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文档简介

1、 中插入 构建而成。 才能从供体菌向受体菌转移。e. coli (ppk2073） ppk2073中带完整的 sinorhizobium fredii 实验菌株 供体菌：e.coli dh5(ptr102-luxab) (tcr、luxab) 受体菌: sinorhizobium fredii ( tc s) 辅助菌: e. coli mm294 (prk2073)（specr） 实验产物 转移接合子: s. fredii (ptr102-luxab), (tcr，luxab) 菌株活化（教师做）： 将受体、供体、辅助菌分别培养到对数期： e. coli (ptr102-luxab): 液体l

2、b + tc 20g/ml, 37oc震荡培养1夜； s. fredii : ty液体, 28oc震荡培养2天 ； e. coli (ppk2073) : 液体lb + spe 50g/ml ,37oc震荡培养1夜 倒平板（学生做）：第1、2组：倒不加tc的sm（平皿上标记“纯sm” ）： 融化sm后，每瓶加混合维生素0.2ml（装在1.5ml离心管中，标记“维”)，混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室（4oc）备用。第3、4组：倒ty平板： 融化1瓶ty固体, 倒平板12-13个, 凝固后分发到4个超净台使用。第5、6组：倒smtc平板（平皿上标记

3、“smtc” ） ： 融化sm后，每瓶加混合维生素0.2ml和四环素0.5ml （tc,10mg/ml,装在1.5ml离心管中，标记“tc” ），混匀倒平板，3瓶250ml的培养基共倒3640皿。凝固后，报纸包好，放冰箱冷藏室(4oc) 备用。 (1)吸取供体菌、辅助菌各 0.4ml，吸受体菌0.6ml，都加入同一个1.5ml离心管内（每个同学做1管），8000转/min 离心1分钟。 (2) 倒上清，向沉淀加 1ml 的 ty液体，用 tip上下抽吸，洗涤菌体，再8000转/min离心1分钟，倒上清，留沉淀。 (3) 用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的ty平板上（每个同学1片，3片/平板，平皿

4、背面标记姓名），用200l的 tip 抽吸离心管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸片中央（切勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外） (4) 加好菌液后，静置510分钟，待滤纸上的培养基液体被平板吸收后，倒置放培养箱，28oc培养1天。（1）灭菌小pa瓶中加5ml无菌水(1瓶/人), 镊子揭下ty平板上的滤纸片，放入瓶中，在震荡混匀器上充分打散菌体。（2）向1.5ml管加0.9ml无菌水,加0.1ml已打散的菌液,混匀。（3）吸已稀释的菌液分别涂布于昨日倒的 sm+tc 平板和不加 tc的纯sm上（每个同学各涂1板， 200l / 板）（4）放28 oc培养6-7天，下周看结果： 在暗室内向培养皿中加10l

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