Western blot

1、印迹技术（印迹技术（blotting）印迹（印迹（blotting）是指将凝胶中的待测核酸等样品是指将凝胶中的待测核酸等样品用类似于吸墨迹的方法转移到固相膜上，转移之后用类似于吸墨迹的方法转移到固相膜上，转移之后待测样品在固相膜上的相对位置保持不变。待测样品在固相膜上的相对位置保持不变。探针（探针（probe)：广义上讲，探针是指能与特定靶分子发：广义上讲，探针是指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。如：抗原抗体，生物素亲合素，受体配体等。如：抗原抗体，生物素亲合素，受体配体等。印迹技术分类印迹技术分类DNA blotti

2、ng：Southern blottingRNA blotting：Northern blottingWestern blotting：immunoblotting一、定义一、定义Western免疫印迹（免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。是一种检测蛋白质表达水平的方法。检测。是一种检测蛋白质表达水平的方法。二、原理二、原理Weste

3、rn Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 Western Blot基本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。l转膜l封闭l

4、一抗杂交l二抗杂交l底物显色三、过程1、提取蛋白质RIPA裂解液Tris.cl (pH7.5) 50 mMNacl 150 mMNP-40 1%脱氧胆酸钠 0.5%SDS 0.1%EDTA 1 mMPMSF 1 mMNa3VO4 1 mM现用现加（提取总蛋白，主要是胞浆蛋白的裂解液） 其中的其中的NaCl和和Tris base是构成提取液的主要成分，起到缓冲液的作用，缓冲液是构成提取液的主要成分，起到缓冲液的作用，缓冲液可以对抗蛋白质溶液可以对抗蛋白质溶液PH值的改变，因此对于保持蛋白质的稳定以及保证实验重复值的改变，因此对于保持蛋白质的稳定以及保证实验重复性十分重要。性十分重要。 EDTA为

5、金属离子鳌合剂，由于细胞内许多酶的活性需要金属离子的存在，因为金属离子鳌合剂，由于细胞内许多酶的活性需要金属离子的存在，因此加入鳌合剂后可以抑制蛋白酶的活性，也就可以防止蛋白被分解。此加入鳌合剂后可以抑制蛋白酶的活性，也就可以防止蛋白被分解。 而脱氧胆酸钠和而脱氧胆酸钠和SDS都是属于阴离子型去垢剂。使用这些去垢剂的作用是可以都是属于阴离子型去垢剂。使用这些去垢剂的作用是可以将蛋白质以单体的形式分离。将蛋白质以单体的形式分离。 NP-40属于非离子型去垢剂，与离子型去垢剂相比，其对蛋白之间的相互作用属于非离子型去垢剂，与离子型去垢剂相比，其对蛋白之间的相互作用干扰较弱，但是对于分离功能性的蛋白

6、复合物较为适用。干扰较弱，但是对于分离功能性的蛋白复合物较为适用。PMSF：苯甲基磺酰氟，：苯甲基磺酰氟，Na3VO4是是 Na -K+ ATP酶的抑制剂酶的抑制剂 两者都是蛋白酶抑制两者都是蛋白酶抑制剂。剂。2、蛋白定量：测定溶液中蛋白质浓度。（1）凯氏定氮（2）测定OD280：可测定芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）的含量，但易受组成和杂质的影响。（3）考马斯亮蓝G250染色：侧链集团与G250显色， 根据深浅测定蛋白质含量。（4）福林酚试剂法（Lowry)蛋白质的酪氨酸、色氨酸半胱氨酸的残基Cu2+OH紫色化合物紫色化合物还原磷钼酸、磷钨酸蓝色化合物比色测定分光光度计常用改良的常用改良的Lo

7、wry法：法：1 2 3 4 5 6 sample 1 sample 2 sample 31 2 4 8 16 32 10 10 10 (l)BSA(1 mg/ml)999 998 996 992 984 968 990 990 990 (l)NS浓度（g/l)1 2 4 8 16 32+ A液 0.9 ml50，10 min+ B液 0.1 ml室温，10 min+ C液 3 ml50，10 min平衡到室温，650 nm测吸光度值（2 g酒石酸钾钠100 gNacl溶于500 ml 1 MNaOH中，再定容至1000 ml）（ 2 g酒石酸钾钠1 g 5H2O.CuSO4，先溶于少量水中，

8、再定容至90 ml，再加入10 ml 1 MNaOH）（市售的酚试剂，1:15稀释）改良的改良的Lowry法：法：根据标准品绘制标准曲线51015202530浓度（ug/ul)A6500.250.501.000.73样品浓度3、SDSPAGE不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS（与蛋白结合，使蛋白变性，亚基分开，并使蛋白质带上相同的电荷，这样蛋白在电场中的泳动速度只与其单个亚基的分子大小有关，与其空间构象和本身带电多少无关）浓缩胶分离胶5，pH6.88，pH8.8浓缩原理：浓缩胶中Arc的浓度是5，形成的孔径大，蛋白泳动快 分离胶中Arc的浓度是8，形成的孔径小，蛋白泳动慢蛋白质拥挤在交界面处Tr

9、is甘氨酸系统浓缩胶pH=6.8，泳动速度为Cl蛋白质甘氨酸分离胶pH=8.8，甘氨酸不再影响蛋白泳动Cl Cl Cl ClGly- Gly- Gly- Gly-样品进入分离胶前，先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被浓缩至一极窄的区带。样品进入分离胶前，先经过大孔径浓缩胶的迁移作用而被浓缩至一极窄的区带。其作用原理是在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在接近其其作用原理是在缓冲系统中的弱酸，如甘氨酸，在接近其 pKa的的 pH值时，任何时候都只有一部分分值时，任何时候都只有一部分分子带负电。如样品和浓缩胶均用子带负电。如样品和浓缩胶均用 pH 6.7的的 TrisHCI缓冲液，缓冲液， 电极液用电极液用

10、Tris一甘氨酸缓冲液。此时，一甘氨酸缓冲液。此时，甘氨酸很少解离，其有效甘氨酸很少解离，其有效 泳动率很低，而氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的泳动率介于氯离泳动率很低，而氯离子却有很高的泳动率，蛋白质分子的泳动率介于氯离子和甘氨酸之间。一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来，子和甘氨酸之间。一旦加上电压，作为先导离子的氯离子和作为尾随离子的甘氨酸离子分离开来，并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便并在其后面留下一个导电性较低的区带。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便 获得较高的电获得较高的电压梯度，并加速甘氨酸的泳动，

11、使其赶上氯离子压梯度，并加速甘氨酸的泳动，使其赶上氯离子, 建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的建立起甘氨酸和氯离子的电压梯度和泳动率乘积的相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同速度泳动，两种离子之间具有明显的边界。当甘氨酸、氯离相等的稳定态，使这些带电颗粒以相同速度泳动，两种离子之间具有明显的边界。当甘氨酸、氯离子界面通过样品进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，在界面后有一高电压梯度。由于在子界面通过样品进入浓缩胶时，在移动界面前有一低电压梯度，在界面后有一高电压梯度。由于在移动界面前的蛋白质泳动速度比氯离子低，因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高移动界面前的蛋白质泳动

12、速度比氯离子低，因此氯离子能迅速越过。移动界面后的蛋白质处于较高的电压梯度中，其泳动速度比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭的电压梯度中，其泳动速度比甘氨酸快。因此，移动的界面将蛋白质分子堆积到一起，浓缩为一狭窄的区带。窄的区带。蛋白质在移动界面中的浓缩作用仅取决于样品和浓缩胶蛋白质在移动界面中的浓缩作用仅取决于样品和浓缩胶中的中的Tris H CI的浓度，而与样品中蛋白质的最初浓度的浓度，而与样品中蛋白质的最初浓度无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对样品没有分子筛作无关。由于浓缩胶为大孔凝胶，故对样品没有分子筛作用。用。 当移动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶当移

13、动的界面到达浓缩胶和分离胶的界面时，凝胶的的pH值明显增加，并导致甘氨酸的大量解离。此时甘氨值明显增加，并导致甘氨酸的大量解离。此时甘氨酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接在氯离子酸的有效泳动率增加，使它越过蛋白质并直接在氯离子后移动。同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移后移动。同时由于凝胶孔径变小，使蛋白质分子的迁移率减小。于是蛋白质分子在均一的电压梯度和率减小。于是蛋白质分子在均一的电压梯度和pH值中泳值中泳动，并根据其固有的带电性和分子大小进行分离。动，并根据其固有的带电性和分子大小进行分离。+5电泳缓冲液Gly 23.5 gTris 3.375 g250 ml H2O使用时：7

14、6 ml 5bf + 4 ml 10% SDS 400 ml5loading bf0.5 M Tris.cl pH 6.8 5 mlSDS 1 g-巯基乙醇 0.6 ml50%甘油 8 ml0.25%溴酚蓝 1 mlH2O 44 ml使用时与蛋白样品混合，稀释成1，100煮沸5 min聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（单丙）和甲叉双丙烯酰胺（双丙）聚合而成聚合过程需要催化剂。分离胶830 Arc 2.16 ml 0.67 ml (29 g 单丙1 g双丙 100 ml) 1M Tris.cl pH=8.8 3 ml 0.5 ml (pH6.8)10% SDS 80 ul 40 ul10% AP 80

15、 ul 40 ulTEMED 5 ul 4 ulH2O 2.67 ml 2.7 ml 8 ml 4 ml浓缩胶5催化剂120 v 1-2 hCHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2

16、2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N- -甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系8.38.38.96.74、转膜电转移，PVDF膜10转膜缓冲液Gly 14.5 gTris 29 gSDS 1.85 g500 ml使用时：100 ml 10转膜bf用水稀释成800 ml，再加200 ml甲醇（浓度为20，起固定蛋白的作用，边转膜边固定）90 V，23h（90 kDa)，根据所测蛋白的分子量决定。膜的选择：NC：蛋白结合量80100g/cm2，机械强度小

17、，脆性大尼龙：蛋白结合量200g/cm2 ，机械强度高，单易被染料染色。PVDF（聚乙烯二氟）：综合以上优点，但需要激活预处理。转膜方法Western装置蛋白质电泳的分子量标准已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量估计。商品化供应商品化供应DaDaltonSDS PAGE凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可带，但可褪色回收。褪色回收。 硝酸银：硝酸银： 灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色

18、。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色直接染色电泳结果封闭液5 脱脂奶粉1 BSA方法室温振荡45 h37 2 h4 过夜6、一抗、二抗孵育、一抗、二抗孵育可用封闭液或可用封闭液或TTBS稀释一抗到合适的浓度稀释一抗到合适的浓度例如：检测大鼠例如：检测大鼠actin蛋白，使用兔抗大鼠的蛋白，使用兔抗大鼠的actin抗体（抗体（1：1000） TTBS 5 ml + 5 ul 抗体抗体室温振荡室温振荡45 h37 2 h 2 h4 4 过夜过夜方法方法没有注明可以用来做没有注明可以用来做western blot的一抗，可以的一抗，可以用来做用来做western blot吗？吗？ 不一定不一定,因为有的抗体因为有的抗体是识别线性表位的是识别线性表位的,有的是识别构象型表位的，有的是识别构象型表位的，识别构象型表位的抗体不能用于识别构象型表位的抗体不能用于western blotting，因为在，因为在western blotting中抗体识别的中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质