甾体化合物的生物转化

1、O O O O HO 根霉菌 孕酮11-羟基孕酮 O O HO OH O O OOHOH 皮质醇皮质酮 生物转化（生物转化（BiotransformationBiotransformation）是指利用生物体系以及它们所）是指利用生物体系以及它们所 产生的酶对外源化合物（产生的酶对外源化合物（exogenous substrate, foreign exogenous substrate, foreign substrate, xenobiotics compoundsubstrate, xenobiotics compound）进行结构修饰而获得有价值）进行结构修饰而获得有价值 产物的生理生

2、化反应，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对产物的生理生化反应，其本质是利用生物体系本身所产生的酶对 外源化合物进行酶促催化反应。生物转化具有反应选择性强（位外源化合物进行酶促催化反应。生物转化具有反应选择性强（位 置选择性置选择性 regio-selectivity regio-selectivity 和立体选择性和立体选择性 stereo-stereo- selectivityselectivity）、高效率、反应条件温和、副产物少、不造成环境）、高效率、反应条件温和、副产物少、不造成环境 污染、后处理简单等优点污染、后处理简单等优点 。迄今，在生物转化研究领域已取得了。迄今，在生物转化研

3、究领域已取得了 很大的进展。生物转化不仅应用于有机合成的研究中，而且还应很大的进展。生物转化不仅应用于有机合成的研究中，而且还应 用于植物次生代谢产物的结构修饰、活性先导化合物的寻找及药用于植物次生代谢产物的结构修饰、活性先导化合物的寻找及药 物构效关系的探索等研究中，被称为物构效关系的探索等研究中，被称为“绿色化学，绿色化学，green green chemistrychemistry”，用于药物开发、环境净化等科学领域，有着重要的，用于药物开发、环境净化等科学领域，有着重要的 理论意义及实际应用价值。理论意义及实际应用价值。 O O O O HO O O HO OH O O OOHOH 根

4、霉菌 孕酮11-羟基孕酮 皮质醇皮质酮 1952年，年，Perterson等报道了根霉菌（等报道了根霉菌（Rhizopus arrhius） 能够将孕酮能够将孕酮(progesterone)转化为转化为11- 羟基孕酮羟基孕酮(11 - hydroxyprogesterone)。11- 羟基孕酮是皮质酮羟基孕酮是皮质酮 (cortisone)合成的一种中间体（上图）。这种微生物羟合成的一种中间体（上图）。这种微生物羟 基化作用简化并极大地改进了多步化学合成皮质甾类激基化作用简化并极大地改进了多步化学合成皮质甾类激 素及其衍生物的效率。尽管德国人素及其衍生物的效率。尽管德国人Merck提出的由脱

5、氧提出的由脱氧 胆酸进行化学合成的方法也是可行的，但是这种方法既胆酸进行化学合成的方法也是可行的，但是这种方法既 复杂又不经济，必须经过复杂又不经济，必须经过31步才能从步才能从615公斤脱氧胆酸公斤脱氧胆酸 中获取中获取1克乙酸皮质酮。孕酮的克乙酸皮质酮。孕酮的11- 羟基化作用使皮质羟基化作用使皮质 酮的价格从酮的价格从200美元美元/克很快降到克很快降到6美元美元/克。由于工艺的克。由于工艺的 进一步发展，它目前的价格已经低于进一步发展，它目前的价格已经低于1美元美元/克。这一范克。这一范 例有力地揭示了天然产物的生物转化在药物研究与开发例有力地揭示了天然产物的生物转化在药物研究与开发

6、中所发挥的巨大作用。中所发挥的巨大作用。 CHOCH2OH CH2OH 1. 产黄青霉Q176 2. 假单孢菌PL CHO COOHCH2OH N 牛结核分枝杆菌 N CH2OH COOH COOHCHO O CHO 乙酸杆菌属 O COOH -呋喃甲酸 CC H OHO 乙酸杆菌属 OHO 环戊酮 CHOCH3 CH3 假单孢菌 CHO OHOH 4-羟基苯甲醛 COOHCH3 CH3 珊瑚红诺卡氏菌 COOH ClCl 对氯苯甲酸 N. corallina CCH3 棒状杆菌属 O O 香芹酮 CH2OH CH3 CH3 COOH CH2OH COOH 荧光假单孢菌 O-羟甲基苯酸 H2

7、CC H OH O C H O O C H O HO 少根根霉 11-羟基，5-孕甾-3，20双酮 CHC OH C C HH C C HOOH N N OH HO N N OH HO OH 巴比妥酸 棒状杆菌 分子杆菌 C H C HO O CH2C H H2C O CH2 H CH2C O S-3-苯氧基-1，2-环丙烷 食油假单孢菌 O 氧环己烷 土壤细菌JOB 5 H2 C H2 C O NH2NO2 H2NCH H C H2 COH OH NH C CHCl2 O O2NCH H C H2 COH OH NH C CHCl2 O 链霉菌SP3022a 氯霉素 S O S SCH3 黑

8、曲霉NNR O SCH3 (-)-4-甲基二苯亚砜 R H2 C H2 C H2 CCOOH R H2 C H2 C H CCOOH OH 脂肪酸-氧化 H2 C H2 CC H C H N N H H2 C H2 CCOOH N N H C H 荧光假单孢菌 C H COOH 咪唑丙烯酸（利尿酸） CH H2 CCC H N N CH3 N N CH3 分节孢子杆菌属 -脱氢尼可汀 CHOCH2OH C H C H CHO C H C H CH2OH 酵母 肉桂醇 CH CHOCHCH2OH N N H H2CCHCHO NH2 N N H H2CCHCH2OH NH2 分节孢子杆菌属 L-

9、组氨醇 C O CH OH O OH HO 链孢霉属 雌（甾）酮（strone） 雌（甾）二醇（estradial） 1,3,6(10)-脱氢雌甾-3，17-双酮 O O OH O 酵母 17 4AD 睾丸素（testosteron） NO2 NH2 酵母 NO2 NH2 (1)NHOHNH2 酵母 NHOHNH2 NO2N 酵母 NO2 N (3) N N (4)NO N N O N N 吩嗪 枯草杆菌 (2) H C C O NH2 O CH3 H C C OH NH2 O -氨基苯乙酸 大肠杆菌 O HOOCO HOOC H C H2 C H2 CCOOH OH (S)-1-羟基戊二酸

10、棒状杆菌属 CO H2 CRCOH ClO H2 CCOOH ClOH 4-氯苯酚 N C2H5 HO OCH3 OCOC6H5 OCH3 OAc OH H3CO OCH3 OH 乌头碱 N C2H5 HO OCH3 OCOC6H5 OCH3 OAc OH H3CO OH OH 脱甲基乌头碱 链霉菌属 C S CH3 H3CO H3CO H3CO H N C CH3 O S CH3 O H3CO H3CO H3CO H N C CH3 O SH O 灰色链丝菌 CH S CH3 CHOH N C3H7 CH3 C H N O CH CH CH3 O OH H H OH OH N C3H7 CH

11、3 C H N O CH CH CH3 O OH H H OH OH 链霉菌属 SCH3 OH HN N O OH OH H2 COPO3H2 O O HN N H O O O OH OH H COPO3H2 尿嘧啶5-磷酸核糖 假单孢菌属 N O糖 NH糖 C O糖C OH 糖 OHO OHO O OH OH OHOH OH CH3 OHO OHO OH OH OH OHOH OH CH3 OH 栎皮苷（querctrin）栎精 （quercitin） 青霉属 CH C NH O CH C OH O NH2 + H2 CC H N O N O S CH3 CH3 COOH H2 CCH2N

12、O N O S CH3 CH3 COOH OH + H2 CC H N O N O S CH3 COOH H2N N O S CH3 COOH H2 CC O OH + 青霉素G 无侧链青霉素 去乙酰基头孢菌素C 7-ADCA 大肠杆菌 大肠杆菌 NH NH2 O NH2 CH2 C(CH3)3 CH COOH NH2 L-赖氨酸 粪户碱杆菌 O H C H C OHOH O O H3CO HO O CH3 O H3CO HO O CH3 OH OH 烟曲霉 环氧烟曲霉醌 1，2-二羟基烟曲霉醌 CHNH2CHOH N N H H2C H C COOH NH2 N N H H2C H C CO

13、OH OH 杆菌属 2-羟基-,-(4-咪唑)丙酸 NRNH NN CH3H3C NNHH3C 土壤细菌 RR O R OH R H ON OH H CN (R)醇氰（醛化）酶(S)醇氰（醛化）酶 RH O RH O + R O R OH * CHO + COOH O 酿酒酵母 葡萄糖 O OHOH NHCH3 OH NHCH3 (1R,2S)-麻黄碱 (1S,2S)-伪麻黄碱 RH O + COOH O R COOH OOH 在上述反应中用丙酮酸磷酸酯代替在上述反应中用丙酮酸磷酸酯代替 丙酮酸作为辅助底物（丙酮酸作为辅助底物（co-substrateco-substrate） 时，使缩合反应

14、不可逆。时，使缩合反应不可逆。 RH O + COOH OPO3H2 R COOH OOH X O + OH OH OP O D-1，6磷酸果糖醛缩酶 OR D-1，6磷酸果糖 OH OH OH O 3S, 4R 微生物的胺化转化反应微生物的胺化转化反应 可以从醇基、酮基或羧基基可以从醇基、酮基或羧基基 团分别转化成氨基或酰基。团分别转化成氨基或酰基。 CHOH CHNH2 N H H2C H C COOH OH N H H2C H C COOH NH2 色氨酸 脱氮假单孢菌 或绿脓假单孢菌 COH CHNH2 COH CHN CH3 CH3 Cl OH CH3 OHOH OH OH OH C

15、ONH2 金霉素链霉菌 Cl OH CH3 OHOH N OH OH CONH2 CH3 CH3 C OCH NH2 H2C C COOH O H2C C H COOH NH2 产粪杆菌 大肠杆菌 L-苯丙氨酸 COOHCO H N R HO H C COOH NH2 + 6APA (无侧链青霉素） 乙酸杆菌 H2 CC H N O N O S CH3 CH3 COOH HO -氨基-羟苄青霉素 CH2OHCH2O C O R 1): 伯羟基 2): 仲羟基 CHOH CHO C R O 3): 叔羟基 COH CO C R O H2 CNH H3C O H3C O O H C OH H2 C

16、NH H3C O H3C O O H C O C CH3 O 放线菌酮 乙酰放线菌酮 小克银汉霉 CH2 1): 伯氨基 2): 仲氨基 CHNH2 CH H N C R O 3): 叔氨基 CNH2 C H N C R O NH2 CH2 H N C R O 4）： 肼基酰基化 NHNH2 NH H N C R O H2 CC H2N O N O S CH3 CH3 COOH OH + 无侧链青霉素 H2N H N N O S CH3 CH3 COOH CH2C O H2N Kluyvera cutrophila 对氨基对氨基- -苯乙酰青霉素苯乙酰青霉素 CHCOOH R R CH2 R

17、R CCOOHCH CCOOH R CH R C H COOHCH2 OHOH C H COOHCH2 NH2NH2 COOH 产黄菌属 H 脱氢松香亭酸 脱氢松香亭 CCOOHCH OO C COOH O CH O 产黄青霉 苯甲醛 CCH2C R R CH2 OH R H R CC H CHR CCH3CCH3 OH C OH H H H N H N CH3HOH2C N H N CH3H2C 烟曲霉 3.1.3.1.概述概述 甾体化合物是广泛存在于各类植物、动物中的最为常见的甾体化合物是广泛存在于各类植物、动物中的最为常见的 一类化合物，资源非常丰富，种类很多，结构中都具有环戊烷骈一类化

18、合物，资源非常丰富，种类很多，结构中都具有环戊烷骈 多氢菲（多氢菲（cylopentano- perhydrophenanthrenecylopentano- perhydrophenanthrene）的甾核。天然）的甾核。天然 甾类成分中甾核四个环的稠合方式，甾类成分中甾核四个环的稠合方式，A/BA/B环有顺式或反式稠合，环有顺式或反式稠合， B/CB/C都为反式，都为反式，C/DC/D环也有顺式或反式两种稠合方式。甾核环也有顺式或反式两种稠合方式。甾核C3C3位有位有 羟基取代，可与糖结合成苷而存在。甾体化合物（包括甾体皂苷）羟基取代，可与糖结合成苷而存在。甾体化合物（包括甾体皂苷） 具有

19、多种生理活性，如抑癌、抗炎、降血糖、免疫调节、防治心具有多种生理活性，如抑癌、抗炎、降血糖、免疫调节、防治心 血管疾病、抗真菌、抑制血管疾病、抗真菌、抑制HIVHIV病毒整合酶等等。另外，甾体化合病毒整合酶等等。另外，甾体化合 物还是医药工业中生产黄体酮、性激素、利尿剂（物还是医药工业中生产黄体酮、性激素、利尿剂（diureticsdiuretics）、）、 雄激素（雄激素（androgensandrogens）、促蛋白合成剂（）、促蛋白合成剂（anabolic agentsanabolic agents）、避）、避 孕药（孕药（contraceptive agentscontraceptiv

20、e agents）、皮质激素、以及昆虫变态激素）、皮质激素、以及昆虫变态激素 （metamorphosis hormonemetamorphosis hormone）和信号化合物（）和信号化合物（semiochemicalssemiochemicals） 等（下图）的重要原料。等（下图）的重要原料。 正是由于这些原因，关于甾体结构修饰改造的研正是由于这些原因，关于甾体结构修饰改造的研 究非常多。化学合成甾体化合物非常烦琐，需要多步究非常多。化学合成甾体化合物非常烦琐，需要多步 反应才能完成。常常涉及到中间体保护基团的引入及反应才能完成。常常涉及到中间体保护基团的引入及 再生，这必将影响产物的收

21、率，增加成本，浪费时间。再生，这必将影响产物的收率，增加成本，浪费时间。 而且，某些甾体衍生物的基本骨架对许多化学试剂非而且，某些甾体衍生物的基本骨架对许多化学试剂非 常敏感，以致发生开环常敏感，以致发生开环 。化学合成还需要使用许多试。化学合成还需要使用许多试 剂，如吡啶、三氧化硫、二氧化硒等，对人体和环境剂，如吡啶、三氧化硫、二氧化硒等，对人体和环境 均有害均有害 。而生物转化是在温和条件下进行的，能够克。而生物转化是在温和条件下进行的，能够克 服化学合成的一些弱点。目前，科学家们普遍认为将服化学合成的一些弱点。目前，科学家们普遍认为将 化学合成和生物转化结合起来是开发甾体药物的最为化学合

22、成和生物转化结合起来是开发甾体药物的最为 有效手段。有效手段。 AB C D1 3 57 11 14 16 17 18 19 21 甾体化合物的结构通式 由于甾体由于甾体11位选择性羟基化反应研位选择性羟基化反应研 究的巨大成功，引起了微生物学者、有究的巨大成功，引起了微生物学者、有 机化学家和药物学家们的极大兴趣，开机化学家和药物学家们的极大兴趣，开 展了大量的微生物对甾体转化研究工作，展了大量的微生物对甾体转化研究工作， 至今已阐明微生物对甾体每个位置几乎至今已阐明微生物对甾体每个位置几乎 都能进行反应，并且许多是化学难以合都能进行反应，并且许多是化学难以合 成，而动物体内酶也不能转化的。

23、成，而动物体内酶也不能转化的。 AB C D1 3 57 11 14 16 17 18 19 21 甾体化合物重要位置及反应 22 23 25 26 27 微生物对甾体羟化时，其中以微生物对甾体羟化时，其中以C-9 、 C-11 ， 、C- 16 ， 、C-17 、C- 19位甲基和侧链上位甲基和侧链上C-26位上的羟基较为位上的羟基较为 重要。重要。 C-11 和和 位的羟基化作用是各种位的羟基化作用是各种 皮质激素合成中不可缺少的一步。如生皮质激素合成中不可缺少的一步。如生 产可的松需要进行产可的松需要进行C-11 羟基化反应，生羟基化反应，生 产氢化可的松需要进行产氢化可的松需要进行C-

24、11 位羟基化反位羟基化反 应。应。 1 1）、选择性：）、选择性： 微生物的甾体转化反应中最重微生物的甾体转化反应中最重 要的是羟化反应，因为不同位置和不同空间的要的是羟化反应，因为不同位置和不同空间的 羟基化甾体药物对人体的不同的细胞受体产生羟基化甾体药物对人体的不同的细胞受体产生 不同的亲和力，导致产生不同药效的专一性。不同的亲和力，导致产生不同药效的专一性。 在甾体母核的在甾体母核的4 4个环结构上有许多相同的次甲基，个环结构上有许多相同的次甲基， 在羟基化反应时，化学方法是无法区别的；而在羟基化反应时，化学方法是无法区别的；而 微生物催化反应时，按不同来源微生物的羟化微生物催化反应时

25、，按不同来源微生物的羟化 酶，能区域选择性酶，能区域选择性(regiostereotope (regiostereotope selective)selective)地对某个环上次甲基进行羟基化，地对某个环上次甲基进行羟基化， 和非对映体选择性（和非对映体选择性（diastereotope selectivediastereotope selective） 对该项次甲基中哪个氢催化成对该项次甲基中哪个氢催化成 或或 - -羟基。羟基。 微生物羟化酶是个双功能氧化酶微生物羟化酶是个双功能氧化酶 （mixed function oxidases），它能利），它能利 用分子状态的氧，需要用分子状态的

26、氧，需要1个与个与NADPH-依依 赖的脱氢酶（赖的脱氢酶（NADPH-dependent dehydrogenase）相联结的电子转移系）相联结的电子转移系 统，细胞色素统，细胞色素P-450作为末端氧化酶。甾作为末端氧化酶。甾 体上羟基化对化学合成来说是非常困难体上羟基化对化学合成来说是非常困难 的，除了甾体的，除了甾体C-17位上化学能导入羟基位上化学能导入羟基 外，其他位置都很难导入。外，其他位置都很难导入。 羟基形成机理根据同位素追踪试验的研究结果，羟基形成机理根据同位素追踪试验的研究结果， 知道转化到甾体上的羟基是直接取代甾体碳架上的氢知道转化到甾体上的羟基是直接取代甾体碳架上的氢

27、 位置，并且取代过程中没有产生立体构象的变化，也位置，并且取代过程中没有产生立体构象的变化，也 不通过形成烯的中间体来完成的，就是说羟基取代的不通过形成烯的中间体来完成的，就是说羟基取代的 立体构象的变化不是先通过形成烯的中间体来完成的，立体构象的变化不是先通过形成烯的中间体来完成的， 即羟基取代的立体构象（即羟基取代的立体构象（ 或或 ）是由氢原子原先所占）是由氢原子原先所占 的空间位置而决定。经的空间位置而决定。经18O，D2O，H2O18分别实验确分别实验确 定，羟化作用的氧不来自水中氢氧基（定，羟化作用的氧不来自水中氢氧基（-OH）而是来）而是来 自空气中氧。这一点从理论上说明工业上用

28、黑根霉转自空气中氧。这一点从理论上说明工业上用黑根霉转 化甾体时需要充分供氧的原理。化甾体时需要充分供氧的原理。Hoyam及其合作者曾及其合作者曾 将将C-11 和和C-12 位上的氢被位上的氢被H3所取代的孕甾所取代的孕甾-3，20- 二酮作为底物用黑根霉转化来进行研究，结果说明甾二酮作为底物用黑根霉转化来进行研究，结果说明甾 体的酶促羟基化反应是羟基化位置上的氢被直接取代。体的酶促羟基化反应是羟基化位置上的氢被直接取代。 O O O HO ADD19-去甲甾族 环氧化经常发生在环氧化经常发生在C-9C-9，1111和和C-14C-14，1515之间。用微生之间。用微生 物转化法在母核上引入

29、环氧基团的反应与微生物羟基物转化法在母核上引入环氧基团的反应与微生物羟基 化有关。能产生化有关。能产生1111 - -羟基化的新月弯孢霉或布氏小克羟基化的新月弯孢霉或布氏小克 银汉霉都可将银汉霉都可将1717 ，21-21-二羟基二羟基-4-4，9 9（1111）- -孕甾二烯孕甾二烯3 3， 20-20-二酮转换成二酮转换成9 9 ，1111 环氧化合物。环氧化合物。 O OH O CH2OH O OH O CH2OH O 主要是在主要是在C-3C-3、C-17C-17、C-20C-20 位上酮基还原。位上酮基还原。 微生物常使微生物常使A A环上环上C-1C-1，2 2 以及以及B B环上

30、的环上的C-5C-5，6 6之间双键之间双键 的还原。的还原。 各类具有生理活性的甾体类药物的基本母核都是各类具有生理活性的甾体类药物的基本母核都是 来自高等动植物的甾体化合物经侧链降解后得到的。来自高等动植物的甾体化合物经侧链降解后得到的。 如胆甾醇、豆甾醇以及与薯蓣皂苷结构相似而带有侧如胆甾醇、豆甾醇以及与薯蓣皂苷结构相似而带有侧 链的海可吉宁和梯可吉宁，必须先出去侧链保留甾体链的海可吉宁和梯可吉宁，必须先出去侧链保留甾体 母核才能加以利用。我国已利用这一反应从海可吉宁母核才能加以利用。我国已利用这一反应从海可吉宁 的中间体生产的中间体生产-美松，用梯可吉宁的中间体生产去氢美松，用梯可吉宁

31、的中间体生产去氢- 17-小甲基睾丸素。甾体侧链降解的机制与脂肪酸的氧小甲基睾丸素。甾体侧链降解的机制与脂肪酸的氧 化途径相似。开始是化途径相似。开始是C-27羟基化，再氧化为羟基化，再氧化为C-27羧酸，羧酸， 经过一系列的氧化过程，甾体侧链被降解下来，最后经过一系列的氧化过程，甾体侧链被降解下来，最后 一步包括脱氢和加水。一步包括脱氢和加水。 不同微生物来源的脂肪酶不同微生物来源的脂肪酶 可对甾醇进行不同区域的选可对甾醇进行不同区域的选 择性酯化。择性酯化。 C-9 C-9 羟基化是在甾体药物合成中一羟基化是在甾体药物合成中一 个关键中间步骤，不仅涉及到甾体边链个关键中间步骤，不仅涉及到甾

32、体边链 的选择性降解，并且是皮质激素合成中的选择性降解，并且是皮质激素合成中 的一个关键中间体。由于的一个关键中间体。由于C-9C-9位上导入羟位上导入羟 基后，容易在基后，容易在C-9C-9、C-10C-10位之间引入双键，位之间引入双键， 然后进一步形成然后进一步形成C-11C-11 羟基或导入氟原子。羟基或导入氟原子。 例如，甾体合成中重要中间体例如，甾体合成中重要中间体9 9 - -羟基羟基- - 4-4-雄甾烯雄甾烯-3-3，17-17-双酮和双酮和9 9 - -羟基羟基-3-3-氧化氧化 娠烷娠烷-4-4，17-17-双烯双烯-20-20羧酸的制取。羧酸的制取。 O O O O O

33、H 99 Corynespora-Casicola 4-雄甾烯-3，17-双酮 9-羟基-4-雄甾烯-3，17-双酮 O 9 棒状杆菌 COOH 短杆菌 O 9 COOH OH 9-羟基-3-氧化娠烷- 4，17-双烯-20羧酸 3-氧化娠烷-4，17-双烯-20羧酸 C-11 C-11 羟基化是微生物的专特转化反应，人体内羟基化是微生物的专特转化反应，人体内 的酶也不能将甾体的酶也不能将甾体C-11C-11 羟基化。由于微生物能完成此羟基化。由于微生物能完成此 反应，不仅解决药物合成，更重要的是增加了皮质激反应，不仅解决药物合成，更重要的是增加了皮质激 素类化合物活力使其具有高度抑制炎症效应

34、。素类化合物活力使其具有高度抑制炎症效应。 C-11C-11 羟基化是通过微生物转化寻找更有效新药的一个实例。羟基化是通过微生物转化寻找更有效新药的一个实例。 黑根霉转化孕酮黑根霉转化孕酮C-11C-11 羟基，同时拌生微量的羟基，同时拌生微量的C-11C-11 ， 6-6-二羟基孕酮和偶然拌生二羟基孕酮和偶然拌生1111-还原孕酮。此羟基化反还原孕酮。此羟基化反 应与温度有密切关系，一般不能超过应与温度有密切关系，一般不能超过3232o oC C，如超过，黑，如超过，黑 根霉只大量生长菌丝而不对孕酮进行羟基化。根霉只大量生长菌丝而不对孕酮进行羟基化。 除黑根霉外，其他如放线菌、棒状杆菌和诺卡

35、氏菌除黑根霉外，其他如放线菌、棒状杆菌和诺卡氏菌 等微生物对孕酮进行等微生物对孕酮进行1111 羟基化时，也同时产生另一种羟基化时，也同时产生另一种 降解反应，或将母核进行降解，所以没有生产意义。降解反应，或将母核进行降解，所以没有生产意义。 近年来，报道锗曲霉也是良好的近年来，报道锗曲霉也是良好的1111 羟基化菌株，但仍羟基化菌株，但仍 以黑根霉最好，收率可高达以黑根霉最好，收率可高达90%90%以上。以上。 O 11 O CH3 O 11 O CH3 HO O O CH3 HO O O CH3 HO OH H 6 5 主要产物 微量副产物 偶然产生副产物 黑根霉 由于微生物对甾体能进行由

36、于微生物对甾体能进行C-11C-11 羟基化，从而又为羟基化，从而又为 制药工业提供了另一条有价值的合成路线。例如，新制药工业提供了另一条有价值的合成路线。例如，新 月弯孢霉月弯孢霉(Curvularoa lunata)(Curvularoa lunata)能将能将Reichstein SReichstein S化合化合 物（简称化合物物（简称化合物S S）一步转化成氢化可的松。）一步转化成氢化可的松。 O 11 O CH2OH O 11 O CH2OH HO 新月弯孢霉 化合物S 氢化可的松 OHOH 在上述转化反应过程中同时出现在上述转化反应过程中同时出现C-7和和C-14位羟基化的位羟基

37、化的 副反应，此副反应可通过底物结构的修饰来避免。例如，副反应，此副反应可通过底物结构的修饰来避免。例如， 将化合物将化合物S先进行先进行C-17、C-21双乙酰化，然后在双乙酰化，然后在pH低于低于 6.5及高浓度底物及高浓度底物F进行转化，不仅避免了副反应并且加快进行转化，不仅避免了副反应并且加快 了反应速率，获得了良好的收率。了反应速率，获得了良好的收率。 O O H2 C O C CH3 O C CH3 O O O H2 C O C CH3 O C CH3 O11 新月弯孢霉 双乙酰化合物S 11 HO 另外，布氏小克银汉霉也是对甾体另外，布氏小克银汉霉也是对甾体C-C- 1111 羟

38、基化反应中重要的菌种，据报道转羟基化反应中重要的菌种，据报道转 化率可高达化率可高达65%65%。此外，弗氏链霉菌、某。此外，弗氏链霉菌、某 些梨头霉和一些极毛杆菌等也能对甾体些梨头霉和一些极毛杆菌等也能对甾体 进行进行C-11C-11 羟基化。羟基化。 微生物对甾体微生物对甾体C-16C-16 羟基化作用为皮质羟基化作用为皮质 甾体激素类药物合成中另一个重要的反应。在甾体激素类药物合成中另一个重要的反应。在 甾体母核导入甾体母核导入C-16C-16 羟基后，可以使电解质影羟基后，可以使电解质影 响减少，而抗炎及糖代谢作用保持不变。例如，响减少，而抗炎及糖代谢作用保持不变。例如， 抗炎活力很高

39、的抗炎活力很高的9 9 - -氟去氢可的松在氟去氢可的松在C-16C-16 羟羟 基化后，不仅高度抗炎、消炎作用未降低，并基化后，不仅高度抗炎、消炎作用未降低，并 使二者强烈贮盐副作用消失。使二者强烈贮盐副作用消失。 C-16C-16 羟基化一羟基化一 般以放线菌为好。般以放线菌为好。 O O CH2OH OH F HO O O CH2OH OH F HO O F HO OH CH2OHO O OH OH 玫瑰色链丝菌 Fe8+ 异构化 9-氟去氢可的松9-氟-16a-羟基去氢可的松 副反应产物 16 当甾体母核引入当甾体母核引入C-17C-17 羟基后，能增加甾体药物羟基后，能增加甾体药物

40、的抗炎和糖代谢作用。绿色木霉、树枝状孢囊菌和小的抗炎和糖代谢作用。绿色木霉、树枝状孢囊菌和小 瓶瘤孢菌均能对甾体进行瓶瘤孢菌均能对甾体进行C-17C-17 羟基化。羟基化。 O O CH3 O O CH3 OH 17 绿色木霉 孕甾酮 17-羟基孕甾酮 甾体母核甾体母核C-19C-19 羟基化是制备羟基化是制备19-19-失碳甾体化合物的重失碳甾体化合物的重 要中间体。要中间体。19-19-失碳甾体较原甾体具有更显著的生理活失碳甾体较原甾体具有更显著的生理活 性，例如性，例如19-19-失碳孕甾酮的疗效比孕甾酮活性强失碳孕甾酮的疗效比孕甾酮活性强4-84-8倍。倍。 1919-羟基羟基-4-4

41、，6-6-雄甾雄甾- -二烯二烯- -双酮具有升高血压作用。双酮具有升高血压作用。 O O CH3 Y X R Z 球墨孢霉 O CH2OH O CH3 Y X R Z X,Y表示H或CH2; Z表示H，F，Cl或CH3；R=OH 当抗炎甾体激素药物的母核当抗炎甾体激素药物的母核C-1，2位置导入双键后，位置导入双键后， 都能成倍的增加抗炎作用。例如，醋酸可的松都能成倍的增加抗炎作用。例如，醋酸可的松C-1，2 位上导入双键成醋酸脱氢可的松后，增强抗炎作用位上导入双键成醋酸脱氢可的松后，增强抗炎作用3-4 倍；但倍；但C-1，2位脱氢甾体激素化合物在动物体内不能位脱氢甾体激素化合物在动物体内不

42、能 被转化而得，所以这是人工改造后获得高效药物的典被转化而得，所以这是人工改造后获得高效药物的典 型例子。化学法脱型例子。化学法脱C-1，2氢一般用二氧化硒法，常使氢一般用二氧化硒法，常使 产品中带有少量难以除尽对人体有毒害的硒，所以微产品中带有少量难以除尽对人体有毒害的硒，所以微 生物脱氢成为甾体抗炎激素药物合成中不可缺少的一生物脱氢成为甾体抗炎激素药物合成中不可缺少的一 步。微生物的脱氢转化过程中虽有一些副产物产生，步。微生物的脱氢转化过程中虽有一些副产物产生， 但我们需要的生产产品收率很高。但我们需要的生产产品收率很高。 O O CH2OH OH R R=O 可的松 R=OH 氢化可的松

43、 O O CH2OH OH R R=O 去氢可的松 R=OH 去氢氢化可的松 棒状杆菌 O O CH2OH O O CH2OH 节杆菌 诺卡氏菌 混合发酵 黄体酮 1-脱氢黄体酮 （主要产物） O OH O O 1-脱氢睾丸酮 （副产物） 1-脱氢雄甾二酮 （副产物） 微生物对甾体羟基化与脱氢能力相反，细菌微生物对甾体羟基化与脱氢能力相反，细菌 的脱氢能力比真菌强，特别是棒状杆菌和分枝的脱氢能力比真菌强，特别是棒状杆菌和分枝 杆菌活力最强。球形芽孢杆菌、诺卡氏菌对可杆菌活力最强。球形芽孢杆菌、诺卡氏菌对可 的松和皮质醇也有较高的脱氢能力。发现对甾的松和皮质醇也有较高的脱氢能力。发现对甾 体母核

44、有脱氢活力的微生物，较多拌生边链降体母核有脱氢活力的微生物，较多拌生边链降 解和解和C-26位酮基还原以及其位酮基还原以及其9 羟基化引起羟基化引起B环环 打开等作用。打开等作用。 甾体母核脱氢酶是一种诱导酶。例如，甾体母核脱氢酶是一种诱导酶。例如， Septomyxa affinis在生长期易受底物诱导而产在生长期易受底物诱导而产 生，诱导作用大小与底物分子极性有关；微生生，诱导作用大小与底物分子极性有关；微生 物不能转化皮质醇为脱氢皮质醇；但当有较皮物不能转化皮质醇为脱氢皮质醇；但当有较皮 质醇极性低的黄体酮或类似于黄体酮的低极性质醇极性低的黄体酮或类似于黄体酮的低极性 甾体化合物存在时，

45、脱氢酶就可以诱导产生，甾体化合物存在时，脱氢酶就可以诱导产生， 使皮质醇转化为脱氢皮质醇。甾体母核脱氢酶使皮质醇转化为脱氢皮质醇。甾体母核脱氢酶 在脱氢过程中不需要氧分子的存在。在脱氢过程中不需要氧分子的存在。 曾报道假单孢菌曾报道假单孢菌P. testeroneP. testerone酶对酶对4 4-3-3酮类甾体酮类甾体 及及1-1-羟基羟基- - 4 4-3-3酮类甾体的酮类甾体的C-1C-1，2 2位脱氢进行比较性位脱氢进行比较性 实验中，得知微生物的脱氢转化反应不是先经过羟基实验中，得知微生物的脱氢转化反应不是先经过羟基 化脱水的过程而是直接脱去化脱水的过程而是直接脱去C-1C-1，

46、2 2位氢。位氢。19621962年，年， GalaGala用球形芽孢杆菌的无细胞提取法进行了脱氢的机用球形芽孢杆菌的无细胞提取法进行了脱氢的机 理研究，发现这种脱氢酶在脱氢转化时必须有维生素理研究，发现这种脱氢酶在脱氢转化时必须有维生素 K2K2一类醌类辅酶参加。即甾体一类醌类辅酶参加。即甾体C-1C-1，2 2位脱氢是在酶与位脱氢是在酶与 辅酶催化下先形成了酮烯醇化，然后形成烯醇氢与酶辅酶催化下先形成了酮烯醇化，然后形成烯醇氢与酶 结合而直接脱去氢。结合而直接脱去氢。 NN: N N O CH3H3C O H R.Enz O H H H AB C 黄素酶 NNH N N O CH3H3C

47、O H R.Enz O H H AB C -H+ NNH HN N O CH3H3C O H R.Enz O H AB C -H+ 酮烯醇化 利用微生物进行甾体边链降解在工业上的重要性仅利用微生物进行甾体边链降解在工业上的重要性仅 次于甾体的羟基化。次于甾体的羟基化。 各类具有生理活性的甾体类药物各类具有生理活性的甾体类药物 的基本母核都是来自高等动植物的甾体化合物经侧链的基本母核都是来自高等动植物的甾体化合物经侧链 降解后得到的。由于化学方法切断甾体边链没有专一降解后得到的。由于化学方法切断甾体边链没有专一 性，产率低，仅性，产率低，仅15%左右。以前生产甾体激素类药物左右。以前生产甾体激素

48、类药物 主要采用天然原料薯蓣皂素，另外豆甾醇因为其具有主要采用天然原料薯蓣皂素，另外豆甾醇因为其具有 C-32位不饱和双键，易于化学降解，也被作为甾体类位不饱和双键，易于化学降解，也被作为甾体类 药物的起始原料。而另外一些甾醇如胆固醇、谷甾醇、药物的起始原料。而另外一些甾醇如胆固醇、谷甾醇、 菜籽甾醇等因菜籽甾醇等因C-17侧链的饱和性，利用化学手段难以侧链的饱和性，利用化学手段难以 降解，长期以来被当作废物处理。微生物选择性降解降解，长期以来被当作废物处理。微生物选择性降解 甾体边链技术的发展使这些廉价易得的甾醇的充分利甾体边链技术的发展使这些廉价易得的甾醇的充分利 用成为可能。用成为可能。

49、 甾醇边链降解过程机理与脂肪酸的甾醇边链降解过程机理与脂肪酸的 氧化途径相似。胆甾醇边链的降解开始氧化途径相似。胆甾醇边链的降解开始 于于C-27羟基化，再氧化成羟基化，再氧化成C-27羧酸，继羧酸，继 后，后， 氧化先失去丙酸、乙酸，最后再氧化先失去丙酸、乙酸，最后再 失去丙酸，形成失去丙酸，形成C-17酮化合物。从二降酮化合物。从二降 胆酸（胆酸（IV）转化到）转化到C-17酮化合物（酮化合物（V） 在厌氧条件下也能进行，所以最后一步在厌氧条件下也能进行，所以最后一步 转化机理应该是脱氢、加水和开裂。如转化机理应该是脱氢、加水和开裂。如 下图：下图： COOH COOH CH3CH2COO

50、H COOH +CH3COOH + O +CH3CH2COOH COOH -2H COOH H2O COOH OH H O +CH3CH2COOH 在微生物降解甾体边链过程中，由于存在甾体母核的降解，导致底在微生物降解甾体边链过程中，由于存在甾体母核的降解，导致底 物的损失和边链降解产量的下降。抑制微生物对甾体母核的降解物的损失和边链降解产量的下降。抑制微生物对甾体母核的降解 一般有下述三种方法：一般有下述三种方法： （1）、对底物）、对底物-甾醇进行结构改造来阻止酶对母环的降甾醇进行结构改造来阻止酶对母环的降 解；解； （2）、加入酶抑制剂抑制母核降解关键酶如）、加入酶抑制剂抑制母核降解关键

51、酶如C-1，2脱氢酶和脱氢酶和9 羟基羟基 化酶，常用的抑制剂有化酶，常用的抑制剂有Ni, Pb, Se等金属，等金属，8-羟基喹啉及一些金属羟基喹啉及一些金属 鳌合剂（如鳌合剂（如2，2-双联吡啶）；双联吡啶）； （3）、对菌种进行诱变产生仅降解甾醇侧链的突变株。）、对菌种进行诱变产生仅降解甾醇侧链的突变株。 近年来，基因工程等技术的迅速发展也为选择性降解甾体边链提供近年来，基因工程等技术的迅速发展也为选择性降解甾体边链提供 了一种新的手段。了一种新的手段。 1 1）、洋地黄毒苷的羟基化）、洋地黄毒苷的羟基化 2 2）、）、 6 6 - -甲基氢化泼尼松（甲基氢化泼尼松（6a-methyl-

52、6a-methyl- prednisoloneprednisolone）的制备）的制备 3 3）、）、 1515 -acetoxyfinasteride-acetoxyfinasteride的合成的合成 4 4）、蟾蜍甾烯类化合物的生物转化）、蟾蜍甾烯类化合物的生物转化 4.1.1 124.1.1 12 - -羟基化羟基化 一个经典实例为德国土宾根大学一个经典实例为德国土宾根大学Reinhard等等 (Reinhard et al, 1978; 1980)利用植物培养细胞关于洋地黄强心苷的羟基化反应。利用植物培养细胞关于洋地黄强心苷的羟基化反应。 洋地黄强心苷中只有洋地黄强心苷中只有C-12位

53、上有羟基，即位上有羟基，即C-苷，例如异羟基洋地黄苷，例如异羟基洋地黄 毒苷（毒苷（digoxin, 1）才有重要药用价值。但在分离过程中大量混有）才有重要药用价值。但在分离过程中大量混有 C-12位上没有羟基的所谓位上没有羟基的所谓A-苷，例如洋地黄毒苷（苷，例如洋地黄毒苷（digitoxin, 2），）， 因此若将因此若将A-苷（苷（2）C-12位上选择性羟基化，即将位上选择性羟基化，即将2转化为转化为1就可充就可充 分利用植物资源而生产有效药物。有机合成方法难以实现这一过程，分利用植物资源而生产有效药物。有机合成方法难以实现这一过程， 利用微生物进行生物转化效率很低，鉴于植物中存在多种羟

54、基化酶，利用微生物进行生物转化效率很低，鉴于植物中存在多种羟基化酶， 他们从洋地黄属植物中选择到几种合适的细胞株来实现了这一过程。他们从洋地黄属植物中选择到几种合适的细胞株来实现了这一过程。 首先发现的一细胞株能将化合物首先发现的一细胞株能将化合物2进行葡萄糖化而转变成进行葡萄糖化而转变成3，然后又，然后又 乙酰化成毛花洋地黄苷乙酰化成毛花洋地黄苷A（lanatosid A, 4），进一步羟基化成毛花），进一步羟基化成毛花 洋地黄苷洋地黄苷C（lanatosid C，5）。它也能将化合物）。它也能将化合物3的的C-12直接羟直接羟 基化而得去乙酰毛花洋地黄苷基化而得去乙酰毛花洋地黄苷C（dea

55、cetyl-lanatosid C, 6）。）。 O OH O O D D D O OH O O D D D O OH O O D D D 2 34 + glucose - glucose Glu Acetylation Glu Ac O OH O O D D D Glu Ac 12-hydroxylation OH O OH O O D D D Glu OH 12-hydroxylation O OH O O D D D OH - glucose - glucose - acetyl group 6 15 上述生物转化过程虽能实现化合物上述生物转化过程虽能实现化合物2 2转化成转化成1 1，

56、但得，但得 率较低，并且反应过程中形成许多难以分离的副产物，率较低，并且反应过程中形成许多难以分离的副产物， 如如C-16C-16位羟基化产物。为了减少副反应，必须将化合物位羟基化产物。为了减少副反应，必须将化合物 2 2的末端糖连保护起来，通过大量实验发现的末端糖连保护起来，通过大量实验发现 - -甲基洋地甲基洋地 黄毒苷（黄毒苷（ -methyldigitoxin, 7-methyldigitoxin, 7）作为底物几乎能）作为底物几乎能100%100% 地实现地实现C-12C-12位上的羟基化，只生成位上的羟基化，只生成 - -甲基异羟基洋地黄甲基异羟基洋地黄 毒苷（毒苷（ -methy

57、ldigoxin, 8-methyldigoxin, 8），没有其他副产物（图）。），没有其他副产物（图）。 化合物化合物8 8本身也是一个重要药物。用化合物本身也是一个重要药物。用化合物7 7作为底物筛作为底物筛 选到另一细胞株在选到另一细胞株在24 d24 d内几乎内几乎100%100%地将地将7 7转化为转化为8 8。已采。已采 用发酵方法，但发现机械搅拌未能实现转化，必须用气用发酵方法，但发现机械搅拌未能实现转化，必须用气 升式反应器使细胞和培养基保持持久循环才能实现转化，升式反应器使细胞和培养基保持持久循环才能实现转化， 这是迄今世界上第一个利用植物培养细胞来进行羟基化这是迄今世界上

58、第一个利用植物培养细胞来进行羟基化 反应生产药物的成功例子。反应生产药物的成功例子。 O OH O O D D D CH3 O OH O O D D D CH3 OH 78 微生物微生物Gehgronella urceroliferaGehgronella urcerolifera 菌株在洋地黄菌株在洋地黄 毒苷转化时能对甾体母核专一地在毒苷转化时能对甾体母核专一地在7 7位上导入羟基，形位上导入羟基，形 成成7 7 - -羟基羟基- -洋地黄毒苷。洋地黄毒苷。 O OH O O D D D O OH O O D D D OH Gehgronella urcerolifera 洋地黄毒苷能被产

59、黄青霉专一性水解洋地黄毒糖生洋地黄毒苷能被产黄青霉专一性水解洋地黄毒糖生 成洋地黄毒苷元而不会引起成洋地黄毒苷元而不会引起C-17位上位上 不饱和内酯环不饱和内酯环 的水解。的水解。 O OH O O D D D O OH HO O 产黄青霉 链霉菌属链霉菌属S. platensisS. platensis对洋地黄毒苷对洋地黄毒苷D D环专一性脱环专一性脱 氢在甾体母核氢在甾体母核1616，1717位导入双键，与位导入双键，与 不饱和内酯环形不饱和内酯环形 成共轭增加成共轭增加D D环上氢、环上氢、1414位羟基和位羟基和1818位甲基的活性，并位甲基的活性，并 且不影响其他且不影响其他3 3

60、个环的饱和结构。个环的饱和结构。 O OH O O D D D O OH O O D D D S. platensis 洋地黄强心苷在贮藏或提取过程中洋地黄强心苷在贮藏或提取过程中 常会被植物体内存在的酶水解末位的常会被植物体内存在的酶水解末位的 羟羟 基糖脱落而成为次级苷。单端孢属的粉基糖脱落而成为次级苷。单端孢属的粉 红单端孢转化此次级毒苷时，能对洋地红单端孢转化此次级毒苷时，能对洋地 黄毒苷的糖链上引入黄毒苷的糖链上引入2分子糖，重新形成分子糖，重新形成 洋地黄强心苷一级苷，在苷的糖链上连洋地黄强心苷一级苷，在苷的糖链上连 接糖是化学方法难以实现的。接糖是化学方法难以实现的。 6 6 -