水，但可在水中膨胀的高分构，不溶于水，但可在水中膨胀的高分 子化合物。当凝胶用水膨胀装柱后，加子化合物。当凝胶用水膨胀装柱后，加 样品样品 入样品，用同一溶剂洗脱时，由于各种入样品，用同一溶剂洗脱时，由于各种 化合物的分子量不同，受凝胶网孔半径化合物的分子量不同，受凝胶网孔半径 限制也不同，大分子不能渗入凝胶颗粒限制也不同，大分子不能渗入凝胶颗粒 凝胶凝胶 部，随溶剂在颗粒间移动先被洗脱；内部，随溶剂在颗粒间移动先被洗脱；内 小分子因可自由渗入并扩散

17、到凝胶颗粒小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒 内部中，受到的阻力增大，流速减慢，内部中，受到的阻力增大，流速减慢， 故后被洗脱。这样混合物就按分子量由故后被洗脱。这样混合物就按分子量由 大到小先后流出而得到分离。大到小先后流出而得到分离。 (2)凝胶的类型凝胶的类型 常用葡聚糖凝胶，由葡聚糖和交联剂（如环氧氯丙烷）交联常用葡聚糖凝胶，由葡聚糖和交联剂（如环氧氯丙烷）交联聚合而成。凝胶颗粒网孔大小，取决于制备凝胶时所加交联聚合而成。凝胶颗粒网孔大小，取决于制备凝胶时所加交联剂的数量和反应条件，交联剂加入的越多，网孔越紧密，孔剂的数量和反应条件，交联剂加入的越多，网孔越紧密，孔径越小，吸水膨胀也越

18、小；交联剂加入越少，网孔越大，吸径越小，吸水膨胀也越小；交联剂加入越少，网孔越大，吸水膨胀也越大。市售的凝胶型号是按交联度大小分类，并以水膨胀也越大。市售的凝胶型号是按交联度大小分类，并以吸水量多少表示。如：吸水量多少表示。如：G-25，G为凝胶，后附的数字表示吸为凝胶，后附的数字表示吸水量乘以水量乘以10，即，即G-25表示此葡聚糖凝胶的吸水量为表示此葡聚糖凝胶的吸水量为2.5ml/g。 (3)操作技术操作技术1）凝胶的选择：根据实际工作需要选择）凝胶的选择：根据实际工作需要选择2）凝胶的浸泡溶胀）凝胶的浸泡溶胀3）装柱）装柱4）上样）上样5）洗脱）洗脱6）再生）再生 (4)(4)特点特点

19、设备简单，易于操作，分离效果好，但分离速度较慢。设备简单，易于操作，分离效果好，但分离速度较慢。 (5)(5)适用范围适用范围 分子量大小不同的化合物的分离。分子量大小不同的化合物的分离。 (6)(6)提示提示 大孔吸附树脂大孔吸附树脂 (1)(1)结构与组成：结构与组成：大孔吸附树脂为白色或淡黄色球形颗粒状，大孔吸附树脂为白色或淡黄色球形颗粒状，粒度多为粒度多为20206060目。组成为苯乙烯，二乙烯苯，或目。组成为苯乙烯，二乙烯苯，或-甲基甲基丙烯酸酯型。其中苯乙烯丙烯酸酯型。其中苯乙烯, ,二乙烯苯型为非极性树脂，二乙烯苯型为非极性树脂，2-2-甲甲基丙烯酸酯型为中极性树脂。大孔吸附树脂的结构中包含基丙烯酸酯型为中极性树脂。大孔吸附树脂的结构中包含了许多微观小球组成的网状孔穴结构。了许多微观小球组成的网状孔穴结构。 (2)(2)分离原理分离原理 吸附性：大孔吸附树脂本身具有吸附性，是由范德华力吸附性：大孔吸附树脂本身具有吸附性，是由范德华力或氢键吸附的结果。或氢键吸附的结果。 筛选性原理：是由大孔吸附树脂本身的多孔性所决定的。筛选性原理：是由大孔吸附树脂本身的多孔性所决定的。 (3)(