微生物酵产酶课件

1、微生物发酵产酶1 第二章第二章 微生物发酵产酶微生物发酵产酶 微生物发酵产酶2 重点：重点： 微生物细胞中酶生物合成的调节，酶生物微生物细胞中酶生物合成的调节，酶生物 合成的模式，酶发酵生产的工艺条件及其合成的模式，酶发酵生产的工艺条件及其 控制，提高酶产率的措施，固定化微生物控制，提高酶产率的措施，固定化微生物 发酵产酶。发酵产酶。 微生物发酵产酶3 微生物发酵产酶微生物发酵产酶 是指在人工控制的条件下，有目的地利用微是指在人工控制的条件下，有目的地利用微 生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基 和发酵方式的选择，以及发酵条件的控制管理和发酵方式的选

2、择，以及发酵条件的控制管理 等方面的内容。等方面的内容。 微生物发酵产酶4 在一定的条件下，酶可以催化各种生化反应，在一定的条件下，酶可以催化各种生化反应， 并且具有催化效率高、转一性强和作用条件稳并且具有催化效率高、转一性强和作用条件稳 定等特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、定等特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、 环保、能源和生物工程等领域广泛应用。环保、能源和生物工程等领域广泛应用。 微生物发酵产酶5 微生物发酵产酶的工艺流程微生物发酵产酶的工艺流程 微生物发酵产酶6 产酶菌种的筛选产酶菌种的筛选 含菌样品的采集含菌样品的采集, ,菌种分离菌种分离, ,产酶性能测定及复产酶性能测定

3、及复 筛等全过程。筛等全过程。 微生物发酵产酶7 微生物发酵产酶8 一个优良的产酶菌种应具备以下几点：一个优良的产酶菌种应具备以下几点： a a 繁殖快繁殖快, ,产酶量高，有利于缩短生产周期产酶量高，有利于缩短生产周期 b b 容易培养和管理容易培养和管理 c c 产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭 d d 产生的酶容易分离纯化产生的酶容易分离纯化 e e 安全可靠、无毒性安全可靠、无毒性 微生物发酵产酶9 微生物酶的类型微生物酶的类型 1.1.胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的 酶。包括位于细胞外表

4、面或细胞外质空间的酶。包括位于细胞外表面或细胞外质空间的 酶，也指酶，也指释放入培养基释放入培养基的的酶酶。 大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素纤维素 酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的 大分子而释放到细胞外的。大分子而释放到细胞外的。 微生物发酵产酶10 2.2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用 的酶的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有 着一定的分布。着一定的分布。 如线粒体上分布着三羧酸循环酶系和氧化如线粒体上分布着三羧酸循环酶系和氧化

5、磷酸化酶系，而蛋白质合成的酶系则分布在磷酸化酶系，而蛋白质合成的酶系则分布在 内质网的核糖体上。内质网的核糖体上。 微生物发酵产酶11 酶的发酵生产方式酶的发酵生产方式 固体培养发酵固体培养发酵: :把菌种接入固体培养基中把菌种接入固体培养基中, , 保温数天保温数天, ,用水或缓冲液浸泡培养基用水或缓冲液浸泡培养基, ,将酶抽将酶抽 提提, ,测定酶活力测定酶活力, ,这种方法主要适用于霉菌这种方法主要适用于霉菌. . 适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较 简单的产品。简单的产品。 微生物发酵产酶12 液体深层发酵液体深层发酵: :采用液体培养基采

6、用液体培养基, ,置于生物置于生物 反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细 胞，在一定条件下，进行发酵，生产得到所胞，在一定条件下，进行发酵，生产得到所 需的酶需的酶. . 适合于大规模工业化生产。适合于大规模工业化生产。 微生物发酵产酶13 液体深层发酵液体深层发酵优点优点 液体悬浮状态是很多微生物的最适生长条件液体悬浮状态是很多微生物的最适生长条件 在液体中菌体、营养物、产物易于扩散，便于控制在液体中菌体、营养物、产物易于扩散，便于控制 液体输送方便，易于机械化操作液体输送方便，易于机械化操作 占地面积小，生产效率高，易进行自动化控制占地面积小，生产效

7、率高，易进行自动化控制 产品易于提取和精制等产品易于提取和精制等 微生物发酵产酶14 固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵 前者是前者是2020世纪世纪7070年代后期，在固定化酶的基础上发展起年代后期，在固定化酶的基础上发展起 来的发酵技术。是固定在水不溶性的载体上，在一定的来的发酵技术。是固定在水不溶性的载体上，在一定的 空间范围内进行生命活动的细胞。空间范围内进行生命活动的细胞。 后者是后者是2020世纪世纪8080年代中期发展起来的技术。是固定在载年代中期发展起来的技术。是固定在载 体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。

8、体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。 微生物发酵产酶15 固定化酶的优缺点固定化酶的优缺点 优点优点 多次使用多次使用 可以连续反应可以连续反应 纯化简单纯化简单 提高产物质量提高产物质量 应用范围广应用范围广 微生物发酵产酶16 固定化原生质体的优点固定化原生质体的优点 属于胞内产物的胞内酶等分泌到胞外属于胞内产物的胞内酶等分泌到胞外 稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间稳定性较好，可以连续或重复使用较长时间 微生物发酵产酶17 第一节第一节 酶生物合成的基本理论酶生物合成的基本理论 提取分离法提取分离法 微生物细胞发酵产酶微生物细胞发酵产酶 酶的生产方法酶的生产方法 生物合成

9、法生物合成法 植物细胞发酵产酶植物细胞发酵产酶 化学合成法化学合成法 动物细胞发酵产酶动物细胞发酵产酶 微生物发酵产酶18 一、酶的生物合成一、酶的生物合成 遗传信息传递的中心法则遗传信息传递的中心法则 蛋白质蛋白质 翻译翻译 转录转录 逆转录逆转录 复制复制 复制复制 DNA RNA 微生物发酵产酶19 （一）（一）RNARNA的生物合成的生物合成-转录转录(transcription) 定义定义 以以DNADNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在为模板，以核苷三磷酸为底物，在 RNARNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNARNA分分 子的过程。子的过程。 微生物

10、发酵产酶20 转录模板转录模板 启动子（启动子（promotor) 终止子终止子(terminator) 模板链（模板链（template strand） 反意义链反意义链(antisense strand) 编码链编码链 (coding strand) 有意义链有意义链(sense strand) 5 5 3 3 反意义链反意义链: :指导转录作用的一条指导转录作用的一条DNADNA链链 有意义链有意义链: :无转录功能的一条无转录功能的一条DNADNA链链. . 微生物发酵产酶21 T C G A G T A C A G C T C A T G C G A G U A C G C A U

11、RNA聚合酶聚合酶 有意义链有意义链 反意义链反意义链 RNA PPi 55 55 33 GTP UTP CTP ATP UTP RNA在在DNA模板上的生物合成模板上的生物合成 33 33 55 微生物发酵产酶22 RNARNA的转录过程的转录过程( (三步三步) ) 1.1.起始起始 2.2.延长延长 3.3.终止终止 微生物发酵产酶23 原核生物的原核生物的RNA聚合酶聚合酶(DDRP) E. coliE. coli的的RNARNA聚合酶是由四种亚基组成的五聚体聚合酶是由四种亚基组成的五聚体 （ 2 2 ） 核心酶（core enzyme） 全酶（holoenzyme） 起始因子 微生物

12、发酵产酶24 RNARNA合成过程合成过程 起始起始 双链双链DNA 局部解开局部解开 磷酸二酯磷酸二酯 键形成键形成 终止阶段终止阶段 解链区到达解链区到达 基因终点基因终点 延长阶段延长阶段 5 3 RNA 启动子（启动子（ promotor) 终止子终止子 (terminator) 5 RNA聚合酶聚合酶 5 3 5 3 5 5 3 离开离开 微生物发酵产酶25 RNA链的延伸图解链的延伸图解 3 5 RNA-DNA杂交螺旋杂交螺旋 聚合酶的移动方向聚合酶的移动方向 新生新生RNA 复链复链 解链解链 有义链有义链 模板链（反义链）模板链（反义链） 延长部位延长部位 微生物发酵产酶26

13、启动子：在启动子：在DNADNA分子上，分子上，RNARNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的 核苷酸序列，即转录作用起始的部位。核苷酸序列，即转录作用起始的部位。 终止子：终止子：DNADNA上的一段核苷酸序列，给上的一段核苷酸序列，给RNARNA聚合酶聚合酶 提供终止转录的信号，也称终止序列。提供终止转录的信号，也称终止序列。 操纵子：转录的功能单位。操纵子：转录的功能单位。 （调控系统和结构基因的综合）。（调控系统和结构基因的综合）。 微生物发酵产酶27 微生物发酵产酶28 原核生物的基因组成原核生物的基因组成 （1 1）基因区：操纵子形式存在，但各基因分别有）基因区：操纵子形式存在，

14、但各基因分别有 ATGATG的起始密码子和的起始密码子和TAATAA（TAGTAG、TGATGA）的终止密）的终止密 码子。码子。 （2 2）启动区：）启动区：RNApolRNApol识别、结合和开始转录的一识别、结合和开始转录的一 段段DNADNA核苷酸序列。核苷酸序列。 5TTGACATATAATA/G3 3AACTGTATATTAT/C5 -35序列序列-10序列序列 识别序列识别序列Pribnow框框转录起点转录起点 1619bp59bp 微生物发酵产酶29 （3 3）SDSD区：在起始密码子区：在起始密码子ATGATG上游约上游约10bp10bp处，有处，有 一个富含嘌呤的保守序列，

15、其与一个富含嘌呤的保守序列，其与16S rRNA316S rRNA3端端 序列互补。序列互补。 结 构 基 因 的 组 成 100bp 启 动 子 区SD区转 录 区 转录中止区 ATGORF TAA、TGA、TAG SD序列：序列：5AGGAGGU3 3UCCUCCA5 16S rRNA 微生物发酵产酶30 （4 4）转录终止子和终止因子）转录终止子和终止因子 转录终止子：一个基因或一个操纵子转录终止子：一个基因或一个操纵子33端，提供转录停止信号端，提供转录停止信号 的的DNADNA核苷酸序列。核苷酸序列。 终止因子：协助终止因子：协助mRNAmRNA聚合酶识别终止信号的辅助因子的蛋白。聚

16、合酶识别终止信号的辅助因子的蛋白。 A. -independent 微生物发酵产酶31 真核生物基因组成真核生物基因组成 （1 1）基因区：）基因区： 微生物发酵产酶32 （2 2）转录启动区：）转录启动区： mRNA rDNAmDNAtDNA rRNA tRNA RNApoLIRNApoLIIIRNApoLII aa 3 5 构成核糖体构成核糖体 N mRNA protein P1 P3P2 DNA 微生物发酵产酶33 （3 3）转录终止子：）转录终止子： 对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解 甚少。但在高等真核生物的细胞中，甚少。但在高等真核生物

17、的细胞中，mRNAmRNA在靠在靠 近近3 3端区有一段非常保守的序列端区有一段非常保守的序列 AAUAAAAAUAAA，这，这 一序列为链的切断和一序列为链的切断和poly(A)poly(A)化提供了某些终化提供了某些终 止信号。止信号。 微生物发酵产酶34 定义定义 以以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，在核糖为模板，以氨基酸为底物，在核糖 体上通过各种体上通过各种tRNAtRNA、酶和辅助因子的作用，合、酶和辅助因子的作用，合 成多肽链的过程。成多肽链的过程。 （二）蛋白质的生物合成（二）蛋白质的生物合成-翻译翻译(translation) 微生物发酵产酶35 酪酪 55 5533

18、 AUG GUU UAC ACA 酪氨酰酪氨酰- tRNA 反密码反密码 mRNA 密码与反密码的碱基配对密码与反密码的碱基配对 微生物发酵产酶36 AUG ACA 55 蛋蛋 苏苏 UGU GUU 33 受受 位位 (A位位) 给给 位位 (P位位) 大亚基大亚基 小亚基小亚基 微生物发酵产酶37 原核生物真核生物 核蛋 白体 小亚基大亚基 核蛋 白体 小亚基大亚基 S70S30S50S80S40S60S rRNA 16S- rRNA 5S-rRNA 23S-rRNA 18S- rRNA 28S-rRNA 5S-rRNA 5.8S-rRNA 蛋白 质 rpS 21种rpL 36种rpS 33

19、种rpL 49种 不同细胞核糖体的组成不同细胞核糖体的组成 微生物发酵产酶38 核核 蛋蛋 白白 体体 的的 组组 成成 微生物发酵产酶39 小亚基貌似一个动物胚胎，由头部、基部和平台组成，平小亚基貌似一个动物胚胎，由头部、基部和平台组成，平 台与头部之间有一个裂隙；大亚基很像一个沙发，有一个柄、台与头部之间有一个裂隙；大亚基很像一个沙发，有一个柄、 一个中央凸出部和一个脊；一个中央凸出部和一个脊； 二者组装成核糖体时，小亚基头部与大亚基凸出部之间形二者组装成核糖体时，小亚基头部与大亚基凸出部之间形 成一个隧道，在蛋白质合成中成一个隧道，在蛋白质合成中mRNAmRNA很可能从这里通过。很可能从

20、这里通过。 大肠杆菌核糖体三维结构模型大肠杆菌核糖体三维结构模型 微生物发酵产酶40 蛋白质的合成过程蛋白质的合成过程 （大肠杆菌）（大肠杆菌） v 氨基酸的活化氨基酸的活化 v 肽链合成的起始肽链合成的起始 v 肽链的延伸肽链的延伸 v 肽链合成的终止与释放肽链合成的终止与释放 微生物发酵产酶41 氨基酸的活化与转运氨基酸的活化与转运 反应式：反应式： AA + tRNA + ATPAA + tRNA + ATP 氨酰氨酰-tRNA-tRNA合成酶合成酶 氨酰氨酰-tRNA-tRNA+AMP+PPi +AMP+PPi 对于对于E.coliE.coli而言，肽链合成时的第一而言，肽链合成时的第

21、一 个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（个氨基酸都是甲酰甲硫氨酸（fMetfMet）。）。 微生物发酵产酶42 在核糖体上合成多肽（三阶段）在核糖体上合成多肽（三阶段） 1 1、起始阶段、起始阶段 2 2、延伸阶段、延伸阶段 3 3、终止阶段、终止阶段 微生物发酵产酶43 肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段 1.1.mRNAmRNA与小亚基结合：与小亚基结合：形成形成30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3复合物复合物 2.2.AUGAUG与蛋氨酰与蛋氨酰- -tRNAtRNA结合：结合： 30S-mRNA-IF30S-mRNA-IF3 3 fMet-tRNA-IF fMet-tRNA-IF

22、2 2-GTP-GTP fMet-tRNA fMet-tRNA正好位于正好位于mRNAmRNA的起始密码子上（的起始密码子上（AUGAUG）。）。 3.3.大小亚基结合大小亚基结合 IF1 30S30S起始复合物起始复合物 微生物发酵产酶44 AUG ACA 5533 AUG ACA 5533 UACUAC AUG ACA 5533 小亚基小亚基 mRNA 蛋氨酰蛋氨酰tRNA GTP 大亚基大亚基 GDP+Pi 受位受位给位给位 蛋蛋蛋蛋 肽链合成的起始阶段肽链合成的起始阶段 微生物发酵产酶45 肽链合成的延伸阶段肽链合成的延伸阶段 1.1.进位进位: :氨基酰氨基酰-tRNA-tRNA进入

23、受位进入受位; ; 2.2.转肽转肽: :形成肽键形成肽键, ,在转肽酶作用下在转肽酶作用下, ,给位与给位与 受位结合受位结合; ; 3.3.移位移位: :核蛋白体向核蛋白体向33端移动一个密码子的端移动一个密码子的 位置位置, ,空出受位空出受位, ,不断地进位、转肽、不断地进位、转肽、 移位移位, ,使肽链延长。使肽链延长。 微生物发酵产酶46 AUG ACA 5533 UAC 蛋蛋 苏苏 UGU AUG ACA 55 UAC 蛋蛋苏苏 UGU GUU AUG ACA 55 UAC 蛋蛋 苏苏 UGU GUUAUG ACA 55 蛋蛋 苏苏 UGU GUU 33 33 33 GTP GD

24、P+Pi GDP+PiGTP 起始复合体起始复合体进位进位 转肽转肽 移位移位 Mg+ K+ 微生物发酵产酶47 肽链合成的终止阶段肽链合成的终止阶段 1.1.出现终止密码并与终止因子结合出现终止密码并与终止因子结合; ; 2.2.肽键水解肽键水解, ,多肽释放多肽释放; ; 3.3.tRNA,mRNAtRNA,mRNA, ,大小亚基解离大小亚基解离. . 微生物发酵产酶48 AUG UAA 55 UAC AUG UAA 55 UAC 3333 终终 终终 AUG UAA 55 UAC 33 终终 5533UAC 终终 肽链肽链 微生物发酵产酶49 二、酶生物合成的调节二、酶生物合成的调节 定

25、义：定义：通过调节酶合成的量来控制微生物通过调节酶合成的量来控制微生物 代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上代谢速度的调节机制，是在基因转录水平上 进行的。进行的。 意义：意义：通过阻止酶的过量合成，节约生物通过阻止酶的过量合成，节约生物 合成的原料和能量。合成的原料和能量。 微生物发酵产酶50 操纵子操纵子基因表达的协同单位基因表达的协同单位 操纵子操纵子 结构基因结构基因（编码蛋白质（编码蛋白质, , structural gene, S） 控制部位控制部位 操纵基因操纵基因（operator gene, O） 启动子启动子（promotor gene, P） Jacob and Mon

26、od的的 微生物发酵产酶51 调节基因调节基因(regulator gene)： 可产生一种组成型可产生一种组成型调节蛋白调节蛋白(regulatory protein) ， 通过与效应物通过与效应物(effector) （包括诱导物或辅阻遏物）（包括诱导物或辅阻遏物） 的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基 因的结合力。因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。调节基因常位于调控区的上游。 微生物发酵产酶52 基因操纵子调节系统示意图基因操纵子调节系统示意图 调节基因调节基因 启动基因启动基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 DNA 转录

27、转录 （-） RNA聚合酶聚合酶 （+） 转录转录 翻译翻译 mRNA 翻译翻译 阻遏蛋白阻遏蛋白 蛋白质蛋白质 诱导剂诱导剂 控制区控制区 信息区信息区 操纵子操纵子 微生物发酵产酶53 RPOSD N A C RP-cA M P 复 合 物 C RP+cA M P cAMP-CRP复合物的作用示意图 启动基因启动基因（promotor gene）（）（启动子）：启动子）： 有两个位点：有两个位点： （1 1）RNARNA聚合酶的结合位点聚合酶的结合位点 （2 2）cAMP-CAPcAMP-CAP的结合位点。的结合位点。 CAPCAP：分解代谢产物基因活化蛋白：分解代谢产物基因活化蛋白（ca

28、tabolite gene activator protein），），又称环腺苷酸受体蛋白又称环腺苷酸受体蛋白(cAMP receptor protein，CRP）。）。 只有只有cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合到启动子的位点上，复合物结合到启动子的位点上，RNARNA 聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才聚合酶才能结合到其在启动子的位点上，酶的合成才 能开始。能开始。 微生物发酵产酶54 操纵基因操纵基因（Operater gene）: : 位于启动基因和结构基因之间的一段碱位于启动基因和结构基因之间的一段碱 基顺序，能特异性地与调节基因产生的变构基顺序，能特异性地与调节

29、基因产生的变构 蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。蛋白结合，操纵酶合成的时机与速度。 结构基因结构基因（Structural gene）: : 决定某一多肽的决定某一多肽的DNADNA模板，与酶有各自模板，与酶有各自 的对应关系，其中的遗传信息可转录为的对应关系，其中的遗传信息可转录为mRNAmRNA， 再翻译为蛋白质。再翻译为蛋白质。 微生物发酵产酶55 ( (二二) ) 酶合成调节的类型酶合成调节的类型 1.1.诱导诱导 (induction) 组成酶：细胞固有的酶类。组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的

30、一类酶。物而临时合成的一类酶。 2.2.阻遏阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏反馈阻遏(feedback repression) 微生物发酵产酶56 酶合成诱导的现象：酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有：已知分解利用乳糖的酶有： - -半乳糖苷酶；半乳糖苷酶； 透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验：实验：（1 1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无 上述三种酶合成；上述三种酶合成； （2 2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内

31、有上述三种）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种 酶合成；酶合成； 表明菌体生物合成的经济原则：表明菌体生物合成的经济原则：需要时才合成需要时才合成。 微生物发酵产酶57 调节调节 基因基因 操纵操纵 基因基因 乳糖结构基因乳糖结构基因 P LacZLacYLaca mRNA 阻遏蛋白阻遏蛋白 （有活性）（有活性） 基基 因因 关关 闭闭 启启 动动 子子 O R PLacZLacYLaca 调节调节 基因基因 操纵操纵 基因基因 乳糖结构基因乳糖结构基因 启启 动动 子子 O R mRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白阻遏蛋白 （无活性）（无活性） 基基 因因 表表 达达 mRN

32、A A、乳糖操纵子的结构、乳糖操纵子的结构 B、乳糖酶的诱导、乳糖酶的诱导 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白 （有活性）（有活性） 微生物发酵产酶58 2. 2.末端产物阻遏末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象：酶合成阻遏的现象： 实验：实验： （1 1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时，）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测检测 到细胞内有色氨酸合成酶的存在；到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2 2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸 合成酶

33、的活性降低，直至消失。合成酶的活性降低，直至消失。 表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌 体生长的经济原则体生长的经济原则: :不需要就不合成不需要就不合成。 微生物发酵产酶59 色氨酸操纵子色氨酸操纵子酶的阻遏酶的阻遏 调节基因调节基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 mRNAmRNA 酶蛋白酶蛋白 阻遏蛋白不能与操纵基因结合，阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 结构基因表达结构基因表达 调节基因调节基因 操纵基因操纵基因 结构基因结构基因 辅阻遏物辅阻遏物 代谢产物与阻遏蛋白结代谢产物与阻遏蛋白结 合，使之构象发生变化合，使之构

34、象发生变化 与操纵基因结合，结构与操纵基因结合，结构 基基 因不能表达因不能表达 微生物发酵产酶60 酶酶 的的 诱诱 导导 和和 阻阻 遏遏 操操 纵纵 子子 模模 型型 B.有活性阻遏蛋白加诱导剂有活性阻遏蛋白加诱导剂 A.有活性阻遏蛋白有活性阻遏蛋白 C.无活性阻遏蛋白无活性阻遏蛋白 D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂 操纵基因操纵基因启动基因启动基因 调节基因调节基因结构基因结构基因 阻遏蛋白阻遏蛋白 (有活性有活性) 阻遏蛋白阻挡操纵基因阻遏蛋白阻挡操纵基因 结构基因不表达结构基因不表达 诱导物诱导物 诱导物与阻遏蛋白结合诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白不能起使阻遏

35、蛋白不能起 到阻挡操纵基因的作用到阻挡操纵基因的作用,结构基因可以表达结构基因可以表达 酶蛋白酶蛋白 mRNA 阻遏蛋白不能跟操纵基因结合阻遏蛋白不能跟操纵基因结合, 结构基因可以表达结构基因可以表达 阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性) 酶蛋白酶蛋白 mRNA 代谢产物与阻遏蛋白结合代谢产物与阻遏蛋白结合,从而使阻遏蛋从而使阻遏蛋 白能够阻挡操纵基因白能够阻挡操纵基因,结构基因不表达结构基因不表达 代谢产物代谢产物 微生物发酵产酶61 调控方式调控方式 阻遏蛋白阻遏蛋白 添加物添加物 与操纵基与操纵基 因结合因结合 阻遏效应阻遏效应举例举例 酶的诱导酶的诱导有活性有活性不转录，不转录， 继而不翻

36、译继而不翻译 诱导物诱导物转录，转录， 继而翻译继而翻译 乳糖操乳糖操 纵子纵子 酶的阻遏酶的阻遏无活性无活性 阻遏物阻遏物不转录，不转录， 继而不翻译继而不翻译 色氨酸色氨酸 操纵子操纵子 酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比 微生物发酵产酶62 3.3.分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 n指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮 源）存在时，利用快的那种分解底物会阻源）存在时，利用快的那种分解底物会阻 遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 n分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利分解代谢物

37、的阻遏作用，并非由于快速利 用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通 过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所 产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。 微生物发酵产酶63 分解代谢物阻遏现象：分解代谢物阻遏现象： 实验：实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡 萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长 期中间隔开一个生长延滞期的期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象二次生

38、长现象”(diauxie(diauxie或或 biphasic growthbiphasic growth）。）。 02468 0 20 40 60 80 细胞 浓 度(OD) 时 间(h) 这一现象又称葡萄糖效应，产这一现象又称葡萄糖效应，产 生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏 了分解乳糖酶系的合成。了分解乳糖酶系的合成。此调节基此调节基 因的产物是环腺苷酸受体蛋白因的产物是环腺苷酸受体蛋白 （CRPCRP）, ,亦称亦称降解物基因活化蛋白降解物基因活化蛋白 （CAPCAP）。）。 微生物发酵产酶64 分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏 RLacZLacYLaca mRN

39、A mRNAZmRNAYmRNAa 基基 因因 表表 达达 CAP 基因基因 结构基因结构基因 T CAP O CAP结结 合部位合部位 RNA 聚合酶聚合酶 T cAMP -CAP P 葡萄糖葡萄糖 分解代分解代 谢产物谢产物 腺苷酸腺苷酸 环化酶环化酶 磷酸二酯磷酸二酯 酶酶 ATP cAMP 5-AMP 抑制抑制 激活激活 葡萄糖降解物与葡萄糖降解物与cAMP的关系的关系 cAMP CAP：降解物基因活化蛋白（：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein） 降低降低cAMP浓度浓度 使使CAP呈失活状态呈失活状态 微生物发酵产酶65 真真 核核

40、 生生 物物 酶酶 生生 物物 合合 成成 的的 调调 节节 细胞分化改变酶的生物合成细胞分化改变酶的生物合成 基因扩增加速酶的生物合成基因扩增加速酶的生物合成 增强子促进酶的生物合成增强子促进酶的生物合成 抗原诱导抗体酶的生物合成抗原诱导抗体酶的生物合成 微生物发酵产酶66 1010月月4 4日，在瑞典首都斯德哥尔摩的卡罗林斯卡医学院，诺贝尔奖评审日，在瑞典首都斯德哥尔摩的卡罗林斯卡医学院，诺贝尔奖评审 委员会宣布，委员会宣布，英国生理学家罗伯特英国生理学家罗伯特爱德华兹获得爱德华兹获得20102010年诺贝尔生理学或年诺贝尔生理学或 医学奖。医学奖。 今年岁的爱德华兹因创立今年岁的爱德华兹

41、因创立体外受精技术体外受精技术而获得这一奖项。爱德华兹现在是而获得这一奖项。爱德华兹现在是 英国剑桥大学的名誉教授。英国剑桥大学的名誉教授。 体外受精技术俗称体外受精技术俗称试管婴儿技术试管婴儿技术。医学统计显示，世界上每十对夫妇中就有一。医学统计显示，世界上每十对夫妇中就有一 对有生育问题，而试管婴儿技术可以帮助其中绝大多数夫妇实现有自己后代的对有生育问题，而试管婴儿技术可以帮助其中绝大多数夫妇实现有自己后代的 梦想。自年第一个试管婴儿路易丝梦想。自年第一个试管婴儿路易丝布朗呱呱坠地，全球已有布朗呱呱坠地，全球已有 万人通过试管婴儿技术出生，其中许多人通过自然受精方式生育了下一代。万人通过试

42、管婴儿技术出生，其中许多人通过自然受精方式生育了下一代。 试管婴儿之父试管婴儿之父 爱德华兹爱德华兹 微生物发酵产酶67 北京时间北京时间1010月月5 5日下午日下午1717时时3030分，分，20092009年度诺贝尔生理学或医学年度诺贝尔生理学或医学 奖在瑞典卡罗林斯卡医学院揭晓，三位美国科学家共同获得该奖在瑞典卡罗林斯卡医学院揭晓，三位美国科学家共同获得该 奖项。发现了奖项。发现了端粒和端粒酶端粒和端粒酶保护染色体的机理保护染色体的机理 杰克绍斯塔克杰克绍斯塔克 （Jack W.Szostak） 卡罗尔格雷德卡罗尔格雷德 （Carol W.Greider） 伊丽莎白布赖克本伊丽莎白布赖

43、克本 （Elizabeth H.Blackburn） 微生物发酵产酶68 08/10/608/10/6，瑞典，瑞典， “诺贝尔路号诺贝尔路号”的卡罗林斯卡医学的卡罗林斯卡医学 院院“诺贝尔论坛楼诺贝尔论坛楼”内举行，诺贝尔奖评审委员会成员内举行，诺贝尔奖评审委员会成员 走上讲台，宣布了走上讲台，宣布了0808年诺贝尔生理学或医学奖得主。年诺贝尔生理学或医学奖得主。 微生物发酵产酶69 德国德国 哈拉尔德哈拉尔德楚尔楚尔豪森豪森 Harald zur Hausen 法国法国 巴尔巴尔- -西诺西西诺西 Franoise Barr-Sinoussi 法国法国 吕克吕克- -蒙塔尼蒙塔尼 Luc M

44、ontagnier 微生物发酵产酶70 他们分别在他们分别在宫颈癌致病因子和艾滋病病毒宫颈癌致病因子和艾滋病病毒研究上有突出成就研究上有突出成就 （德国科学家因发现人乳突淋瘤病毒引发子宫颈癌获此殊荣，（德国科学家因发现人乳突淋瘤病毒引发子宫颈癌获此殊荣， 两名法国科学家因发现人类免疫缺陷病毒获此殊荣。）两名法国科学家因发现人类免疫缺陷病毒获此殊荣。） 诺贝尔奖正式颁奖典礼每年诺贝尔奖正式颁奖典礼每年1212月月1010日在诺贝尔逝世纪念日这一日在诺贝尔逝世纪念日这一 天分别在瑞典首都斯德哥尔摩和挪威首都奥斯陆举行。天分别在瑞典首都斯德哥尔摩和挪威首都奥斯陆举行。 本年度诺贝尔奖各奖项得主将独享

45、或分享总额为万瑞本年度诺贝尔奖各奖项得主将独享或分享总额为万瑞 典克朗（约合万美元）的奖金。典克朗（约合万美元）的奖金。 微生物发酵产酶71 07/10/807/10/8，瑞典，诺贝尔生理学和医学组委会及评审委，瑞典，诺贝尔生理学和医学组委会及评审委 员会秘书汉斯员会秘书汉斯约纳沃博士宣布约纳沃博士宣布20072007年诺奖医学奖得主年诺奖医学奖得主 微生物发酵产酶72 马里奥马里奥卡佩奇卡佩奇 （美国）（美国） 马丁马丁埃文斯埃文斯 （英国）（英国） 奥利弗奥利弗史密史密 斯（美国）斯（美国） 微生物发酵产酶73 他们在改造活体内特定基因的他们在改造活体内特定基因的“基因靶向基因靶向” 技术

46、技术 等方面做出了奠基性贡献。等方面做出了奠基性贡献。 基因靶向技术是指利用细胞脱氧核糖核酸基因靶向技术是指利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)可可 与外源与外源DNADNA同源序列发生同源重组的性质，定向改造同源序列发生同源重组的性质，定向改造 生物某一基因的技术。生物某一基因的技术。 它可用于有针对性地寻找某些遗传性疾病的疗法。它可用于有针对性地寻找某些遗传性疾病的疗法。 微生物发酵产酶74 第二节第二节 常用的产酶微生物常用的产酶微生物 微生物发酵产酶75 一、一、 用于酶的生产的细胞必须具备以下几个条件：用于酶的生产的细胞必须具备以下几个条件： a a 产酶量高产酶量高 b b 容

47、易培养和管理容易培养和管理 c c 产酶稳定性好产酶稳定性好 d d 利于酶的分离纯化利于酶的分离纯化 e e 安全可靠、无毒性安全可靠、无毒性 微生物发酵产酶76 二、常用的微生物二、常用的微生物 细菌细菌 放线菌放线菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 微生物发酵产酶77 微生物微生物 每克土壤中的数量每克土壤中的数量 细菌细菌 9.89.810107 7 放线菌放线菌 2.02.010106 6 真菌真菌 1.21.210105 5 藻菌藻菌 2.52.510104 4 原生动物原生动物 3.03.010104 4 微生物发酵产酶78 空气清洁度空气清洁度 菌落数菌落数 最清洁的空气最清洁的空气

48、1-21-2 洁净空气洁净空气 3030个以下个以下 普通空气普通空气 30-15030-150 轻度污染空气轻度污染空气 300300以下以下 严重污染空气严重污染空气 301301以上以上 微生物发酵产酶79 部位部位 含量含量部位部位 含量含量 眼睛眼睛 1g1g 肺肺 20g20g 鼻腔鼻腔 10g10g肠道肠道 1000g1000g 口腔口腔 20g20g生殖道生殖道20 g20 g 皮肤皮肤 200g200g总量总量 1271g1271g 微生物发酵产酶80 回肠回肠 结肠结肠 直肠或粪便直肠或粪便 双歧杆菌双歧杆菌10104 4 10 107 7 10 1010 10 拟杆菌拟杆

49、菌10103 3 10 108 8 10 1010 10 肠杆菌肠杆菌10103 3 10 106 6 10 106 6 肠球菌肠球菌 10107 7 乳杆菌乳杆菌 10104 4 微生物发酵产酶81 细菌的结构细菌的结构 微生物发酵产酶82 细菌的繁殖：细菌的繁殖： 微生物发酵产酶83 细菌的菌落细菌的菌落 定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时， 会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子 细胞群体。细胞群体。 特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬

50、度、透明度等。 功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落可以作为菌功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落可以作为菌 种鉴定的重要依据。种鉴定的重要依据。 微生物发酵产酶84 大肠杆菌大肠杆菌 微生物发酵产酶85 枯草杆菌枯草杆菌 微生物发酵产酶86 放线菌菌落及形态放线菌菌落及形态 微生物发酵产酶87 放线菌的结构放线菌的结构 微生物发酵产酶88 放线菌的分布放线菌的分布 放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底放线菌在自然界分布很广，在土壤、堆肥和湖底、河底 的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。 放线菌的繁殖放线菌的繁殖 主要通过形成无性抱子

51、形式进行无性繁殖，成熟的生孢主要通过形成无性抱子形式进行无性繁殖，成熟的生孢 子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。 微生物发酵产酶89 链霉菌链霉菌 微生物发酵产酶90 酵母菌酵母菌 主要分布于含糖质较多偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花主要分布于含糖质较多偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花 蜜和植物叶片上，果园土壤中，石油酵母多分布在油田周围蜜和植物叶片上，果园土壤中，石油酵母多分布在油田周围 的土壤中。的土壤中。 多数为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。多数为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。 微生物发酵产酶91 啤酒酵母菌啤

52、酒酵母菌 微生物发酵产酶92 霉菌霉菌 分布很广分布很广 土壤、空气、水和生物体内大量存在土壤、空气、水和生物体内大量存在 偏酸性环境中多数以无性孢子繁殖为主。偏酸性环境中多数以无性孢子繁殖为主。 微生物发酵产酶93 米曲霉米曲霉 木霉木霉 青霉青霉 红曲霉红曲霉 毛霉毛霉 根霉根霉 微生物发酵产酶94 担子菌及藻类担子菌及藻类 微生物发酵产酶95 微生物发酵产酶96 菌种的来源菌种的来源 根据需要直接从有关科研单位、高等院校、根据需要直接从有关科研单位、高等院校、 工厂或菌种保藏部门购买；工厂或菌种保藏部门购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 微生物发

53、酵产酶97 新菌种分离与筛选的步骤新菌种分离与筛选的步骤 定方案：先要查阅资料了解所需菌种的生长培养特性定方案：先要查阅资料了解所需菌种的生长培养特性 采样：有针对性地采集样品采样：有针对性地采集样品 增殖：通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养增殖：通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养 分离：利用分离技术得到纯种分离：利用分离技术得到纯种 发酵性能测定：进行生产性能测定发酵性能测定：进行生产性能测定 微生物发酵产酶98 采样对象采样对象 一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主， 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较

54、多，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多， 采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 微生物发酵产酶99 从自然界筛选从自然界筛选 微生物发酵产酶100 采样季节：以温度适中，雨量不多的采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初秋初为好。为好。 采土方式：在选好适当地点后，取离地面采土方式：在选好适当地点后，取离地面5-15cm5-15cm处处 的土约的土约10g10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎 好，标记。好，标记。记录记录采样时间、地点、环境条件等。采样时间、地点、环境条件等。 微生物发酵产酶1

55、01 增殖培养增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择选择 性培养基性培养基，选择一定的培养条件来控制。，选择一定的培养条件来控制。 微生物发酵产酶102 培养分离培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物 的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。 微生物发酵产酶103 筛选筛选 采用与生产相近的培养

56、基和培养条件，通采用与生产相近的培养基和培养条件，通 过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得 适合于工业生产用菌种。适合于工业生产用菌种。 微生物发酵产酶104 毒性试验毒性试验 据国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、据国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、 黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须做毒性试验外，黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须做毒性试验外， 其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。 微生物发酵产酶105 微生物发酵产酶106 工业发酵的目的工业发酵的目的大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。大量地积累人们所需要的

57、微生物代谢产物。 在正常生理条件下在正常生理条件下 微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合 成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和 能量，也不积累中间代谢产物能量，也不积累中间代谢产物 代谢的人工控制代谢的人工控制 人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝 着人们希望的方向进行着人们希望的方向进行 微生物发酵产酶107 人工控制代谢的手段：人工控制代谢的手段： 改变微生物遗传特性改变微生物遗传特性( (遗传学方法）；遗传学方法）

58、； 控制发酵条件（生物化学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）； 改变细胞膜透性；改变细胞膜透性； 微生物发酵产酶108 诱变育种诱变育种 (1) (1) 使诱导型变为组成型使诱导型变为组成型选育组成型突变株选育组成型突变株 如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操 纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制 的转录，酶的转录，酶 的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或 分解代谢物阻遏，这样的突变株称为分解代谢物阻遏，这样的突变

59、株称为 组成型突变株。少数组成型突变株。少数 情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶， 这种突变株称为超产突变株。这种突变株称为超产突变株。 微生物发酵产酶109 组成型突变株组成型突变株 结构基因不受控制地转录，酶结构基因不受控制地转录，酶 的生成将不再需要诱导剂或不的生成将不再需要诱导剂或不 再被末端产物或分解代谢物阻再被末端产物或分解代谢物阻 遏。遏。 调节基因发生突变调节基因发生突变 产生无效的阻遏物而不产生无效的阻遏物而不 能与操纵基因结合能与操纵基因结合 操纵基因突变操纵基因突变 突变操纵基因不突变操纵基因不 能与阻遏

60、物结合能与阻遏物结合 组成型突变组成型突变 微生物发酵产酶110 (2)(2)使阻遏型变为去阻遏型使阻遏型变为去阻遏型 选育营养缺陷型突变株选育营养缺陷型突变株 解除反馈阻遏解除反馈阻遏 选育结构类似物抗性突变株选育结构类似物抗性突变株 解除分解代谢物阻遏解除分解代谢物阻遏选育抗分解代谢阻遏突变株选育抗分解代谢阻遏突变株 微生物发酵产酶111 第三节第三节 发酵工艺条件及其控制发酵工艺条件及其控制 在酶的发酵生产中，除了选择性能优良的产酶在酶的发酵生产中，除了选择性能优良的产酶 细胞外，还必须控制好各种工艺条件，并且在细胞外，还必须控制好各种工艺条件，并且在 发酵过程中根据情况变化进行调节，以