香菇多糖测定的方法学研究

1、3浙江省卫生厅科研基金课题香菇多糖测定的方法学研究3浙江省卫生防疫站(杭州310009于村丁钢强俞莎张双凤浙江大学公卫学院吕鑫提要为选出一种比较准确、方便的香菇多糖的测定方法,对蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、直接滴定法三法进行了比较。实验结果表明:蒽酮硫酸法所测香菇多糖含量偏高,回收率过高(11316%14511%;直接滴定法灵敏度不高,回收率偏低(4218%8518%;而苯酚硫酸法不仅灵敏度高,回收试验也较理想(9215%11012%。因而,可认为苯酚硫酸法是测定香菇多糖含量较为理想的方法。关键词香菇多糖蒽酮硫酸法苯酚硫酸法直接滴定法The Method R esearch of Lentinan

2、 DeterminationY u Cun,et al.Zhejiang hygienic and A nti2epidemic S tation(Hangz hou 310009In order to select an accurate,simple method of lantinan de2 termination,this article compare the different methods of an2 throne2sulfuric method,phenolsulfuric method and direct2titration method.The result sho

3、wed:lentinan detected by anthrone2sulfuric method is higher than other methods,the restore rate is11316% 145%.The sensitivity is not good of direct2titration method,the restore rate is only4218%8518%.Phenol2sulfuric method is not only higher in sensitivity,but also is satisfied of restore rate (9215

4、%110.The result declares that phenol2sulfuric method is a better method in detecting the lentinan.K ey w ordsLentinan Anthrone2sulfuric method Phenol2sul2 furic method Direct2titration method香菇是人们极为喜爱的食用菌,其所含的多糖类成分不仅是一种非特异性免疫增强剂,而且具有降血糖、降血脂等多种生理活性,特别是多聚葡萄糖具有显著的抗癌活性。香菇多糖(Lentinan的结构为以2(13吡喃葡糖苷的结合为主链,

5、又含有以2(13及2(16吡喃葡糖苷为分枝的2(13葡聚糖1。目前,国内外对香菇多糖的研究比较深入,测定方法也不断改进,主要有比色法、滴定法、高效液相色谱法、薄层层析法等。本文将着重对蒽酮硫酸法、苯酚硫酸法、直接滴定法三法进行探讨。现将结果报告如下。1材料与方法111蒽酮硫酸法11111原理香菇多糖遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物,可与蒽酮试剂缩合反应,生成蓝绿色化合物,于625nm处比色。11112试剂与仪器葡萄糖标准溶液(1mg/ml;011%蒽酮试剂:取蒽酮011g,加硫酸溶解,100ml定容(使用前新配;721型分光光度计。11113标准曲线制备分别吸取1mg/ml葡萄糖标准液110、2

6、10、410、610、810ml置于100ml容量瓶中定容,精密吸取上述标准液各210ml置于10ml比色管中,于冰水浴中加入011%蒽酮试剂5ml,摇匀,于水浴中加热50min,冷至室温。另取210ml水作空白,于波长625nm处比色,作标准曲线。11114香菇多糖含量测定(1样液制备:将香菇烘干、研碎,经40目过筛,精密称取30g,加水回流2h,过滤,定容至200 ml,备用。(2含量测定:取样液015ml,加80%乙醇10ml,摇匀,4000r/min离心10min,弃去上清液,再加80%乙醇10ml,同法操作两次。沉淀加适量水溶解,50ml定容,即成供试液。取供试液2100ml,按11

7、113项方法测吸光度,计算其含量。11115回收率测定按前项处理样液至得到醇析物三份,加适量水溶解,分别移至标号为“回1”、“回2”、“回3”的50ml容量瓶中,再分别加入1mg/ml葡萄糖标准液10ml、5ml、3ml后定容。取“回1、回2”稀释1倍后稀释液及“回3”各2ml,按11113项方法测定吸光度并计算回收率。112苯酚硫酸法11211原理苯酚试剂可与香菇多糖中的已糖及其糖醛酸起显色反应,生成橙黄色化合物,于490nm处比色,定量。11212试剂与仪器葡萄糖标准溶液(1mg/ml,10mg/ml;苯酚试液:称取苯酚(AR级10g加水190g溶解后,置于棕色瓶,备用;721型分光光度计

8、;15ml具塞试管。11213标准曲线的制备准确吸取1mg/ml葡萄糖标准溶液110、210、310、410、510ml置于50ml容量瓶定容。准确吸取该系列溶液各2ml,分别置于具塞试管中,加入苯酚试液各1ml,摇匀,迅速加入浓硫酸各5ml,放置5min后,置于沸水浴上加热60min,冷却后在490nm处比色,绘制标准曲线。11214香菇多糖的含量测定取样液2ml,加8ml无水乙醇, 3000r/min离心10min后,倾去上清液,再加10ml80%乙醇,同样条件离心5min,重复2次,将沉淀用水溶解并转移至100ml 容量瓶中定容。吸取1ml稀释10倍,取稀释液2ml,按11213项方法测

9、定吸光度,计算含量。11215回收率的测定将3份样液按11214项处理,得3份醇析物。将醇析物用水溶解,分别转移至标号为“回1”、“回2”、“回3”的100ml容量瓶中,再分别加入10mg/ml葡萄糖标准液1ml、2ml、4ml,混匀后定容至100ml。取1ml,稀释10倍,各取稀释液2ml,按11213项测定吸光度,并计算回收率。113直接滴定法11311原理香菇多糖经沸水浴回流提取,醇析后加酸、加热、回流水解成单糖,以次甲基蓝作指示剂,在加热条件下,滴定经标定过的碱性酒石酸钾钠铜溶液,根据样品水解液消耗体积,计算其含量。11312试剂与仪器碱性酒石酸铜甲液(以下简称甲液2;碱性酒石酸铜乙液

10、(以下简称乙液2;2mol/L硫酸溶液; 5mol/L氢氧化钠溶液;葡萄糖标准溶液(1mg/ml,10mg/ml;全玻璃标准磨口回流装置。11313样品预处理取样液5ml,加20ml无水乙醇,3000r/ min离心10min,弃去上清液,沉淀加80%乙醇10ml,同样条件离心5min,弃上清液,重复二次。用2mol/L H2SO4溶液20ml 将醇析物溶解,转移至200ml磨口三角烧瓶中,回流2h,冷却后,用5mol/L NaOH溶液中和,于50ml容量瓶中定容。11314碱性酒石酸铜溶液标定取甲、乙液各2ml,混合,加适量水,在沸腾条件下,用1mg/ml葡萄糖标准液滴定至变色,记录消耗量。

11、11315香菇多糖的含量测定取供试液按11314项方法滴定542中国公共卫生2000年第16卷第3期CHINA PUBL IC HEAL T HV ol.16No.3M ar2000 碱性酒石酸铜溶液,记录样液消耗量,计算香菇多糖含量。11316回收率的测定取样液3份各5ml,按11313项处理至回流结束,加入到标号为“回1”、“回2”、“回3”的50ml容量瓶中,再分别加入10mg/ml葡萄糖标准液10ml、5ml、215ml,定容。按11315项滴定碱性酒石酸铜溶液,记录各自的消耗量,计算回收率。2结果与分析211蒽酮硫酸法由11113项得回归方程为y=0108441x -0101260,

12、r=019997,测得香菇多糖含量为719%(以葡萄糖计,回收率1、回收率2、回收率3分别为14511%、11316%、11913%,附表。212苯酚硫酸法由11213项得回归方程为y=012618x +0.03452,r=019996,测得香菇多糖含量为615%(以葡萄糖计,回收率1、回收率2、回收率3分别为11012%、9215%、10110%,附表。附表香菇多糖的测定结果及回收率试验方法含量(%R.S.D.3回收率1(%回收率2(%回收率3(%蒽酮法7192160145111131611913苯酚法615115411012921510110滴定法51021148518781242183R

13、.S.D(相对标准偏差=S/ X100213直接滴定法由113项测得香菇多糖含量为4199%(以葡萄糖计,回收率1、回收率2、回收率3分别为85.8%、7812%、4218%,附表。3讨论根据文献资料报道36,国内外大部分类似实验都采用葡萄糖作为标准品,由于国内市场目前得不到商品级的香菇多糖标准品,因此本文也采用葡萄糖作标准品。本文所列三法的样品预处理,都是采用醇析法将香菇多糖从样品中提取出来,经过多次实验。结果表明:当溶液的乙醇浓度达到80%时,醇析效果最佳。由于蛋白质对蒽酮硫酸法有一定干扰,因此,在测定样品前应事先去除蛋白质,常用方法是Sevag法:用氯仿、戊醇(或丁醇按41比例混合后加到

14、多糖样品中振摇,使样品中蛋白质与混合液形成凝胶,离心去除4。苯酚硫酸法的显色化合物为橙黄色,而香菇多糖的水提取液也为橙黄色,故实测值偏高,可事先进行脱色;其次,苯酚极易氧化,因此在测定中应该避光或操作迅速,所用苯酚浓度不易太高。滴定法所测结果偏低,相对标准偏差大,操作繁琐,特别对水溶性淀粉、糊精等物质的干扰,目前还无有效的去除方法。实验结果表明,3种方法的重现性均较理想,其中蒽酮硫酸法的三次测定结果分别为719%、718%、811%;苯酚硫酸法为616%、614%、615%;直接滴定法为510%、419%、511%。结合实验得出的回收率的结果看,本研究认为:比色法的灵敏度比滴定法高,但特异性不

15、够高,容易出现假阳性。其中,蒽酮法所测香菇多糖含量明显高于其他2法,回收率又过高,误差较大;而滴定法的测定结果偏低,且灵敏度不够高;苯酚法不仅测定出的香菇多糖含量介于其他2法之间,而且回收率也介于90%110%之间。由于目前市场上,香菇及制品越来越多,选择一种较好的测定方法,已成迫切需要。本研究认为,苯酚硫酸法是目前测定香菇多糖较为理想的方法,较适用基层单位使用。参考文献11龚俊涛,等.香菇多糖的研究.药学实践杂志1996;14(1:2321食品卫生检验方法(理化部分.第1版.北京:中国标准出版社, 1997:3031陆德胜,等.还原滴定法测定食用菌中多糖的研究.中国卫生检验杂志1999;9(

16、4:2141计时华,等.三种多糖测定方法的比较.环境与健康杂志1995;12: 4551董群,等.改良的苯酚硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究.中国药学杂志1996;31(9:55061Dubois M,et al.Anal Chem,1956;28:350(1999208209收稿任旭红编辑张亚莲校对济南市供管水人员卫生知识培训效果评价山东省济南市卫生防疫站(250014马金姝山东省济南市市中区卫生防疫站吕晓玲根据卫生部生活饮用水卫生监督管理办法的规定,济南市每年都对供管水人员进行卫生知识培训。为了解本市供管水人员掌握卫生知识的实际情况,评价供管水人员卫生知识培训效果,我们于1998年11月份对

17、有关人员进行了相关卫生知识调查。现报告如下。对象与方法(1调查对象:1998年济南市直接从事供管水的人员共628人,工作岗位为净水、取样、化验、二次供水卫生管理及水池、水箱清洗人员。(2方法与内容:采用问卷式调查方法。问卷内容包括:饮用水消毒的目的、方法、消毒剂的种类、介水传染病、饮用水卫生监督管理办法的基本内容及国家饮用水卫生标准等。结果(1对基本法规的正确回答率:有88%的供管水人员知道必须取得体检合格证后方可上岗工作,并每年进行一次健康查体;有71%知道生活饮用水卫生监督管理办法自1997年1月1日起施行,供水单位必须取得卫生许可证后方可供水,无证供水是违法的;有80%知道接受卫生行政部

18、门对饮用水进行监督监测是一项法律义务,应定期送检水样;有72%知道饮用水国家标准中共有35个项目,并能正确填写细菌总数、大肠菌群、出厂水游离余氯和末梢水游离余氯的合格数值;有7%知道违法要接受处罚的具体内容。(2对生活饮用水消毒的目的、方法及意义的了解程度:有69%的供管水人员知道饮用水消毒是为预防介水传染病;有52%对介水传染病的概念不清;有93%知道常用的消毒方法是氯代消毒,有85%知道余氯的含义和测定方法。讨论(1供管水人员卫生知识水平较低的主要原因在于供管水人员所在单位的领导对卫生知识培训不够重视。由于供管水人员都是在职或兼职人员,参加卫生知识培训必然会影响日常工作,有些单位领导便不同意派