生物技术原理

1、基因决定性状（基因决定性状（2）家蚕能够吐出蚕丝为人类利用家蚕能够吐出蚕丝为人类利用基因决定性状（基因决定性状（3）豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮人工选择与自然选择人工选择与自然选择定向基因改造设想定向基因改造设想 设想一设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌能否让细菌“吐出吐出”蚕丝？蚕丝？设想二设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？珍贵的药物？设想三设想三 经过多年的努力，人类最终创立了可以定向经过多年的努力，人类最终创立了可以定向改造生物的新

2、技术改造生物的新技术基因工程。基因工程。生物工程或生物技术生物工程或生物技术 生物工程，又称生物技术生物工程，又称生物技术 (biotechnology)，是一门，是一门迅速发展中的边缘学科，它以分子生物学、分子遗传迅速发展中的边缘学科，它以分子生物学、分子遗传学、微生物学、生物化学和细胞学的理论和技术为基学、微生物学、生物化学和细胞学的理论和技术为基础，结合化学工程、计算技术等现代工程技术，运用础，结合化学工程、计算技术等现代工程技术，运用生物学的最新成就，定向地改造物种，再通过合适的生物学的最新成就，定向地改造物种，再通过合适的生物反应器，对这类生物反应器，对这类“工程菌工程菌”或或“工程

3、细胞株工程细胞株”进进行大规模的培养，以生产大量有用的代谢产物或发挥行大规模的培养，以生产大量有用的代谢产物或发挥它们独特生理功能的一门新兴技术。它们独特生理功能的一门新兴技术。 Molecular Biology生物工程可包括生物工程可包括n基因工程基因工程n细胞工程细胞工程n发酵工程发酵工程n酶工程酶工程n生物反应器工程生物反应器工程 等五个不同的层次。等五个不同的层次。 微生物生物工程流程微生物生物工程流程 常规菌常规菌（常规细胞株）（常规细胞株） 改造物种改造物种 (1) 基因工程基因工程 (2) 细胞工程细胞工程 工程菌工程菌（或工程细胞株）（或工程细胞株） 商品生产商品生产 (3)

4、 发酵工程发酵工程 (4) 酶工程酶工程 (5) 生物反应器工程生物反应器工程 产品产品基因工程基因工程 基因工程是一种基因工程是一种DNA的体外重组技术，是根据人们的体外重组技术，是根据人们的需要，在分子水平上用人工方法取得供体的需要，在分子水平上用人工方法取得供体DNA上的上的基因，在体外重组于载体基因，在体外重组于载体DNA上，再移入原体细胞，上，再移入原体细胞，使转录翻译及复制，表达出供体基因原有的生物学特使转录翻译及复制，表达出供体基因原有的生物学特性。性。 1973年，由美国斯坦福大学教授年，由美国斯坦福大学教授科恩科恩 (S. Cohen) 和和美国加州大学教授美国加州大学教授博

5、伊尔博伊尔 (H. Boyer) 带领各自的研究带领各自的研究组几乎同时完成了组几乎同时完成了DNA体外重组，一举打开了基因工体外重组，一举打开了基因工程学大门。程学大门。美国斯坦福大学教授科恩美国斯坦福大学教授科恩 (Stanley. Cohen)美国加州大学教授博伊尔美国加州大学教授博伊尔 (Herb. Boyer) 1968年年伯耶伯耶开始研究大肠杆菌，并从中分离得到开始研究大肠杆菌，并从中分离得到了一种限制性内切酶，根据命名原则称为了一种限制性内切酶，根据命名原则称为EcoRI，该，该酶的性质深入研究发现其可以在特定位置将酶的性质深入研究发现其可以在特定位置将DNA切开，切开，并且还可

6、以获得具有粘性末端的并且还可以获得具有粘性末端的DNA片段。片段。 Hedgpeth J, Goodman HM, Boyer HW. DNA nucleotide sequence restricted by the RI endonuclease. Proc Natl Acad Sci USA, 1972, 69(11): 3448-3452p 1973年，科恩从年，科恩从大肠杆菌大肠杆菌里取出两种不同的质粒。它们里取出两种不同的质粒。它们各自具有一个抗菌素药基因，他把两个基因各自具有一个抗菌素药基因，他把两个基因“裁剪裁剪”下来，下来，再把这两个基因再把这两个基因 “拼接拼接”在同一个质

7、粒中。当这种新的在同一个质粒中。当这种新的“杂合质粒杂合质粒”进入大肠杆菌体内后，大肠杆菌就能抵抗两进入大肠杆菌体内后，大肠杆菌就能抵抗两种药物，而且后代都具有双重抗药性。种药物，而且后代都具有双重抗药性。 p 1974年，科恩和博伊尔又把年，科恩和博伊尔又把金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌的质粒（上的质粒（上面具有抗青霉素的基因）和大肠杆菌的质粒面具有抗青霉素的基因）和大肠杆菌的质粒“组装组装”成杂成杂合质粒，送入大肠杆菌体内，使大肠杆菌获得了对青霉素合质粒，送入大肠杆菌体内，使大肠杆菌获得了对青霉素的抗药性。即金黄色葡萄球菌质粒上的抗青霉素基因，由的抗药性。即金黄色葡萄球菌质粒上的抗青霉素基因

8、，由杂合质粒带到大杆菌体内，表明外来基因在大肠杆菌体内杂合质粒带到大杆菌体内，表明外来基因在大肠杆菌体内同样能表达。同样能表达。 p 他们又将他们又将非洲爪蟾非洲爪蟾的的DNA与大肠杆菌的质粒与大肠杆菌的质粒“拼接拼接”，使大肠杆菌产生非洲爪蟾的核糖体核糖核酸（两栖动物的使大肠杆菌产生非洲爪蟾的核糖体核糖核酸（两栖动物的基因能在细菌里发挥作用，也能在细菌里不断复制，说明基因能在细菌里发挥作用，也能在细菌里不断复制，说明基因工程完全可以不受生物种类的限制，而按照人类的意基因工程完全可以不受生物种类的限制，而按照人类的意愿去拼接基因，创造新的生物）。愿去拼接基因，创造新的生物）。p 1974年年1

9、1月，他们向月，他们向USPTO申请了专利，经过漫长申请了专利，经过漫长的的6年之后，于年之后，于1980年年12月月2日获得批准。这是生物工日获得批准。这是生物工程史上的第一个克隆专利。程史上的第一个克隆专利。p 从批准该专利到该专利从批准该专利到该专利1997年年12月月2日失效的日失效的17年中，年中，该专利一共许可了该专利一共许可了468家公司，两所大学共获得了许可家公司，两所大学共获得了许可费收入约费收入约2.55亿美元。亿美元。p 这些许可费收入主要来自生物工程巨头：安进、礼这些许可费收入主要来自生物工程巨头：安进、礼莱和基因泰克。莱和基因泰克。 1976年，与风险投资家年，与风险

10、投资家罗伯特罗伯特斯万森斯万森 (Robert A. Swanson) 共同创建基因泰克共同创建基因泰克 (Genentech) 公司公司 1977年，年，Genentech公司成功实现了人类蛋白质公司成功实现了人类蛋白质生长生长 激素抑制素在大肠杆菌中的表达激素抑制素在大肠杆菌中的表达 1978年，生产出人胰岛素年，生产出人胰岛素 1979年，生产出生长素年，生产出生长素 1980年，生产出干扰素年，生产出干扰素 1980年，年，Genentech公司上市不到公司上市不到1个小时，股票就从每个小时，股票就从每 股股35美元美元 升高到升高到88美元美元博伊尔博伊尔1) 理论上的三大发现：理论

11、上的三大发现：n发现了生物的遗传物质是发现了生物的遗传物质是DNAn发现了发现了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机理分子的双螺旋结构和半保留复制机理n发现了遗传信息的传递方式发现了遗传信息的传递方式2) 技术上的三大发明：技术上的三大发明：n限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶和DNA连接酶连接酶n基因工程的载体基因工程的载体n逆转录酶的发现逆转录酶的发现基因工程的原理基因工程基因工程的理论基础的理论基础人类需要的基因产物人类需要的基因产物结结 果果剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达基本过程基本过程DNA分子水平分子水平操作水平操作水平基基 因因操作对象操作对象生物体外生物体外操作环境操作环境基

12、因拼接技术或基因拼接技术或DNA重组技术重组技术基因工程的别名基因工程的别名1) 物质基础物质基础脱氧核苷酸脱氧核苷酸2) 结构基础结构基础规则的双螺旋结构规则的双螺旋结构3) 传递与表达基础传递与表达基础中心法则，共用一套遗传密码中心法则，共用一套遗传密码克隆基因的方法克隆基因的方法 克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因：以使用以下的方法克隆目的基因： 1. PCR或或RT-PCR法法2. 从从cDNA文库中分离基因文库中分离基因3. 转座子标签法转座子标签法4. 从基因文库中分离基因从基因文库中分离基因5. 人

13、工合成法人工合成法1. 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (PCR)l PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增 (包包括分离括分离) 一段目的基因的技术。一段目的基因的技术。l 加入加入4种物质：种物质： (1) 作为模板的作为模板的DNA序列；序列；(2) 与被分离的目的基因两条链与被分离的目的基因两条链 各自各自5端序列相互补的端序列相互补的DNA引物引物 (20个左右碱基的短个左右碱基的短DNA单链单链)；(3) TaqDNA聚合酶；聚合酶；(4) dNTP (dATP, dTTP, dGTP和和dCTP)。n 聚合酶链式反应 (PCR

14、)l变性、退火、延伸三变性、退火、延伸三步曲步曲变性：双链变性：双链DNA解链解链成为单链成为单链DNA退火：部分引物与模板退火：部分引物与模板的单链的单链DNA的特定互的特定互补部位相配对和结合补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模延伸：以目的基因为模板，合成互补的新板，合成互补的新DNA链链n 聚合酶链式反应 (PCR)l每一轮聚合酶链式反应每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加可使目的基因片段增加一倍一倍30轮循环可获得轮循环可获得 230 (1.07109) 个基因片个基因片段段2. cDNA文库的构建文库的构建 cDNA文库文库：生物体全部：生物体全部mRNA的的cDNA克隆总体。

15、克隆总体。 cDNA文库中的每一个克隆只含一种文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。信息。 由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。但由于细胞中的但由于细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小分子数要比基因组的基因数小得多（通常大约仅有得多（通常大约仅有15%左右基因被表达），因此由左右基因被表达），因此由mRNA逆转录所构建的逆转录所构建的cDNA文库的库容量较基因文文库的库容量较基因文库小。库小。n 反转录人工合成互补DNA构建基因文库获取目的基因

16、构建基因文库获取目的基因存在的问题存在的问题 费时费事费时费事 内含子序列内含子序列反转录人工合成互补反转录人工合成互补DNA方方法的优势法的优势 获取的获取的DNA片段往往片段往往 具有特定功能的目的具有特定功能的目的 基因基因cDNA文库的构建10_25_cDNA.jpgMaking cDNA from mRNA using reverse transcriptase and DNA polymeraseAmino Acid CodonsalanineGCA, GCC, GCGGCU, AGA, AGGarginineAGA, AGG, CGACGC, CGG, CGUasparagine

17、AAC, AAUaspartateGAC, GAU cysteineUGC, UGUglutamateGAA, GAGglutamineCAA, CAGglycine GAA, GCC, GGGGGUhistidineCAC, CAUisoleucineAUA, AUC, AUUleucine CUA, CUC, CUGCUU, UUA, UUGlysine AAA, AAGmethionine AUGphenylalanine UUC, UUUproline CCA, CCC CCG, CCUserine UCA, UCC UCG, UCU AGC, AGUthreonine ACA, AC

18、C ACG, ACUtryptophan UGGtyrosine UCA, UCUvaline GUA, GUC GUG, GUU3. 转座子标签转座子标签 转座子是染色体上一段可移动的转座子是染色体上一段可移动的DNADNA片段，它可从染片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失生突变型，而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得一恢复。活基因的功能又可得一恢复。 遗传

19、分析可确定某基因的突变是否由转座子引起。遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起。由转座子引起的突变便可以转座子由转座子引起的突变便可以转座子DNADNA为探针，从突变株为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的的基因组文库中钓出含该转座子的DNADNA片段，并获得含有片段，并获得含有部分突变株部分突变株DNADNA序列的克隆，进而以该序列的克隆，进而以该DNADNA为探针，筛选为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。n麦克林托克麦克林托克 (Barbara McClintock，1902-1992)n1939年，年，曾曾为美国遗传学会

20、主席为美国遗传学会主席1938年提出年提出“转座基因转座基因”的概念的概念n1944年至年至1950年花了年花了6年时间才年时间才得出结论得出结论 玉米籽粒（或叶片）颜色的有无是受一些位于玉米籽粒（或叶片）颜色的有无是受一些位于9号染色体上的基因控制的，如控制色素形成的基因号染色体上的基因控制的，如控制色素形成的基因C。有。有C基因存在，籽粒（或叶片）有色，没有基因存在，籽粒（或叶片）有色，没有C基因，则表现无色。基因，则表现无色。n1951年，在冷泉港生物学专题讨论会上，递交论文年，在冷泉港生物学专题讨论会上，递交论文,被遗传学界摒弃被遗传学界摒弃n1983年获得诺贝尔生理和医学奖年获得诺贝

21、尔生理和医学奖转座子的发现转座子的发现Transposition, first discovered by Barbara McClintock (Nobel prize, 1983) when studying maize genetics, and is one of the processes by which organisms rearrange their genomes. 1951 - Theory of controlling elements in maize1983 Nobel Prize in Physiology or MedicineBarbara McClintoc

22、k (19021992)激活因子激活因子 (Activator)解离因子解离因子 (Dissociator) 斑点无色色素1. 自主性因子自主性因子 (antonomous elements) 有切离和转座的能力。由于自主因子的持续活性，它们可以插入到任何位点产生一个不稳定的或可“突变” (mutable) 等位基因。自主因子本身的丢失就使可变的等位基因变成稳定的等位基因。Ac2. 非自主性因子非自主性因子 (nonautonomous elements) 是稳定的；它们自己并不能转座或自发地改变条件，当同一家族中的不稳定成员存在于基因组中时，不论这自主因子位于何处都能使非自主因子变得不稳定。

23、Ds 转座子转移只发生在植物生长转座子转移只发生在植物生长发育的某一特定时期发育的某一特定时期 R Plasmids耐药传递因子耐药传递因子 耐药决定子耐药决定子 60年代中期，在细菌中发现年代中期，在细菌中发现了转化和转导现象；了转化和转导现象；60年代后期，在细菌中发现年代后期，在细菌中发现了了“转座子转座子”；70年代，愈来愈多的年代，愈来愈多的“跳跃跳跃基因基因” 被发现。这些因子被发现。这些因子不仅存在于细菌中，同时也不仅存在于细菌中，同时也存在于较高等的动物中。存在于较高等的动物中。R质粒就有一对插入序列质粒就有一对插入序列 (IS)，为典型的复合转座子，为典型的复合转座子 转座子

24、的分类和结构特征转座子的分类和结构特征n简单转座子简单转座子 转座子转座子 (Transposon, Tn) 是存在于染色体是存在于染色体DNA上可上可自主复制和移位的基本单位。自主复制和移位的基本单位。 最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插插入序列入序列 (Insertion Sequence, IS)，为细菌染色体或质粒为细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于的正常组成部分。一个细菌细胞常带有少于10个个IS序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该序列。转座子常常被定位到特定的基因中，造成该基因突变。基因突变。IS

25、序列都是可以独立存在的单元，带有介序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。导自身移动的蛋白。n插入序列插入序列 ：最小的转位因子，长度不超过：最小的转位因子，长度不超过2kb，不携带任何已知与插入功能无关的基因区域，往不携带任何已知与插入功能无关的基因区域，往往是插入后与插入点附近的序列共同起作用，可往是插入后与插入点附近的序列共同起作用，可能是原核细胞正常代谢的调节开关之一。能是原核细胞正常代谢的调节开关之一。 转座子IS 1IS 2IS 4IS 5IS 10RIS 50RIS 903IS序列的结构特征比较序列的结构特征比较长度(bp)两端倒置重复区(bp)靶位点正向重复区(bp

26、)76813271428119513291531随机AAAN20TTT有热点有热点有热点NGCTAGCN23411816229911或1295491057189未知靶位点转座子的分类和结构特征转座子的分类和结构特征n复合式转座子复合式转座子 (Composite Transposon) 是一类带有某是一类带有某些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼些抗药性基因（或其他宿主基因）的转座子，其两翼往往是两个相同或高度同源的往往是两个相同或高度同源的IS序列，序列，IS序列插入到序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形某个功能基因两端时就可能产生复合转座子。一旦形成复合转座子

27、，成复合转座子，IS序列就不能再单独移动，因为它们序列就不能再单独移动，因为它们的功能被修饰了，只能作为复合体移动。的功能被修饰了，只能作为复合体移动。转座子转位转座子转位n转座子转座子：长度一般超过：长度一般超过2kb，除携带与转位有关的，除携带与转位有关的基因外，还携带耐药性基因、抗金属基因、毒素基基因外，还携带耐药性基因、抗金属基因、毒素基因及其他结构基因等。因此当因及其他结构基因等。因此当Tn插入某一基因时，插入某一基因时，一方面可引起插入基因失活产生基因突变，另一方一方面可引起插入基因失活产生基因突变，另一方面可因带入耐药性基因而使细菌获得耐药性。转座面可因带入耐药性基因而使细菌获得

28、耐药性。转座子可能与细菌的多重耐药性有关。子可能与细菌的多重耐药性有关。 Transposons转座子的特征转座子的特征大肠埃希菌 (肠毒素基因)Tn1681EmTn971Em (红霉素)Tn551Tc (四环素)Tn10Cm (氯霉素)Tn9TMP (甲氧苄氨嘧啶)、SMTn7KmTn6Km (卡那霉素)Tn5AP、SM (链霉素)、Su (磺胺)Tn4AP (氨苄青霉素)Tn1 Tn2 Tn3携带耐药或毒素基因转座子部分大肠杆菌复合转座子及其特性部分大肠杆菌复合转座子及其特性转座子Tn5Tn9Tn10Tn204Tn903Tn1681所携带的基因总长度(bp)末端IS序列的长度 方向抗卡那霉

29、素抗羧苄青霉素抗四环霉素抗氯霉素抗卡那霉素抗潮霉素反向反向正向正向反向反向570026389300245731002088150014001050768768768转座子转座子Tn3的结构的结构反向重复序列反向重复序列 复合转座子复合转座子Tn10的结构的结构反向重复序列反向重复序列酵母转座子酵母转座子Ty的结构的结构编码两个蛋白质正向重复序列正向重复序列黑腹果蝇自主性黑腹果蝇自主性P转座子的结构转座子的结构反向重复序列反向重复序列发卡结构 转座重组转座重组根据转座中转座子复制与否，可分为两种：根据转座中转座子复制与否，可分为两种：1. 复制型转座复制型转座：在转座过程中转座子被复制，：在转座

30、过程中转座子被复制，1拷贝保留拷贝保留在原位点，在原位点，1拷贝被转移到新位点。依赖于转座酶及解拷贝被转移到新位点。依赖于转座酶及解离酶。离酶。2. 保守型转座保守型转座：转座过程子转座子作为一个实体被转移到：转座过程子转座子作为一个实体被转移到一个新位点。一个新位点。转座子标签转座子标签法法 转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的微微生物生物与与某一污染物降解菌混合某一污染物降解菌混合，因转座因子插入到某一，因转座因子插入到某一降解降解基因基因的的序列序列中中而破坏了该基因编码的蛋白而破坏了该基因编码的蛋白（酶）（酶），导致导致该菌该菌的的降解降

31、解性性能能的改变或的改变或丧失丧失，进而筛选出转座子，进而筛选出转座子插入插入突变突变株的方法株的方法。降解菌降解菌转座子转座子(Tn5)(Tn5)突变突变降解突变株的选择降解突变株的选择从突变株中获得转座子从突变株中获得转座子(Tn5)(Tn5)及附近序列及附近序列从降解菌中筛选降解基因从降解菌中筛选降解基因在工程菌中表达在工程菌中表达转座子标签法转座子标签法p分辨培养大肠杆菌分辨培养大肠杆菌S17-1（含（含Tn5 转座子）与降解菌转座子）与降解菌p按一定比例混合按一定比例混合p过滤，并将滤膜置于过滤，并将滤膜置于LB培养基培养培养基培养6hp用磷酸缓冲液将膜上的菌冲洗掉，稀释后涂布于选择

32、用磷酸缓冲液将膜上的菌冲洗掉，稀释后涂布于选择培养基（含培养基（含Amp及待降解物）中培养及待降解物）中培养p长出菌落即为长出菌落即为Tn5插入变异株插入变异株p筛选抗药性基因，测定上、下游序列筛选抗药性基因，测定上、下游序列转座子的遗传学效应转座子的遗传学效应4. 基因文库的构建基因文库的构建 基因文库基因文库：生物染色体基因组各：生物染色体基因组各DNA片段的克隆总片段的克隆总体。体。 文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。片段。 一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息即全部全部

33、遗传信息即全部DNA序列。序列。n 细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建l 细胞内总DNA的提取分离程序l 紫外分光光度计测定DNA溶液的纯度和浓度基因工程的操作步骤示意图cDNA文库的构建n麦克林托克麦克林托克 (Barbara McClintock，1902-1992)n1939年，年，曾曾为美国遗传学会主席为美国遗传学会主席1938年提出年提出“转座基因转座基因”的概念的概念n1944年至年至1950年花了年花了6年时间才年时间才得出结论得出结论 玉米籽粒（或叶片）颜色的有无是受一些位于玉米籽粒（或叶片）颜色的有无是受一些位于9号染色体上的基因控制的，如控制色素形成的基因号染色体上的基因控制的，如控制色素形成的基因C。有。有C基因存在，籽粒（或叶片）有色，没有基因存在，籽粒（或叶片）有色，没有C基因，则表现无色。基因，则表现无色。n1951年，在冷泉港生物学专题讨论会上，递交论