生物制药专业综合实验讲义

1、生物技术制药实验课程实习 讲义人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的表达与纯化生物与制药工程学院 制2016年6月2日目录第一节 引 言21.1表皮生长因子(EGF)概述21.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质21.3 EGF的生物学效应及应用31.4 本实验课程设计的目的与内容4第二节 EGF基因的合成与转化表达51.实验原理52.实验材料与方法62.1 实验材料及仪器62.1.1 试剂材料及试剂62.1.2 仪器设备62.2 实验方法72.2.1 试剂及培养基配制方法72.2.2目的基因hEGF的设计与合成72.2.4 电泳检测质粒DNA82.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备82.2.

2、6转化重组质粒进感受态大肠杆菌BL21(DE3）92.2.7检测转化是否成功92.2.8双酶切并检测92.2.9 EGF基因的PCR扩增验证102.2.10 目的基因的诱导表达及基因表达产物的SDS-PAGE检测11第三节 EGF表达蛋白的纯化与检测153.1 实验原理153.2 可溶性6xHis重组蛋白纯化实验方法163.3 6xHis重组蛋白包涵体纯化与复性17第一节 引 言1.1表皮生长因子(EGF)概述 生长因子在人体中的信号传导部分起着关键的作用，它可通过与细胞表面的蛋白质受体结合，参与细胞的各种生命活动。生长因子可以是维生素，碱基，多肽等。所研究的表皮生长因子( Epidemal

3、growth factor，EGF)，就是一种人机体细胞合成的一种多肽。在生物体内，每个细胞的生长状态不同，在不同组织中的细胞的表皮生长因子参与生长、增值、死亡等过程。目前，表皮生长因子已得到广泛应用。在许多公司已经开始研发甚至是生产出EGF，多种疾病的诱发原因很多，我们可以用EGF来进行详细的诊断。之后致病的查出原因，给病人减少心理的压力，带来一线生机。在经过强烈的光刺激后，尤其是激光，人们的眼部会有很大的损伤，最严重的就是眼角膜损伤，无法修复。人体在经过紫外线的照射下皮肤的损伤以及高温、蒸气、火等造成的皮肤大面积与原来的不一样的皮肤。对于这些伤害，我们可使用含有可促进人体表皮细胞的新陈代谢

4、EGF的药膏或者是化妆品，使皮肤变得如初1。在最早研究表皮生长因子的时候就只是证明是多肽，还没有命名。是由Cohen在1960年，在提取神经生长因子时，意外发现除此种物质以外的一种多肽2。多个科学家对其充满好奇心，在之后的十年内，Savage真正的研究清楚，命名此种多肽为表皮生长因子3。1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质 不同的生物中，表皮生长因子的蛋白一级结构不同。研究表明家族成员一般在多于50个氨基酸，而少于80个氨基酸，与我们所熟悉的胰岛素一样，表皮生长因子是由前体加工成的成熟的多肽，在具有生物活性4。如人体中的表皮生长因子是由53个氨基酸组成5。 整个hEGF分子由两个结构域组

5、成。残基133，形成N一端结构域；3453为C一端结构域；成熟hEGF 的序列位于单链多肽的C一末端附近，由53个氨基酸残基组成，并且其C一端和N一端分别由Arg Asp Arg His邻接，故成熟的EGF分子，可以经专一性Arg内肽酶的作用，从前体释放6。二级结构上存在着反平行片层结构是EGF骨架的常见结构，N一端和C一端在整个三维结构中不会发生什么变动，维持此结构的是由三个二硫键7（由于6个半胱氨酸的存在），因此分子在一定的条件下生物活性表现“顽强”8。我们知道同一种酶在不同的生物中有不同的生物效应，同时不同的酶在不同的生物中会有相同的生物效应，hEGF也会有此种现象。 hEGF-和 hE

6、GF-是hEGF的两种形式，在分子结构和同源性中相似度高，在蛋白中一级结构中即使是在C末端的某个位置上仅仅只有一个Arg的差别，当它们作用于不同细胞中的同一个受体，在生物体中的作用是一样的9。 与许多古细菌中的酶一样如生活在温泉中古细菌，人体表皮生长因子在100煮沸达到30 min，仍然能保持结构、活性等稳定性；许多蛋白质在具有强列的催化效率的酶如胰蛋白酶作用下肽链被断掉，而表皮生长因子耐它的消化10。EGF在狭小的活性微环境中，由于常见的丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸11会提供作用基团，表皮生长因子才能与受体结合反应。多肽具有N端和C端，有的在生物活性中不起作用，有的是至少有一段起作用，据研究表明

7、，表皮生长因子结构的两端在细胞的生长中都很重要。 1.3 EGF的生物学效应及应用 细胞通过在信号传导的过程中有多种方式包括直接或间接的接触。自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式，在生物体内它亦可以与其他的因子结合作用于细胞。EGF生物效应很多，如下所述： 1.来源于人体的不同种组织的上皮细胞为了适应人体的需要，从基因上赋予它很高分裂效率。EGF在其中起着关键性的作用。首先人体的皮肤表层会产生脱皮现象，证明有大量的细胞死亡。同样，皮肤的表面受到伤害在愈合的过程会结痂，新的皮肤又长出来了。EGF在创伤修复中起着功不可没的作用，在肝脏、肠道、角膜、胃等多种组织创伤的恢复的试验研究12取得重大的突破，

8、在临床上已经运用于烧伤、烫伤、创伤及外科手术伤口的愈合，使病人的痛苦少一点。 2.眼睛是我们重要的部分，眼睛的部分受到伤害特别是眼角膜，是我们最担心的。在现实生活中，很多病人由于眼角膜的伤害再加上眼角膜的捐献者少之又少无法得到修复。实验研究结果表明，适宜浓度的hEGF滴眼液，能通过刺激角膜上皮细胞及基质成纤维细胞的增生与迁移和促进细胞外基质与胶原纤维增生，使损伤修复速度加快，从而辅助修复角膜13。3. 研究表明，多数肿瘤的发生、发展，与EGF之间存在一定的关系。细胞中存在原癌基因和抑癌基因，癌变可能由于这些基因的突变细胞，使细胞生长不受控制。肿瘤细胞表面的EGF受体属于多聚体受体，多个EGF的

9、表达之后与受体结合，使细胞不停的生长，这样，与胃癌、乳腺瘤、黑色素瘤的恶性程度增加14。4.是药三分毒，我们吃的要中有些药对人的胃刺激很大。实验表明：在人的胃溃疡中受损伤的细胞与保护药硫酸铝相结合，可以使溃疡有较高浓度的内源性EGF表达，从而促进溃疡愈合15。 1.4 本实验课程设计的目的与内容 1.实验课程设计目的： 本实验课程设计重在学生自己动手设计实验，老师起辅助指导作用，旨在训练学生对专业综合知识的运用。学生需查阅文献和数据库来设计与理解设计方案，主要考察学生对基因分子克隆、表达、发酵和蛋白分离知识的理解与应用，以培养学生的专业综合知识应用与实验动手操作能力。2.实验课程设计内容：以表

10、皮生长因子（EGF）为例，让学生从基因的设计入手，合成出完整的EGF基因，然后表达并纯化出该EGF蛋白。主要内容简述如下：（1） 通过NCBI数据库网站设计出完整的EGF基因，并设计出引物；（2） pET-28a衍生质粒为载体、将EGF基因转化如大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中，并通过双酶切和PCR挑选验证转化子；（3） 诱导重组大肠杆菌表达hEGF 蛋白；（4） 经超声破碎提取、SDS-PAGE电泳检测（5） 采用镍柱纯化，进而获取hEGF 蛋白纯品。第二节 EGF基因的合成与转化表达1.实验原理 人源表皮生长因子（hEGF）来源大致有三个方向：一是来源于人体代谢物的提取；二是来源于化学合

11、成；三是来源于基因工程生产技术，这也是近些年来可以大量生产获得hEGF的方法。前两种方式得到的产品都只有很低的纯度，并不能在实际应用中发挥很大的价值。 目前已知的研究中，hEGF基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母以及动植物等宿主系统中已经成功克隆表达。以pET 等衍生质粒为载体、以BL21(DE3)为表达宿主菌的表达系统是发展较成熟的大肠杆菌表达系统之一, 它采用T7 强启动子, 在IPTG 诱导下, 启动外源基因的高转录。pET载体有pET32a（）和pET28a（）等系列。下图1为PET28a质粒载体的物理图谱。图1 PET28a质粒载体 2.实验材料与方法2.1 实验材料及仪器2.1.1

12、 试剂材料及试剂 琼脂粉、NaCl、蛋白胨、酵母浸粉、1 mol/L NaOH溶液、双蒸水、10 mg/mlKana母液、PET-28a菌种、E.coli DE3菌种、酒精、含质粒载体的PET-28a菌液、小型质粒快速提取试剂盒（离心柱型）、Goldview、BIOWEST AGAROSE、loading buffer（6）、Hind DNA Marker、TAE电泳缓冲液（1）、0.1 mol/L CaCl2溶液、Zde I酶(10U/l)及其10 Buffer、Xhol酶(10U/l)及其Buffer D 10、GenClean 柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、5 U/lTaqDNA聚合酶

13、、PCR缓冲液（10，含Mgcl2）、dNTP混合物、上游引物、下游引物、无菌双蒸水、1 mol/l 的异丙基硫代半乳糖苷（TPTG）、PBS（1）、SDS-PAGE蛋白凝胶配制试剂盒：30% Acr-Bis（29:1）、1.5 M Tris-Hcl，pH 8.8、10% SDS、10% 过硫酸铵(AP)溶液、TEMED、1 M Tris-Hcl，pH6 .8；2上样缓冲液、1 Tris-甘氨酸电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液（45% 甲醇：10% 乙酸：45% 蒸馏水）、脱色液（5% 甲醇：7% 乙酸：88% 蒸馏水），双蒸水2.1.2 仪器设备 试管、量筒、天平、药匙、称量纸、培养皿、

14、高压蒸汽灭菌锅、恒温生化培养箱、涂棒、接种环、酒精灯、pH试纸、记号笔、麻绳、棉花、报纸、镊子、滴管、10 ml移液管、恒温摇床、Eppendorf管、微量移液器、枪头、高速离心机、电泳仪、电泳槽、水平凝胶电泳槽和梳子以及其制胶模块、250 ml锥形瓶、微波炉、凝胶成像系统、分光光度计、制冰机、冰盒、恒温水浴锅、超净工作台、水漂、0.2 mlPCR微量管、双面微量离心管架、PCR仪、紫外检测仪、脱色摇床、台式冷冻离心机、垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子、1.5 ml微量离心管、搪瓷盘2.2 实验方法2.2.1 试剂及培养基配制方法 1. 卡那霉素母液（10 mg/mL）的配制：称取10 m

15、g卡那霉素溶解于1ml无菌水中，然后采用无菌过滤器过滤后分装于Eppendorf小管中。 2. 培养基的配制（1）LB培养基：配方(固体培养基加琼脂粉） 1000ml 150ml蛋白胨酵母浸粉 NaCl琼脂粉去离子水 10g 1.5g 5g 0.75g 10g 1.5g 18g 2.7g 950mL 142.5mL （2）含卡那霉素（Kana）LB 固体培养基：将配好的LB 固体培养基高压灭菌后冷却至60左右，加入Kana 储存液，使终浓度为50g/ml，摇匀后铺板。 （3）含Kana 的LB液体培养基：每15mL LB液体培养基分装至试管中，高压灭菌后冷却至60 左右，加入Kana 母液，使

16、终浓度为50g/ml）2.2.2目的基因hEGF的设计与合成 hEGF的cDNA序列自NCBI上查阅文献得到其编号(NM_001963.2)21,在NCBI的数据库中查获其序列为： 根据其序列和限制性酶切位点XhoI和NdeI引入其上下游引物分别为：F：5-AGTGACTCTCAATGTCCC-3；R: 5-TTCCCACCACTTCAGGTCTC-3。委托上海捷瑞生物工程有限责任公司合成目的基因hEGF序列，并将其插入到质粒载体PET28a的限制性酶切位点XhoI和NdeI之间。公司将含有目的基因序列的重组质粒PET28a-hEGF保存在穿刺菌细胞XL10中寄回。 2.2.3提取重组质粒 （

17、1）在灭菌后的无菌操作台中，取15ml分装至试管中的、灭菌后 的LB液体培养基，加入卡那霉素母液150L，保证它在培养基中为50g/mL。 （2）将含目的基因的重组质粒的穿刺菌XL10接种无菌LB培养基（含50l/mL卡那霉素），37.C摇床过夜培养（不能超过15h）。 （3）取收取的2ml 的菌液于2mlEp管中，用于提取质粒。 （4）提取质粒，按质粒小量制备试剂盒操作说明书操作。2.2.4 电泳检测质粒DNA （1）称取0.3g琼脂粉BIOWEST AGAROSE，放入三角瓶中，加入30ml TAE电泳缓冲液（1），制成1%的胶，在微波炉中烧开。 （2）待彻底熔化后，停止加热。 （3）取出

18、三角瓶，自然冷却至不烫手，加入1.7lGoldview染液。 （4）插入梳子后缓缓倒入胶液，至模具的矮边缘即可，平放等待彻底凝固。 （5）在电泳槽里加满1TAE缓冲液，调电压至140V（10V/cm）。 (6)胶全凝固后，小心拔出梳子，放入电泳槽中，凝胶要没入缓冲液中。 (7）在塑料片上，点5l（6）loading buffer，再加入1l上述质粒DNA 提取产物，混合均匀。 （8）在凝胶上选择相邻的加样孔，用吸液头分别将管中的样品和DNA Marker加入凝胶的加样孔中。 （9）打开电源，样品以蓝色的横带泳动，电泳约30min。 （10）当蓝色泳动到凝胶边缘1cm时，关掉电源。取出模具和凝胶

19、放入成像系统中，观察结果图，并保存。 2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备 （1）宿主菌的培养 挑取新活化的E. coli BL21（DE3）单菌落,接种于4ml LB 液体培养基中,37下恒温发酵培养12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液1ml接种于100mlLB 液体培养基中,37摇床培养34小时至OD5900.40.5左右。 （2）制备感受态细胞 ( CaCl2 法) I、将发酵后的菌液转入2mL预冷、无菌的离心管中,冰置10 分钟,4 5000rmp离心10分钟。 、弃去上清,用预冷的0.1mol/L 的CaCl2溶液1ml 轻轻悬浮细胞,冰置30分钟后,4，5000rmp，10

20、分钟离心。 、弃去上清,加入1ml 预冷0.1mol/L 的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置30分钟。 、在离心机中4下5000rmp离心10 分钟，保留沉淀，200L预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重新悬浮，无菌操作台中将其分装成100L的小份,在冰上放置2小时以上，便可直接用作宿主菌的转化实验。2.2.6转化重组质粒进感受态大肠杆菌BL21(DE3） I、在超净工作台上，取上述感受态大肠杆菌BL21（DE3）菌液，加入PET28a 质粒DNA 溶液5l,轻轻摇匀,置于冰上放 30 分钟. 、在42水浴锅中热击90s,迅速在冰上冷却5 分钟。 、往试管中加入1ml LB 液体培养

21、基(不含kan),37摇床发酵1 小时。 、将上述菌液摇匀后取100L涂布于含Kan的固体LB平板上,正面朝上上放置半小时到一个小时待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37条件恒温培养箱中培养16-24小时。 设置对照:以相同体积的无菌双蒸水代替质粒样品溶液,其它操作与上述相同。此对照正常情况下应无菌落出现。 2.2.7检测转化是否成功 提取转化后大肠杆菌的质粒并进行琼脂糖凝胶电泳检测：参见前面质粒提取以及琼脂糖凝胶电泳检测的方法。将两次提取的质粒在同一块凝胶中电泳，对比其电泳条带。2.2.8双酶切并检测 （1）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。

22、 （2）用20l的反应体系进行双酶切： 无菌双蒸水 14l、10 H Buffer 2l、BSA 1l质粒1l混匀，限制性内切酶XhoI、NdeI各1l。 （3）混匀离心管使管中的溶液。在离心机中5000rpm离心30秒。取出后插到水漂的孔中，37.C水浴酶切2 h。 （4）酶切后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（方法参照上述），制1.5%的琼脂糖凝胶，电泳以确认切下的片断是否为自己想要的片断。2.2.9 EGF基因的PCR扩增验证 取无菌的0.2 ml PCR管，置于冰中，在其中添加如下成分如表3：表3 PCR反应体系无菌水17l10 PCR缓冲液（含Mgcl2）2.5ldNTP混合物2l上游引

23、物1l下游引物1l待扩增DNA模板1lTaq DNA聚合酶（5 U/l）0.5l终体积25l 混匀后，稍作离心（如果利用非热盖型PCR仪器，应添加30 l石蜡油于反应管中，防止样品水分的蒸发）17。将反应管放入PCR仪，按下列条件设定反应程序，进行PCR反应，如表4：表4 PCR反应过程 94预变性 5 min变性 94 30 s 退火 55 30 s 循环25次延伸 72 30 s最后在 72 保温10 min PCR 反应结束后，取5-10 l反应液做电泳检测，鉴定PCR 反应产物是否存在，及其大小。电泳确认后，PCR 产物即可用于下一步操作或冰箱保存。2.2.10 目的基因的诱导表达及基

24、因表达产物的SDS-PAGE检测2.2.10.1 目的基因的诱导表达 重组菌的扩增：接种转化了pET-28a-hEGF的Ecoli DE3于含Kana (50g/mL)的LB液体培养基中，37 ，200 rpm，振荡培养过夜。转接100L过夜培养物，于100mL的LB液体培养基，于37 ，200 rpm，振荡培养至OD 600值在0.7-1.0。从中取出1.0 ml菌液，离心，弃去上清，40 L PBS悬浮，备用于后面SDS-PAGE 电泳操作。 重组菌外源基因的诱导表达：向扩大培养的培养基中加入1000 L 0.1mol/L IPTG(至终浓度1 mmolL)，于37 振荡培养3-4h。蛋白

25、样品的抽提：将诱导后菌液，4.0 ，5000 rpm/min，离心10 min，弃去上清。将所得的菌体沉淀，用PBS溶液悬浮，并转移到10 ml离心管中，向管中继续加入PBS至适宜采用超声破碎仪破碎为止，大约5 ml。用移液器吹打，充分悬浮细胞后，将离心管放到盛有的冰块的烧杯中。清洗并擦拭超声破碎仪的金属杆，然后将超声破碎仪的金属杆插入到离心管中，调整好位置，关上超声破碎仪的门，打开电源，设置程序，开始对细菌经行超声破碎17。破碎设置：功率400 W左右；工作2 s；间隔8 s；破碎时间10 min。破碎处理后的细菌细胞，10000 rpm/min 离心10 min。取出离心管，吸取上清液至新

26、的离心管中，此即为所抽提的蛋白样品，可用于后续操作17。把离心的沉淀用40 L PBS悬浮，亦备用于后续SDS-PAGE 电泳操作。2.2.10.2 SDS-PAGE 电泳检测1.分别将未诱导前的菌体悬液、诱导破碎后的菌体上清和诱导破碎后的沉淀悬浮液分别和一部分过柱纯化洗脱好的蛋白与5上样缓冲液按4:1混匀于微量离心管中。 2.将上述四个微量离心管插入水漂，沸水中煮5 min。然后立即插入冰中。样品冷却到室温，5000 rmp 离心5 min。 3.按要求组装电泳装置，并验漏。4. 配制分离胶及浓缩胶： 根据目的蛋白的分子量大小，选择合适的凝胶浓度。不同浓度的SDS-PAGE分离胶的最佳分离范

27、围，如表5： （1）SDS-PAGE分离胶，如表6：配制12% 分离胶，按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液，在50 ml的小烧杯中混合（注意Tris 为pH 8.8）。蛋白质分子量范围（KD）适宜的凝胶浓度（%）100830-10010 10-30121015表5 SDS-PAGE分离胶的最佳分离范围 体系组成体积双蒸水3.330% Acr-Bis（29:1）（ml）4.01.5M Tris-Hcl，pH8.8（ml）2.510% SDS（ml）0.110%过硫酸铵(AP)溶液（ml）0.1TEMED（L）4总体积（L）10表6 SDS-PAGE分离胶反应体系体系组成体积双蒸水230% A

28、cr-Bis（29:1）（ml）0.51.0M Tris-Hcl，pH6.8（ml）0.510% SDS（L）4010%过硫酸铵(AP)溶液（L）30TEMED（L）4总体积（L）3表7 SDS-PAGE浓缩胶体系 加完试剂后，拿起烧杯轻轻晃动底部，将溶液混匀后，立即用1000 L移液器，缓缓把胶液注入玻璃夹缝，每次余部分胶液于枪头内，以免产生气泡。然后在上界面用200 L移液器轻轻地沿玻璃壁均匀地加蒸馏水，从左到右，以免造成胶面不平整，两液面的交界处呈波浪形，然后静置30 min。倒出蒸馏水，并倒置玻璃装置，尽可能把水倒尽，然后用滤纸吸去残留的水。 （2）SDS-PAGE浓缩胶：见表7。 配

29、制5% 分离胶，按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液，在一个50 ml的小烧杯中混匀（注意Tris 为pH 6.8）。 加完后，拿起烧杯轻轻晃动，将溶液混匀后，立刻用1000 L移液器缓缓注入玻璃夹缝中，液面与玻璃上边缘齐平。然后再慢慢插入梳子，静置约20 min。5. 小心地垂直拔出梳子，用蒸馏水冲洗加样孔2次，然后用滤纸吸干。电泳槽的上部倒满电泳缓冲液（约250 ml，淹没过加样槽的液面），电泳槽的下部倒入一半电泳缓冲液（约180 ml）【19】。6. 选取形态好的加样孔，在一张空白纸上做好对应的标记，用微量移液器在靠边缘的一个加样槽中加入5 L蛋白Marker，其它槽中加入30 L自己

30、制作的样品。7. 接好电极，将电压调至80 V,待溴酚蓝移到分离胶后，再调电压至120 V，电泳约2 h。期间注意观察电泳槽上部的电泳液是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）。当溴酚蓝移到距底部 0.5 cm时，切断电源。 8. 在一个大的培养皿里，准备适量的考马斯亮蓝染液。 9.倒掉电泳槽中的电泳液，取下玻璃板，用刀片轻轻撬开，用刀片沿分离胶与浓缩胶的交接处，将分离胶切下，并在分离胶的左上角切掉一小角，以标记样品顺序【19】。然后用水稍微冲一下玻璃板，戴手套用梳子小心地把分离胶从玻璃板上剥离到培养皿中，盖上盖，在脱色摇床上染色45 min。 10. 染色后，将染液回收，以备重复使用。在培养

31、皿中加脱色液，摇床上脱色45 min。倒掉脱色液，更换为脱色液，摇床上脱色45 min。更换新的脱色液，脱色摇床上脱色过夜，至大部分蓝色褪尽。 11. 观察脱色后电泳胶中的蓝色带纹。对照、寻找异常粗的带纹，并比较其分子量，判断是否为预期目的基因的产物。第三节 EGF表达蛋白的纯化与检测 -镍离子金属螯合亲和层析 3.1 实验原理金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-ion Affinity Chromatography)，其纯化原理是：组氨酸（His）的侧链带有1个咪唑基团,咪唑基团pKa值在6左右,在pH7的条件下,咪唑基团带负电,容易与Ni2+离子结合，尤其是带有6个组氨酸

32、（6xHis）标签的重组蛋白对Ni2+离子具有极好的亲和力。通过介质固定Ni离子能够选择性地纯化含有多个组氨酸的蛋白以及多肽；吸附在Ni2+离子上的蛋白可以使用咪唑进行竞争洗脱分离。常用于Ni2+离子金属螯合亲和层析的介质为NTA（Nitilotriacetic acid）。镍离子有六个螯合价位， NTA螯合了四价，剩余两价与蛋白质上的组氨酸结合（如下图所示）。3.2 可溶性6xHis重组蛋白纯化实验方法3.2.1 缓冲液配制（使用0.45 m 滤器过滤）. 缓冲液A（平衡缓冲液）：1 L20 mM Na2HPO4.2H2O 3.56 g500 mM NaCl 29.2 g20 mM Imid

33、azole 2.04 g用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至1 L。. 缓冲液B（洗脱缓冲液）：0.5 L20 mM Na2HPO4.2H2O 1.78 g500 mM NaCl 14.6 g500 mM Imidazole 17.02 g用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至0.5 L。 3.2.2 样品制备. 菌体收集：5000转/分钟离心10分钟，收集菌体，弃上清液；. 菌体重悬：加入10-20 ml的缓冲液A（每升培养液约加15 ml），通过震荡充分悬浮细胞；. 超声波破碎：将细胞混悬液置于一个合适的小烧杯（也可用其它合适的器皿）中，在冰上超声波破碎（约500 W，破 2s 停

34、2s，总时长15分钟）；. 菌体破碎后，13000转/分钟离心30分钟，收集上清液（弃沉淀），使用0.45 m 滤器过滤后用于镍柱纯化（取10 l样品用于之后的SDS-PAGE检测）。3.2.3 Ni-NTA预装柱纯化6xHis重组蛋白. 取一根Ni-NTA预装柱（1 ml），分别用10 ml三蒸水和10 ml缓冲液A洗涤柱子，流速为1-2 ml/min；. 将过滤好的细胞上清液以0.5 ml/min流速上样到镍柱中（期间，取10 l穿柱液样品用于之后的SDS-PAGE检测）；. 用15 ml缓冲液A洗去未吸附的样品，流速1-2 ml/min；. 用5 ml缓冲液B洗脱重组蛋白，流速1 ml/

35、min，1 ml/管收集洗脱液（将每个收集管编号并每管取10 l样品用于之后的SDS-PAGE检测）；. 用5 ml缓冲液A再次洗涤柱子. 用5 ml三蒸水洗涤柱子；. 用2 ml20%乙醇洗涤柱子，封闭，以备下次使用。注：此方法是通用的方法，但是未必能得到较好的纯化效果，可选择使用咪唑浓度梯度进行洗脱（如分别含有50 mM，100 mM，300 mM，500 mM咪唑的缓冲液B）或者使用KTA蛋白纯化系统进行更为精确的梯度洗脱。3.2.4 SDS-PAGE检测纯化效果配制10-15%的SDS-PAGE,对上述收集的样品进行检测；根据检测结果，将重组蛋白纯度和浓度较高的收集管中的样品标记保存。

36、3.3 6xHis重组蛋白包涵体纯化与复性某些重组蛋白在表达的过程中由于缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键（一级结构正确，高级结构错误），从而水不溶性且致密地集聚在细胞内，这种形式称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。包涵体主要含有重组蛋白，但同时含有一些细菌成分，如核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白、质粒DNA、以及脂体、脂多糖等。较强的变性剂如尿素（8 M）、盐酸胍（GdnHCl 6M）通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种次级键，使多肽伸展而溶于水中。如果重组蛋白是以包涵体的形式表达，则将包涵体变性溶解后（加入 =6 M盐酸胍

37、或 =8 M尿素）进行镍离子金属螯合亲和纯化。此纯化过程与可溶性6xHis重组蛋白的纯化方法相同，只是在缓冲液A和B中都加入同样浓度的变性剂（6 M盐酸胍或8 M尿素）。要得到有活性的重组蛋白，必须对纯化得到的变性重组蛋白进行复性，但复性过程的收率往往很低。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。包涵体的纯化通常包括包涵体的分离、洗涤、溶解、镍柱亲和纯化以及蛋白质复性等步骤（注：也可在变复性之后进行亲和纯化）。3.3.1 缓冲液配制（使用0.45 m 滤器过滤）. 包涵体洗涤缓冲液: 100 ml20 mM Na2HPO4.2H2O 0.356 g500 mM NaCl 2.92 g2 M 尿

38、素 12 g1 mM EDTA 0.03 gTriton X-100 (2%) 2 ml用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至100 ml。. 变性缓冲液A（平衡缓冲液,也作为包涵体溶解缓冲液）：100 ml20 mM Na2HPO4.2H2O 0.356 g500 mM NaCl 2.92 g20 mM Imidazole 0.2 g8 M 尿素 48 g用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至100 ml。. 变性缓冲液B（洗脱缓冲液）：50 ml20 mM Na2HPO42H2O 0.178 g500 mM NaCl 1.46 g500 mM Imidazole 1.7 g8 M 尿素

39、 24 g用HCl（6M）调节pH至7.4，定容至50 ml。 3.3.2 包涵体的分离、洗涤、溶解. 菌体收集：5000转/分钟离心10分钟，收集细胞，弃上清；. 菌体重悬：加入10-20 ml的包涵体洗涤缓冲液（每升培养液约加15 ml），通过震荡充分悬浮细胞；. 超声波破碎：将细胞混悬液置于一个合适的小烧杯（也可用其它器皿）中，在冰上超声波破碎（约500 W，破 2s 停 2s，总时长15分钟）；. 菌体破碎后，13000转/分钟离心30分钟，收集沉淀（弃上清液，沉淀为包涵体）；. 包涵体的洗涤：加入10-20 ml的包涵体洗涤缓冲液震荡重悬包涵体，13000转/分钟离心30分钟，收集沉淀（弃上清液）；. 包涵体的溶解：加入10-20 ml的包涵体溶解缓冲液（变性缓冲液A）震荡重悬沉淀，室温搅拌（磁力搅拌器）5-6小时或过夜；. 包涵体充分溶解后，13000转/分钟离心30分钟，收集上清液（弃沉淀），使用0.45 m 滤器过滤上清