氢化可的松的制备工艺研究

1、扬州工业职业技术学院20112012学年第 二 学期 毕业设计（论文） （课程设计）课题名称： 氢化可的松的制备工艺研究 设计时间： 2011年10月15日-2012年3月20日 系 部： 化 学 工 程 系 班 级： 0901化学制药 姓 名： * 指导教师： * 目 录摘要Abstract一、前言.6 1.1氢化可的松的概况 .61.1.1氢化可的松主要性质.61.1.2氢化可的松主要药理作用.71.1.3氢化可的松主要功能 .71.1.4氢化可的松与药物相互作用 .71.1.5氢化可的松的发展前景.81.2氢化可的松合成方法及研究内容.9 1.2.1化学合成法制HC.91.2.2半合成法

2、制HC.91.2.2.1半合成法简述.91.2.2.2 提高HC半合成收率及转化率的途径.111.2.2.3 减少副产物产生的方法.121.2.2.4分离与提纯.131.2.2.5含量测定.141.2.3全生物合成法制HC.14二 氢化可的松的合成工艺过程.152.1合成氢化可的松的原料.162.1.1原料来源.162.1.2薯蓣皂素的制备.162.1.3薯蓣皂素的制备的工艺流程图.162.2 5,16-娠二烯-3-醇-20-酮-3-醋酸酯（双烯醇酮醋酸酯）制备.162.3 16，17-环氧黄体酮的制备.182.4 17-羟基黄体酮的制备.192.5 4-娠烯-17，21-二醇-3,20-二酮

3、（醋酸化合物S）的制备.202.6 氢化可的松的制备.212.7实验小结.24三 结语.24参考文献.25致谢.27 氢化可的松的制备工艺研究摘 要氢化可的松是一种肾上腺分泌激素，其药理作用主要有抗炎、抗过敏和免疫抑制、抗核分裂等,它在医药领域具有广泛的应用。合成氢化可的松的方法主要有化学合成法、半合成法、全生物合成法等。本文采用蓝色犁头霉发酵RSA生产氢化可的松，产率大大提高，已达到国外同类工作的先进水平，无论从氢化可的松的转化率、羟化物收率、精制收率均达到较高水平。把微生物工程的概念应用到氢化可的松的制备过程，这已经成为大致的制备工艺发展方向。 关键词化学合成法 半合成法 全生物合成法 化

4、学发光分析法 Study on preparation process of hydrocortisoneLiu Rong0901 chemical pharmaceuticalAbstract：Hydrocortisone is a secretion of adrenal hormones. its pharmacological effects are anti-inflammatory,anti-allergy and immune inhibition, anti nuclear division. It has a wide application in the field of

5、Medicine. Synthesis of hydrocortisone are the main methods of chemical synthesis, semi synthesis, full biosynthesis. Currently has with Absidia coerulea fermentation production of RSA hydrocortisone yield is greatly improved. It has reached the advanced level of similar foreign work, whether from th

6、e hydrocortisone conversion rate, the yield of hydroxide, refining yield reached a high level. Microbial engineering concept is applied to the preparation process of hydrocortisone. It has become a general preparation technology development direction.Keyword：Chemical synthesis method Semi synthesis

7、Total biosynthesis method Chemiluminescence analysis一、前言1.1氢化可的松概况氢化可的松(hydrocortisone，HC)是人体主要的类固醇激素之一，属肾上腺皮质激素类药，是激素类药物中产量最大的品种。目前中国、英、美、日、法等国及欧洲药典均有收载。HC是哺乳动物肾上腺皮质分泌的主要糖皮质激素，也是制备其他几种重要甾体药物的原料药。1948年，美国风湿病专家Hench在风湿病关节炎的治疗中发现可的松在体内转化HC才具有疗效。因发现可的松和HC的药理作用，Hench、Reichstein和Kendal一起获得了1950年的诺贝尔奖，并从此

8、掀起了开发皮质激素的高潮。Wendler等用化学法合成了HC，但由于步骤多、收率低，导致药品价格昂贵而难以工业化。此后，人们开始把目光转向生物转化方法。Fieser首先采用微生物转化方法使HC工业化生产成为可能1。为提高转化率和收率，国内外研究人员做出了不懈努力，并取得较大进展。目前，国内外已有繁多疗效更高、副作用较少、具有特效的一些甾体药物的出现，但氢化可的松作为天然皮质激素，疗效确切，仍不失为重要的甾体激素类药物之一，在国内生产的激素品种中它的产量一直居于领先。1.1.1氢化可的松主要性质2氢化可的松（Hydrocortisone）又称皮质醇（Cortisol），化学名称为11，17,21

9、-三羟基孕甾-4-烯-3，20-二酮（11，17，21-Trihydroxy-4-pregnene -3，20-dione）。分子式：C21H30O5，分子量：362.47。其结构式如下：图1 氢化可的松的结构示意图本品为白色结晶粉末，无臭，初无味，随后有持续的苦味，遇光逐渐变质。其不溶于水，略溶于乙醇（1：40）或丙酮（1：80），微溶于氯仿，几乎不溶于乙醚，熔点为212222， 比旋光度为+162171（1%乙醇），在240nm波长处测定吸收度，吸收系数（E 1%cm）为422448。1.1.2氢化可的松主要药理作用3：肾上腺皮质激素类药物，其药理作用是通过弥散作用于靶细胞，与其受体相结合

10、，形成类固醇-受体复合物，激活的类固醇-受体复合物作为基因转录的激活因子，以二聚体的形式与DNA上的特异性顺序链结合，调控基因转录，增加mRNA的生成，并以此为模板合成相应的蛋白，这些蛋白在靶标细胞内实现类固醇激素的生理和药理效应。超生理量的糖皮质激素具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等多种药理作用。抗炎作用：糖皮质激素减轻和防止组织对炎症的反应，从而减轻炎症的表现。免疫抑制作用：防止或抑制细胞中介的免疫反应，延迟性的过敏反应，并减轻原发免疫反应的扩展。抗毒、抗休克作用：糖皮质激素能对抗细菌内毒素对机体的刺激反应，减轻细胞损伤，发挥保护机体的作用。1.1.3氢化可的松主要功能：氢化可的松是人工合成也是

11、天然存在的糖皮质激素，抗炎作用为可的松的125倍，能影响糖代谢，有留水、留钠及排钾作用，并具有抗炎、抗病毒、抗休克及抗过敏作用，。临床用途广泛，主要用于肾上腺皮质功能不足，自身免疫性疾病（如肾病性慢性肾炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎），变态反应性疾病（如支气管哮喘、药物性皮炎），以及急性白血病、眼炎及何杰金氏病，也用于某些严重感染所致的高热综合治疗。 此外，可用于虹膜睫状体炎、角膜炎、巩膜炎、结膜炎等，用于神经性皮炎，用于结核性脑膜炎、胸膜炎、关节炎、腱鞘炎、急慢性捩伤、腱鞘劳损、过敏性皮炎、脂溢性皮炎、瘙痒症等47。副作用：对充血性心力衰竭、糖尿病、急性感染病等患者慎用；对重症高血压、精

12、神病、消化道溃疡、骨质疏松症忌用。长期大量服用引起柯兴氏征、水钠潴留、精神症状、消化系统溃疡、骨质疏松、生长发育受抑制。1.1.4氢化可的松与药物相互作用 (1) 非甾体消炎镇痛药可加强其致溃疡作用。(2) 可增强对乙酰氨基酚的肝毒性。(3) 与两性霉素B或碳酸酐酶抑制剂合用，可加重低钾血症，长期与碳酸酐酶抑制剂合用，易发生低血钙和骨质疏松。(4) 与蛋白质同化激素合用，可增加水肿的发生率，使痤疮加重。(5) 与抗胆碱能药（如阿托品）长期合用，可致眼压增高。(6) 三环类抗抑郁药可使其引起的精神症状加重。(7) 与降糖药如胰岛素合用时，因可使糖尿病患者血糖升高，应适当调整降糖药剂量。(8) 甲

13、状腺激素可使其代谢清除率增加，故甲状腺激素或抗甲状腺药与其合用，应适当调整后者的剂量。(9) 与避孕药或雌激素制剂合用，可加强其治疗作用和不良反应。(10) 与强心苷合用，可增加洋地黄毒性及心律紊乱的发生。(11) 与排钾利尿药合用，可致严重低血钾，并由于水潴留而减弱利尿药的排钠利尿效应。(12) 与麻黄碱合用，可增强其代谢清除。(13) 与免疫抑制剂合用，可增加感染的危险性，并可能诱发淋巴瘤或其他淋巴细胞增生性疾病。(14) 可增加异烟肼在肝脏代谢和排泄，降低异烟肼的血药浓度和疗效。(15) 可促进美西律在体内代谢，降低血药浓度。(16) 与水杨酸盐合用，可减少血浆水杨酸盐的浓度。(17)

14、与生长激素合用，可抑制后者的促生长作用。1.1.5氢化可的松的发展前景氢化可的松作为重要的糖皮质激素药之一，而糖皮质激素是应用广泛的抗炎药物，是我国重要的出口创汇原料药之一。氢化可的松市场调研报告显示：氢化可的松市场的出口价600.620美元/kg，国内氢化可的松市场的价格5300.6500元/kg。近几年我国氢化可的松每年出口约20.30吨，国内市场每年需求30.35吨。 国内外对氢化可的松等甾体药物市场需求，一直保持每年10%以上速度递增，产品价格亦保持稳定。随着全球老龄化时代的到来，对氢化可的松市场的需求将会不断增长，具有乐观的市场前景。 我国自20世纪60年代开始着力研制，从而使可的松

15、、氢化可的松及其系列化品种得到了很好的开发，随着医学的进步，为了使抗炎活性获得较大的提高，国内化学原料药企业不断推进氢化可的松的发展进程。陕西安康是我国及世界重要的黄姜产地，目前人工栽培黄姜已达40万亩，成为国家唯一的黄姜产业化规范基地，开发生产氢化可的松产品有原料上的优势。1.2氢化可的松的合成方法1.2.1化学合成法制HCWoodward报道的HC全化学合成法近40步合成步骤8，该方法是以4-甲氧基-2-甲基苯醌作起始原料，经20步合成了第一个全合成的非芳香类固醇dl-9(11) , 6-双脱氢-20-去甲孕酮，再经一系列的反后转化成甲基dl-3-酮-4,9(11),16-三烯胆酸，由于甾

16、体骨架中A、C和D环具有对应的活性位，三重不饱和醚可全加氢和氧化成甲基三酮别胆烷，然后用三价的铬酸对C11位氧化，经一系列转化得HC。在上述方法中曾在一个问题就是在向C11-氧代氢化茚满的C-17位引入HC侧链是很困难的。由于烯基溴化镁在C-11位具有高的立体选择性。随后出现了18步合成可的松的方法9，该方法是以环己烯衍生物为起始原料，经11步反应合成17-异丙烯基茚满酮中间体，再据Stork方法经7步反应合成可的松，在此基础上Oliveto将HC醋酸酯转化成它的3，20-二肟，二腙和缩二氨基脲，再通过钾硼氢，硝酸作用脱去缩氨基脲最终可得HC10。此外，Minagawa等研究者向2，3-二氢茚

17、中间体同时引进C11-氧代基团和可的松侧链，该方法合成步骤和之前相比，步骤已大大缩短11。但总的来说，化学合成法步骤多，总收率低，很难实现其工业价值，所有工业上不采用化学合成法。1.2.2半合成法制HC1.2.2.1半合成法的简述甾体药物半合成的起始原料都是甾醇的衍生物。如从薯芋科植物得到薯芋皂素，从剑麻中得到剑麻皂素，从龙舌竺中得到番麻皂素，从油脂废气物中获得豆甾醇和- 谷甾醇，从羊毛脂中得到胆甾醇。这些都可以作为合成甾体药物半合成原料。60%的甾体药物的生产原料是薯芋皂素，近年来，由于薯芋皂素资源迅速减少，以及C17边链微生物氧化降解成功，国外以豆甾醇、谷甾醇作原料的比例已上升。我国主要以

18、薯芋皂素为半合成原料。剑麻皂素和番麻皂素的资源在我国也很丰富，但尚未得到充分利用。图2 薯芋皂素结构示意图比较薯蓣皂素与HC的化学结构可知，薯蓣皂素立体构型与氢化可的松的相似，薯蓣皂素化学结构中，A环带有羟基，B环带有双键，易于转化为4-3-酮的活性结构。比较两者结构的不同便可知，若以薯蓣皂素为合成原料必须要解决以下几个问题： 去掉薯蓣皂素中的E、F环。解决这一问题并不难，可以首先将薯蓣皂素经开环裂解去掉E、F环后，而获得理想的HC关键中间体双烯醇酮醋酸酯。在此过程中，除将C3羟基转化为酮基，C5、C6双键位移至C4、C5位。这一步把C3羟基转化为酮基较易进行，因为C3的羟基经氧化可直接得到酮

19、基，与此同时还伴有5双键的转位，则双键转移问题也迎刃而解了。此外，还需要引入三个特定的羟基。这些羟基的引入，有的容易，有的较难，如C21位上有活性氢原子，则可通过卤代之后，再转化为羟基；利用双键的存在，可经过氧化反应转化为C17羟基，并且由于X环的立体效应使C17羟基恰好为-构型。而最难引入的就是C-11-羟基，其也是在HC半合成路线中最关键的一步。由于在C-11位周围没有活性功能基团的影响，利用常规化学法很难氧化非活泼碳氢键。经研究发现生物催化法能解决引入C-11-羟基这一关键问题，因为生物催化法具有立体选择性氧化的特性。发现的有效的菌种有黑根霉和犁头霉，但两者有所不同。黑根霉可专一性的在C

20、-11位引人-羟基，不能直接引入C-11-羟基，故还需将其氧化为酮得醋酸可的松，再用钾硼氢对其进行不对称还原，得C-11位-羟基物，即HC；犁头霉却能在化台物S的C-11位上直接引入-羟基，其就缩短了合成HC的工艺路线12。这两种合成方法都是以薯芋皂素为起始原料，经开环，氧化，水解、消除得到双烯醇酮醋酸酯中间体，再将双烯醇酮醋酸酯环氧化后，再经Oppenauer氧化得环氧黄体酮。两者的区别是在由环氧黄体酮出发后的不同合成路径。梨头霉法是由环氧黄体酮先加溴开环、氢解脱溴，上碘，置换，从而得醋酸化合物S。由醋酸化合物S经梨头霉菌氧化直接引入C11位上-OH而得到HC。黑根霉法是先在C11位上引人-

21、OH后，经用铬酐、铬酸氧化C11位-OH为酮基。再上溴开环，用Raney镍氢消除溴，上碘置换得醋酸可的松，而后以缩氨脲保护C11、C20位上的酮基，用钾硼氢还原C11位上酮基使成为-OH，再脱去C11、C20位上的保护基和水解C21位上的乙酰基后来得到HC。梨头霉能在去氧氢化可的松C11位直接引人-OH，从而缩短了合成HC的工艺路线。目前国内生产HC的菌种主要是蓝色犁头霉，但由于蓝色犁头霉氧化专一性低，HC的收率受到限制。国外大都是用新月弯孢霉进行工业化生产，国内对用新月弯孢霉进行生物转化生产HC也有相关研究，但工业化生产较少。一般说来，新月弯孢霉对底物去氧氢化可的松醋酸酯(RSA)具有较低的

22、脱乙酰活性，而犁头霉AS365却对RSA呈现较高的脱乙酰活性。生物转化法大大简化了HC的合成路径，成本也大幅度降低。为提高转化率和收率，研究人员做出了重大努力，取得了较大进展。1.2.2.2 提高HC半合成收率及转化率的途径国内利用微生物进行生物转化生产甾体药物，可将微生物细胞内酶引入反应体系，利用微生物全细胞对底物进行生物转化18。而在实际生产中，甾体化合物在水溶液中溶解度很低，一般溶解度范围在10-510-6mol/L。，而微生物体内的1l-羟化酶位于水相中，又是一种胞内酶，底物需要透过细胞膜进入细胞才能进行转化反应，甾体底物与生物酶的接触十分困难。而利用“变压生物转化技术”，根据微生物本

23、身特性，通过在生物反应的一定阶段施加温和压力，以破坏底物RSA晶体结构，显著改善其在水相中的溶解性，增加生产菌株的细胞膜通透性，可促进底物与胞内酶的结合，使蓝色犁头霉HC转化率提高15。杨顺楷等采用超声法制备底物去氧氢化可的松(RS)-环糊精包合物，可提高甾体生物转化的底物投料浓度50。若采用连续两批次生物转化生产HC，也可提高底物浓度和HC的转化率。以新月弯孢霉的级培养18h的活菌丝为C11-位羟化催化剂，结合液相提取及菌丝淘析处理的方法，该工艺底物转化率可维持在65以上，HC的收率可达60。此外可分离回收未转化的高价值的甾体底物RS19。蓝色犁头霉的二级发酵培养工艺，分离出菌丝物在液相悬浮

24、介质中对RS底物进行C11-羟基化，在底物浓度相同的情况下，与直接发酵氧化(一步转化法)比较，氧化(C11-羟基化)速度提高12倍，缩短了发酵周期；RS的投料浓度也比直接发酵氧化提高了1.21.3倍，间接提高了转化率。对于微生物转化合成HC的方法，为了提高产率和转化率，国内、外都进行了不懈的努力。发展药物合成中一步分离的发酵工艺可使整个工艺简化。从RS开始合成去氢HC，需要连续两步微生物转化反应。若对每步反应的产物进行提取、分离，势必造成人力、物力和时问的浪费。若：采用两种微生物分别培养后转化，Mazumde成功地采用两种不同的固定化微生物，连续转化RS得到了去氢HC；两种微生物分别培养后混合

25、转化，Shull用培养好的草分枝杆菌(Mycobaccerium phlei)菌液稀释新月弯孢霉混合，经一步转化使RS变成去氢HC；两种微生物混合培养与转化也能使整个工艺简化。另外药物合成需要与反应器设计、分离纯化、过程强化等化学工程技术更加紧密地合作才能取得更大的效果。1.2.2.3减少副产物产生的方法减少副产物的生成也是提高HC转化率的重要方面。HC黑根霉和犁头霉半合成工艺中最大的副产物是表氢化可的松，即C11-羟基化合物。它是没有生理活性的副产物。对合成甾体糖皮质激素来说，由于C11-OH是抗炎药物必须的基团，最重要的微生物转化是羟化反应Hayano将C-11-和C-12-位的氢用3H所

26、取代的孕甾-3，20二酮作为底物，用黑根霉进行羟化来进行研究，说明甾体的酶促羟化反应是羟基位置上的氢被直接取代，即羟基取代的立体构型是由氢原子原来所占的空间位置决定的。C11-羟化其上羟基的立体位置是竖直的，由于10，13角甲基的存在，11-竖键羟基的立体阻碍比11-a-横键羟基位阻为大，造成11-羟化比1-羟化收率低，且副产物较多。表氢可的松可转化为可的松或其它甾体，如氟氢可的松等加以利用，以减少原料的浪费20。王敏等通过采用细胞通透剂二甲基亚砜和丙二醇来提高HC转化的立体选择性21，其中二甲基亚砜能使/值提高5，丙二醇能使/值提高9。他们在开展犁头霉对RSA的羟基化研究中，选择洗涤菌丝悬浮

27、在柠檬酸缓冲液中有利于C11-羟基化，指出无论是犁头霉或新月弯孢霉在C11-羟基化反应中，洗涤菌丝可提高羟化酶的专一性，减少异构体副产物的形成。波兰学者Sedlaczek等在新月弯孢霉对RS的C11-羟基化过程消除副产物方面取得了引人注目的进展。通过理性了解真菌的系统生物学知识，借助传统的诱变选育技术，对新月弯孢霉菌丝细胞的原生质体(有完整核型)用化学诱变剂NTG处理，分离选育出对甾体RS的C11-羟基化稳定型的突变株，可显著降低副产物量的65。获得产率较亲株高28.5%。Modilnisky等在开展蓝色犁头霉(TieghemeUaorchidis)对RSA生物转化生产HC的实验研究中，将培养

28、基中的葡萄糖用蔗糖或淀粉替代，结果并没有造成C11-和C11-羟化甾体产物数量比例的改变，但却呈现了利用蔗糖作碳源的试验组转化速度较淀粉组快15倍，较利用葡萄糖组快2倍的试验结果。放大试验中，在不超过1014h转化期间内，生成产物HC的数量比例达到5560。值得指出的是该RSA的底物质量浓度较低0.5g/L，实际应用价值有限。若以RS-17，21-二醋酸酯为底物代替常规的去氧氢化可的松醋酸酯(RSA)，实验转化结果中副产物14-羟基-RS的生成量明显减少。这是因为在甾体分子C14-位附近的面当引入较大的取代基，如17醋酸酯，可造成14-位的立体障碍，抑制14-羟基化活性，提高11羟基化物的收率

29、。荷兰Gist公司采用化合物RS-17a-醋酸酯为底物，获得了高收率的HC及HCl7-醋酸酯的混合物，后者易水解为HC22,23。目前甾体微生物转化中受到人们关注的领域有24：将微生物基因工程的概念应用于甾体微生物转化，发展整体生物催化；发展酶催化，通过修饰和固定化以提高选择性、稳定性、利于它们的协同催化及循环利用；提高水不溶性底物的溶解度或提高酶和细胞在有机相中的生物活性及稳定性；发展酶的在线再生和循环催化、有用物连续网收，更好地利用作为工业废料的甾醇化合物以生产有用的甾体化合物中间体；修饰培养基、产物连续采出以提高收率和产量。人们希望在控制微生物转化方而能进一步发展，以进一步降低成本。1.

30、2.2.4分离与提纯28氢化可的松的生产工艺有合成和发酵两种，现在工业上多采用半生物合成法生产, 即由薯蓣皂素等天然原料先合成化合物S 的醋酸酯, 再利用梨头霉菌氧化; 氧化产物经乙酸丁酯五次错流萃取得到粗品。由于氧化反应的选择性较差,粗品中尚含有其旋光异构体表氢化可的松 ,需再用结晶分离提纯。采用溶剂萃取法, 可克服工业上现有氢化可的松及其光学异构体表氢化可的松结晶分离工艺的缺点。乙酸丁酯对其具有较好的萃取分离性能, 17时分离系数为3.6。氢化可的松粗品以乙酸丁酯为萃取剂, 经分馏萃取分离可获得纯度为 98%以上的精制品。国内生产厂家现多采用上述工艺,所用萃取剂是醋酸丁酯或醋酸异丁酯,流程

31、为多级错流萃取形式,所用的设备是带有搅拌的金属罐,间歇操作,萃取效率低；结晶分离过程周期长,萃取剂耗量大,萃取效果较差,操作繁复,收率低等缺点。因此,针对氢化可的松的生产 ,开发新的连续逆流提取工艺并引进高效的生产设备是很有必要的。环隙式离心萃取器是依靠离心力来完成两相混合液分相的 ,相对于重力萃取设备(如混合澄清槽、萃取塔等)具有许多显著优点。取醋酸丁酯为萃取剂 ,环隙式离心萃取器为主要设备,对连续逆流提取氢化可的松进行了实验研究。环隙式离心萃取器是一种新型的高效液-液萃取设备,具有生产能力大 ,存留量小,两相接触时间短,适应流比范围宽,传质效率高,设备紧凑,占用厂房面积小,操作和维修简单等

32、优点,特别适用于处理两相密度差小、黏度大和易乳化的体系,并且可以单台运行,也可根据工艺需要多台串联运行,且台数不限,开车停车方便 ,开车后能迅速达到稳态运行,易实现在线分析和自动控制等。当密度不同、 互不相溶的两相液体分别从两个进料口进入环隙后,依靠高速旋转转筒的带动以及液层间的摩擦,在环隙内实现剧烈而均匀的混合,萃取传质过程由此发生。当高速旋转的混合液向下流动碰到固定叶片后,从转筒底部的混合相口进入转筒。混合液在强大离心力的作用下进行分相,重相被甩到转筒外缘,聚集到转筒内壁处,通过靠近转筒壁的垂直孔道经重相堰流入重相收集室,从重相出口流出,而轻相则被挤向转筒中间,经轻相堰和水平通道流入轻相收

33、集室,从轻相出口流出。用醋酸丁酯从发酵液中提取氢化可的松,萃取平衡时间不大于5s,因此,氢化可的松的传质过程只受扩散因素的控制。把错流萃取流程改为环隙式离心萃取器连续逆流萃取流程,工艺更合理、先进,做到在相同级数,较少萃取剂耗量的条件下,达到较好的萃取效果。对于醋酸丁酯-氢化可的松发酵液体系,用环隙式离心萃取器可实现萃取分离,在一定的操作条件下,其萃取率高于现行厂家的生产工艺提取率(90 %) ,而且由于减小了体积比,因而也减少了萃取剂的耗量。当发酵液因染菌而造成乳化时 ,用环隙式离心萃取器处理 ,也可实现两相分离,提取到氢化可的松。因此 ,采用环隙式离心萃取器进行连续逆流提取氢化可的松是可行

34、的,与现行的萃取设备相比,具有很多优点。1.2.2.5含量测定29目前，测定氢化可的松的方法主要有分光光度法、荧光光度法、高效液相色谱法 及毛细管电泳法等，用化学发光法测定氢化可的松虽有文献报道，但均是基于甾类有机物对Ce（）-SO32- 化学发光体系的增敏作用建立的，选择性较差，测定范围及灵敏度也不够理想，单独测定氢化可的松尚须配合高效液相色谱等分离手段。研究发现，在NaOH碱性介质中，铁氰化钾可以直接氧化氢化可的松产生化学发光，奎宁对该反应具有显著的增敏作用。据此，范顺利，李薇等人提出了一种测定氢化可的松的化学发光新体系。并结合反相流动注射技术，建立起一种直接测定氢化可的松的新方法。该方法

35、简单，测定快速，与文献报道的利用发光体系测定氢化可的松的方法相比，灵敏度高出近两个数量级，且测定范围大，选择性有一定改善。无须采取预分离措施，用于药物中氢化可的松含量的测定，结果满意。1.2.3全生物合成法制HC13动物体内能合成三类重要的类固醇：糖皮质激素(如HC)、盐皮质激素和性激素。在动物肾上腺皮质内，由线粒体侧链分裂胆固醇，使之转化成孕烯醇酮，在内质网(SER)和线粒体中脱氢成黄体酮，再经过细胞色素P450酶的17羟化、皮质脱氧、11羟化三步酶促反应，最终在线粒体中转化为HC；也可用植物7还原酶修饰麦角固醇主体利用简单碳源转化成孕烯醇酮。Dumas等报道，酵母本身并不合成胆固醇，也不从

36、外界吸收固醇类。它需要以简单的含碳化合物，如乙醇和葡萄糖为原料，通过7还原酶合成类似于胆固醇的物质，麦角固醇，然后模仿肾上腺合成HC。这需要在酵母体内重新组建人体合成HC的整个途径，也就是将合成途径中所需的全部基因引入酵母体内，而酵母体内存在的对合成目标产物不利的基因也将被除去。酵母合成HC是在一种高专一化的酶，即细胞色素P450单(加)氧酶催化下进行的。细胞色素P450系列酶是一个亚铁血红素蛋白大家族，主要应用在药物代谢和类固醇、油脂、维生素及天然产品的合成中。他们在不活泼CH键中插入氧原子方面有显著作用，但他们的应用受限于底物的敏感性、低活性、不稳定性及需要辅因子。人们通过不同的途径，如变

37、异、化学修饰、条件工程及固定化希望有效攻破这些难题。2003年，法国、德国学者和企业界合作，首次全生物合成了HC。该重组人源化酵母工程设计制备13个工程基因并表达在单个酵母体中，其中9个基因由外源机体哺乳动物及植物提供。构建成功的这一酵母工程菌，它能表达1个植物酶基因，引人8个相关哺乳蛋白酶，需优化两个线粒体系统，敲除4个产生副反应基因，使得原本仅产生麦角甾醇的酵母菌能利用简单碳源乙醇，糖等制得HC。这项研究成功解决了：CYP11Al底物的自生产；线粒体P450及相关载体的靶目标；人工生物台成的新陈代谢平衡；将中间产物转化为代谢终产物的副反应的识别和防止；对酵母有毒害作用的中间产物识别等难题。

38、识别出两个主要的副反应是：由ATF2的基因产物催化的孕烯醇酮的酯化和由GCYl和YPRl基因产物共同催化的17a-羟基孕酮的20-酮的减少。可通过使这两种酵母基因失活减少副反应的产生。研究结果可使HC占所有类固醇产物的70，理想情况下副产物仅有11-脱氧皮质醇和皮质酮。该方法简洁，有望成为HC生产的新途径14。二、氢化可的松的合成工艺过程2,16,17在甾体药物中仅有极少数是用全合成方法制备，因为氢化可的松的结构复杂，工艺路线过长，反应特殊，工艺过程过于繁杂，总收率低而无工业生产价值。目前国内外都采用半合成的工艺路线，即从天然化合物中取得含有甾体基本骨架的化合物为原料通过化学合成来制取甾体药物

39、15。本文以犁头霉菌氧化工艺路线研究生产工艺。2.1合成氢化可的松的原料2.1.1原料来源16薯蓣皂素（diosgenin）是目前合成皮质激素类药物的主要原料，可从薯蓣科（Dioscoteoceae）植物如穿龙薯蓣（穿山龙）、黄独（黄药）、黄姜、叉蕊薯蓣等植物中提取。此外，丝兰属植物菠萝花，俗称剑麻和龙舌兰属植物金边龙舌兰，在去除纤维后的废液中，经水解可提取海可皂素，从大豆中提取的豆甾醇，从羊毛脂中提取的胆甾醇等，也都可作为甾体药物的原料。2.1.2薯蓣皂素的制备16自然界存在的薯蓣皂甙是由薯蓣皂素即甙元部分和糖部分组成。薯蓣科植物穿地龙、黄山药等所含的薯蓣皂甙，是由薯蓣甙元和两个鼠李糖，一个

40、葡萄糖相连的配糖体。薯蓣皂甙在稀硫酸的催化下水解氧甙键断裂而得到甙元（薯蓣皂素）和糖部分。再用石油醚或汽油提取而制得薯蓣皂素。将穿地笼或黄山药等薯蓣科植物切碎，先用水浸泡数小时，放掉浸液，加入3倍量的3%稀硫酸，在0.15MPa压力下水解36h，稍冷却，放掉酸液，出料，经砸碎后用水洗至pH67,晒干。将干燥物投入萃取罐中，用7倍量汽油或石油醚（沸程80120)反复萃取。萃取温度控制在（602）。将萃取液浓缩至一定体积，冷却析出结晶，过滤，得到薯芋皂素。 2.1.3薯蓣皂素的制备工艺流程图 图3 制备薯蓣皂素的工艺流程图2.2 5,16-娠二烯-3-醇-20-酮-3-醋酸酯（双烯醇酮醋酸酯）制备

41、2.2.1 工艺原理以薯蓣皂素为起始原料，经加压开环，用铬酸氧化，酸性水解，消除三步反应制得双烯醇酮。(1) 加压开环醋酐在酸性下（冰醋酸）形成乙酰正离子，在高温下与呋喃上氧结合。从而打开呋喃环。该反应关键是形成乙酰正离子和提高反应温度，提高乙酰正离子的进攻氧的能力。而水的存在，会影响乙酰正离子的形成，故在这步反应中要控制原辅料的水分。原本用叔碱氢卤酸盐催化下醋酐常压开环，现如今用冰醋酸催化，醋酐加压开环，这样提高了反应温度，加快反应速度，省去甲基吡啶等有害物质的使用，并使收率提高。(2) 铬酸氧化该反应是放热反应，除生成双酮产物外，还有可能生成环氧化物和二醇碳酸酯，冷冻设备是关键。另外，铬盐

42、有毒，易污染水质，用H2O2或O3替代铬盐还未在工业生产中得到应用。(3) 酸性水解在酸性下发生-H消除反应促进C20的烯醇化，在回复成酮时发生消除反应。2.2.2工艺过程配料比为薯蓣皂素：醋酸：醋酐：环乙烷：乙醇=1：2.7：1.25：8：2.25（重量比）。 将薯芋皂素、醋酐、冰醋酸投入反应罐中，然后抽真空以排出空气。当加热至125时开启压缩空气，使罐内压力为4.55.5105P，温度为195200，关掉压力阀，反应50min，反应毕，冷却，加入冰醋酸，用冰盐水冷却至5 以下，投入预先配置的氧化剂（铬酐、醋酸钠和水组成），反应罐内温度急剧上升，在6070 保温反应20min，加热到9010

43、0 ， 常压蒸馏回收醋酸，再改减压回收醋酸到一定体积，冷却后，加水稀释，用环已烷提取，分出水层；有机萃取液减压浓缩至干，加适量乙醇，再减压蒸馏带尽环已烷，再用乙醇重结晶，甩滤，用乙醇洗涤，干燥，得到双烯醇酮醋酸酯精品，熔点165以上，收率55%57%。2.2.3 反应条件及影响因素（1） 控制原辅材料水分，促进乙酰正离子的形成，加速开环。（2） 加压能提高反应温度，有利于开环和消除。（3） 氧化反应是放热反应，控制反应温度，防止溢料是关键。（4） 反应罐夹层需用冰盐水冷却。（5） 反应开始时必须开启安全阀。（6） 氧化罐最高装料量不得超过其容量的60%。（7） 当反应温度超过100时，须立即停

44、止搅拌。2.3 16，17-环氧黄体酮的制备2.3.1工艺原理双烯醇酮醋酸酯经环氧化和奥氏氧化两步制得16，17-环氧黄体酮。 （1）环氧化反应在双烯醇酮醋酸酯的分子中，C16、C17之间的双键和C20的羰基构成一个，-不饱和酮的共扼体系，因此，这里的环氧化反应必须用亲核环氧化试剂。可用碱性双氧水以选择性的环氧化C16、C17之间的双键，而使分子中C5、C6间孤立双键不受碱性双氧水的作用。（2）Oppenauer 氧化该反应是以环已酮为氧化剂，异丙醇铝为催化剂，将C3仲醇氧化为酮。-位的双键即发生重排转移到a-位上，形成a，-不饱和酮的共轭体系。Oppenauer氧化反应能选择性的把伯醇、仲醇

45、氧化为酮，而不氧化分子结构中羰基、双键等易被氧化的部分 。2.3.2 工艺过程配料比为双烯醇酮醋酸酯：甲醇：氢氧化钠：过氧化氢：甲苯：环已酮：异丙醇铝=1：7.5：0.2：0.6：20：2.7：0.15（重量比）。将双烯醇酮醋酸酯和甲醇抽入反应罐内，通入氮气，在搅拌下滴加20%的氢氧化钠液，温度不超过30，加毕，降温到2024，逐渐加入过氧化氢，控制温度30以下，加毕，保温反应8h，抽样测定双氧水含量在0.5% 以下。环氧物熔点在184以上，即为反应终点。静置，析出，得熔点184190。用焦亚硫酸中和反应液到pH78, 加热至沸，减压回收甲醇，用甲苯萃取，热水洗涤甲苯萃取液至中性，甲苯层用常压

46、蒸馏除水，直到馏出液澄清为止，加入环已酮，再蒸馏除水到流出液澄清。加入预先配制好的异丙醇铝，再加热回流1.5h，冷却到100以下，加入氢氧化钠液，通入水蒸气蒸馏带出甲苯，趁热滤出粗品，用热水洗涤滤饼到洗液呈中性。干燥滤饼，用乙醇精制，甩滤，滤饼经颗粒机过筛、粉碎、干燥，得环氧黄体酮，熔点207210,收率75%。2.3.3反应条件及影响因素（1） 严格控制反应温度，温度高于30，会导致过氧化氢分解，引起副反应，则生成C16，C17双键与甲醇的加成产物。同时，还可使C17,C20构型异构化（转位）使产物中出现油状物，影响收率及质量。（2） 用测定反应液中过氧化氢的含量和环氧物的熔点为依据来控制环

47、氧反应的终点。当过氧化氢含量大于0.5%，而环氧物的熔点低于184时，则可适当提高反应温度（但不超过30）继续反应，当环氧物熔点偏低，而过氧化氢的含量也低于0.5%时，则应适当补加过氧化氢继续反应。（3） 环氧化反应是在碱性介质中进行，如碱浓度太大，易使过氧化物破坏，而PH在8以下时，则反应不完全。反应液中有金属离子，尤其是有铁离子存在时，可使过氧化氢分解，并使甲醇氧化生成甲酸，从而使PH下降。当配制NaOH溶液时，如出现红色，说明含铁量大，此时，可加入少量硅酸钠类混合物，使金属离子生成硅酸盐沉淀，以免金属离子影响环氧化反应。（4） 沃氏反应为可逆反应，反映方向与异丙醇铝和环己酮的用量有关，环

48、已酮的用量超过理论用量的4倍。（5） 沃氏氧化反应应无水操作，因为催化剂异丙醇铝遇水分解，导致反应失败。（6） 反应结束后应用氢氧化钠溶液破坏异丙醇铝以除去铝盐，NaOH使铝盐生成水溶性偏铝酸钠，易于分离除去。2.4 17-羟基黄体酮的制备2.4.1 工艺原理环氧黄体酮经开环和脱溴两步反应制得17-羟基黄体酮。（1）加溴开环反应环氧黄体酮在酸性条件下极不稳定，因环氧基的氧原子在酸性条件下先质子化，离子又由于C17位上有乙酰基的位阻影响，溴负离子只能从环氧环的背面（面）进攻C16位上，使环氧破裂，生成16-溴-17-羟基的反式加成物。（2） 脱溴反应 这是卤代烃的氢解脱卤反应，氢气被催化剂Ran

49、ey镍吸附后，形成原子态氢（H），它很活泼，使C16位上的C-Br键断裂，并生成C-H和HBr达到除溴的目的。在分子中还存在有其它可被氢化的基团，因此，加入吡啶以保护C3、C20位上的酮基及C4、C5间双键不被氢化。另外，加入醋酸铵以除去HBr。2.4.2 工艺过程配料比为环氧黄体酮：溴氢酸：乙醇：醋酸：醋酸铵：吡啶：Raney镍=1：3.1：18：0.25：0.36：0.2：0.4（重量比）。将含量56%的溴氢酸预冷到15加入环氧黄体酮，温度不超过2426，加毕，反应1.5h，将反应物倾入水中，静置，过滤，再用水洗涤到中性和无溴离子，得到16-溴-17-羟基黄体酮。使其溶于乙醇中，加入冰醋酸

50、及Raney镍，封闭反应罐，尽量排出罐内空气。然后在1.96104Pa的压力下通入氢气，于3436滴加醋酸铵-吡啶溶液，继续反应直到除尽溴。停止通入氢气，加热到6568保温15min，过滤，滤液减压浓缩回收乙醇，冷却，加水稀释。析出沉淀，过滤，用水洗涤滤饼至中性，干燥得17-羟基黄体酮，熔点184，收率95%。2.4.3反应条件及影响因素（1） 氢氧化溴中游离溴的含量不得超过0.5%，否则C4，C5上发生加成反应。（2） 反应中加入吡啶，因吡啶分子中氮原子上具有未共用电子对，它极易被催化剂Raney镍吸附，从而保护C4，C5双键和C3酮基不被氢化。（3） 反应中生成HBr对Raney镍是一种毒

51、剂，它使Raney镍中毒，阻碍反应进行。加入醋酸铵的目的，一方面是中和反应生成的溴化氢，另一方面是以便与醋酸组成缓冲液，调节反应液的PH，维持反应顺利进行。（4） 脱溴反应是一个气-液-固三相反应，故需要良好搅拌。（5） 干燥的Raney镍遇空气中的氧会燃烧，应保存在水中备用，保证安全。2.5 4-娠烯-17，21-二醇-3,20-二酮（醋酸化合物S）的制备2.5.1工艺原理 羟基黄体酮经C21位碘代和置换二步反应，引入乙酰氧基制得醋酸化合物S。（1）碘代反应碘代反应是在碱催化下羰基-碳上的氢被卤素取代的反应。由于受到C20位羰基的影响，C21位上的-氢原子活性增强，在OH离子作用下，脱去a-

52、氢形成水。碘溶在极性溶剂氯化钙甲醇溶液中易被极化成I，被极化的碘正离子I+向碳负离子进攻而生成17-羟基21-碘黄体酮。(2）置换反应（酯化反应）酯化反应是亲核取代反应，醋酸钾需要在极性溶剂中解离出的醋酸根离子向带正电荷的C21作亲核进攻，从而置换出碘负离子，碘负离子与醋酸钾解离出的钾离子作用生成碘化钾。2.5.2 工艺过程在反应罐内投入氯仿及氯化钙-甲醇溶液的1/3量，搅拌下投入17羟基黄体酮，待全溶后加入氧化钙，搅拌冷至0。将碘溶于其余2/3的氯化钙甲醇溶液中，慢慢滴入反应罐中，保持温度在02 ，滴毕，继续保温搅拌反应1.5h，加入预冷至10的氯化铵溶液，静置，分出氯仿层，减压回收氯仿到结晶析出，加入甲醇，搅拌均匀，减压浓缩至干，即为1721-碘羟基黄体酮。加入二甲基甲酰胺（DMF）总量的3/4,使其溶解，降温到10 左右，加入新配制的醋酸钾液，逐步升温反应到90 ,再保温反应0.5h，冷却到10 ，过滤，用水洗涤，干燥得醋酸化合物。熔点226 ,收率95%。2.5.3反应条件及影响因素(1) 原料中含有微量水分，反应中又生成水，加入的氯化钙转化为氢氧化钙，是碘代反应的催化剂。(2) 氢氧化钙呈粘稠状，加入氯化铵溶液使之与氢氧化钙生成可溶性的钙盐，同时控制水