实验1 DNA提取纯化检测

1、实验一实验一 真核细胞染色体真核细胞染色体dnadna的的 分离、纯化和检测分离、纯化和检测 dna分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。dna分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定dna分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。红细胞裂解液红细胞裂解液khco3 1g (10mm)nh4cl 8.3g (155mm)e

2、dtana2 37mg (0.1mm) 裂解缓冲液（裂解缓冲液（lysis bufferlysis buffer）10mm tris-cl (ph8.0)0.1m edta (ph8.0)0.5%(m/v) sdsacdacd抗凝液抗凝液柠檬酸 0.48g柠檬酸钠 1.32g右旋葡萄糖 1.47g加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1ml acd液组织细胞组织细胞动物血液样品，将20ml新鲜血液与3.5mlacd抗凝液混匀，0下保存数天或-70下长期冻存，备用。1. 取800l抗凝血液置于5ml离心管中。2. 往管中加3ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上5分钟，期间间歇摇动 几次。3.

3、4000rpm，室温离心5分钟，弃上清。4. 往管中加入3ml红细胞裂解液，重悬沉淀，冰上5分钟，期间摇几次。5. 4000rpm，离心5分钟，弃上清。6. 重复步骤4、5四至五遍，至出现明显白色沉淀。7. 用1pbs重悬白色沉淀。8. 4000rpm，离心5分钟，弃上清。9. 每管中加入500l白细胞裂解缓冲液（每小组配制1ml)，重悬细胞，加入 20l proteinase k（20mg/ml），混匀后转移至1.5ml离心管，置55水浴 1小时。10. 加入酚：氯仿500l，盖紧后上下颠倒几次10000rpm，离心5分钟，取上层水相，至1.5ml离心管，加入氯仿500l，盖紧后上下颠倒几次

4、10000rpm，离心5分钟，取上层水相至5ml离心管。 （两次取上清前用剪刀将枪头尖剪去3mm)11. 加入1ml无水乙醇,可见混浊，盖紧后上下颠倒混匀可见dna凝集成絮状，溶液又变澄清。12. 12000rpm，离心2分钟，弃上清。13. 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm，离心2分钟，弃上清。14. 开盖室温干燥沉淀2分钟。15. 加入50l ddw（无菌水）55水浴5分钟溶解dna,取10l电泳。16. 加入3ml ddw至剩余样品中，室温混合2分钟，测od260和0d280，计算dna浓度及od260/0d280。1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。 2. 将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板负极的一端，使点样梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。 3. 制备琼脂糖凝胶：按照被分离dna分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约160毫升，小电泳槽约35毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，