限制性内切酶及重要工具酶

1、限制性内切酶及其他重要工具酶限制性内切酶及其他重要工具酶 凡是酶，都有最适温度、最适pH和离子强度的问题，所以酶促反应要注意Buffer的正确使用。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是一类能识别双是一类能识别双链链DNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNA水水解酶。解酶。是体外剪切基因片段的重要工是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重组中重要的工具，而且还可以用于基因组重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴

2、定。酶切图谱的鉴定。1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象2) 核酸限制性内切酶的类型核酸限制性内切酶的类型3) 核酸限制性内切酶的基本特性核酸限制性内切酶的基本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5) 核酸限制性内切酶的命名法核酸限制性内切酶的命名法6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素主要内容：1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各各种细菌都能合成一种或几种能够切割种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双双链的核酸内切酶，链的核酸内切酶，它们以此来限制外源

3、它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自这种酶的细胞自身的身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限进行了修饰，限制性酶对修饰过的制性酶对修饰过的DNA不能起作用。不能起作用。这种现这种现象被称为寄主象被称为寄主控制的限制与修饰现象控制的限制与修饰现象。2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及以及切切断核酸的情况不同，分为三类断核酸的情况不同，分为三类： 型型 型型* 型型第

4、一类（第一类（I I型）限制性内切酶型）限制性内切酶能识别专一能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割苷酸上切割DNADNA分子中的双链，但是切割分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在类限制性内切酶在DNADNA重组技术或基因工重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析程中用处不大，无法用于分析DNADNA结构或结构或克隆基因。这类酶如克隆基因。这类酶如EcoEcoB B、EcoEcoK K等。等。 第二类第二类(II(II型型) )限制性内切酶限制性内切酶能识别专一的核

5、苷能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNADNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是的专一核苷酸顺序最常见的是4 4个或个或6 6个核苷酸，个核苷酸，少数也有识别少数也有识别5 5个核苷酸以及个核苷酸以及7 7个、个、8 8个、个、9 9个、个、1010个和个和1111个核苷酸的。个核苷酸的。 II II 型限

6、制性内切酶的型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向对称轴，从这个轴朝二个方向“读读”都完全相都完全相同同。这种酶的切割可以有两种方式：这种酶的切割可以有两种方式：粘性末端：粘性末端：交错切割，结果形成两条单链末端，交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。所以称为粘性末端。如如EcoEcoRIRI的识别顺序为：的识别顺序为： 55 GAA|TT_C GAA|TT_C 33 3 3 C_TT|AAG C_TT|AAG 5

7、5垂直线表示中心对称轴，从两侧垂直线表示中心对称轴，从两侧“读读”核苷酸顺序都是核苷酸顺序都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，这就是回文顺序（，这就是回文顺序（palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在双链上交错切割的位置，切割后生成表示在双链上交错切割的位置，切割后生成55G G和和AATTCAATTC33、33CTTAACTTAA和和G G55二个二个DNADNA片段，各片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过键以及氢键可通过DNADNA连接酶的作用而连接酶的作用

8、而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一种是在同一位置型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如上切割双链，产生平头末端。例如EcoEcoRVRV 的识别位置是：的识别位置是： 55 GAT|ATC GAT|ATC 3 333 CTA|TAG CTA|TAG 5 5 切割后形成切割后形成55 GAT GAT和和ATC ATC 3 3、 33 CTA CTA和和TAG TAG 5 5。这种末端。这种末端同样可以通过同样可以通过DNADNA连接酶连接起来。连接酶连接起来。平头末端：平头末端：第三类（第三类（ IIIIII型）限制性内切酶型）限制性内切酶也有专一也有专一的识别顺

9、序，但不是对称的回文顺序的识别顺序，但不是对称的回文顺序, ,在识在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度定长度DNADNA片段，具有各种单链末端。因此片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。不能应用于基因克隆。常用的限制性内切酶BamH I GGATC_CHind III AAGCT_T EcoR V GAT!ATC 平头末端 Nde I CATAT_GNco I CCATG_G同位酶（同裂酶、同

10、工酶） 举例Hpa、Msp：GCG_GAfl II、BspT I CTTAA_G同尾酶Xba I：TCTAG_ANhe I：GCTAG_CSpe I：ACTAG_T同裂酶：同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，有时其差别只在于当和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如如HpaHpa和和MspMsp的识别顺序都是的识别顺序都是55GCG_CGCG_C33，如果其中有，如果其中有5-5-甲基胞嘧啶，

11、则只有甲基胞嘧啶，则只有HpaHpa能够切割。这些能够切割。这些有相同切点的酶称为有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异同裂酶（同切酶或异源同工酶）源同工酶）。 3） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶同尾酶，可以，可以通过通过DNADNA连接酶将这类末端连接起来，但原来连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。如的酶切位点。如XbaXba I I、NheNhe I I以及以及

12、SpeSpe I I切割切割的的DNADNA序列不同，但均给出相同的序列不同，但均给出相同的“CTAG”CTAG”粘粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割。能再切割。同尾酶：同尾酶：4) 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法v 用属名的头一个字母和种名的头两个字母用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用用Eco表表示，所以用斜体字。示，所以用斜体字。v 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌（Haemophilus influenzae

13、）d菌株，菌株，即即Hind。如果一种特殊的寄主菌株，具有几。如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如示，如Hind, Hind，Hind 等。等。5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度；的纯度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(4) DNA的分子结构；的分子结构；(5) 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(6) 缓冲液的缓冲液的 pH值。值。其他重要工具酶1、T4 DNA连接酶催化DNA5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键用于DNA片段的连接需要Mg2+和ATP2、DNA 聚合酶I 大片段（Klenow酶）用于粘性末端缺口补平3、逆转录酶从信使RNA得到cDNA（Complementary DNA），以cDNA作为模板做PCR-RT-PCR4、碱性磷酸酶去