溴麝香草酚蓝比色法测定叶下珠生物碱的含量

1、溴麝香草酚蓝比色法测定叶下珠生物碱的含量作者：邓光辉 胡炜 刘榕城 张桂华 农林【摘要】目的测定叶下珠中总生物碱的含量。方法以溴麝香草酚蓝为显色剂于415 nm波长处测定吸光度。结果苦参碱在0.0040.02 mgml范围内线性关系良好（r=0.997 54）；其与溴麝香草酚蓝所形成的离子对产物在6 h内稳定；平均加样回收率为98.65(RSD=1.98)。结论该方法简单、快速、准确，可用于生药及产品的生物碱质量控制。 【关键词】溴麝香草酚蓝 比色法 叶下珠 生物碱叶下珠(别名珍珠草)为大戟科叶下珠属中的一种草本植物，具有清肝明目、解毒消肿的功效，常用于 治疗 腹泻下痢、尿路感染、小儿疳积、肝

2、炎、肾炎等疾病，其化学成分主要有生物碱和黄酮两大类。生物碱是存在于生物体内的含氮有机化合物，大多数存在于植物中，目前已分离到三千余种，其中近百种具有很强的生理活性1。 现代 药理研究表明，生物碱具有抗肿瘤、抗炎、抗心律失常等方面的作用2,3 ,其在医药和农药方面的应用已引起人们的广泛关注。对天然生物碱的生物活性、提取、精制、鉴定方法等方面的研究多见报道4。目前总生物碱的含量测定有重量法、酸碱滴定法、分光光度法。考虑到生物碱的结构，本文采用酸性染料比色法，以苦参碱为对照品，对不同产地来源的叶下珠中的总生物碱进行了含量测定，建立了叶下珠中总生物碱含量的测定方法。 1 材料与仪器JP600型变辐杆式

3、超声波萃取器（武汉嘉鹏 电子 有限公司）；916型紫外-可见分光光度计（澳大利亚GBC公司），分析天平（上海第三分析仪器厂），酸度计，苦参碱 ( 中国 药品生物制品检定所)，溴麝香草酚蓝和其余试剂均为分析纯。叶下珠，购自广西、云南、广东。 2 方法 2.1 储备溶液的配置精确称取苦参碱标准品10 mg，用95乙醇溶解后定容于50 ml的容量瓶，摇匀，备用。2.2 对照品溶液的配置移取“2.1”项下储备溶液5.00 ml于50 ml容量瓶，定容，摇匀，备用。2.3 样品溶液的制备取叶下珠粉碎成粗粉，精确称取5 g，加入0.5%的乙酸溶液200 ml，浸泡24 h，超声波提取30 min过滤，往滤

4、液中加入氢氧化钠溶液至中性，过滤。沉淀用95乙醇溶解后定容于50 ml容量瓶中，备用。 3 结果 3.1 条件的优选3.1.1 最大吸收波长的确定移取对照品溶液2.00 ml，置于125 ml的分液漏斗中，加入pH=7.5的磷酸盐缓冲液5.00 ml，加入0.025%的溴麝香草酚蓝1.00 ml，加入氯仿10.00 ml，振摇1 min，静置30 min，分取氯仿层于具塞锥形瓶中，用无水氯化钙干燥5 min，以5.00 ml蒸馏水加pH=7.5的磷酸盐缓冲，加0.025%的麝香草酚蓝，加氯仿的萃取溶液作为参比，在360550 nm波长范围内进行扫描，结果显示溶液在415 nm波长处有最大吸收。

5、3.1.2 pH值的确定移取对照品溶液2.00 ml，按照“3.1.1”项下方法分别加入pH为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸盐缓冲液，结果显示：当加入的磷酸氢二钠与磷酸二氢钾的浓度分别为0.008 mol/L和0.030 mol/L（pH=7.5）时，溶液的吸光度最大，所以实验选择pH为7.5的磷酸盐缓冲溶液。3.1.3 溴麝香草酚蓝用量的确定移取对照品溶液5.00 ml，按照“3.1.1”项下方法分别加入0.025%的麝香草酚蓝1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml，结果显示，当加入的麝香草酚蓝体积为4.00 ml时，溶液吸光度最大，所以实验选择溴麝香草酚蓝的用

6、量为4. 00 ml。3.2 标准曲线的绘制移取苦生碱对照品溶液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml，置于125 ml的分液漏斗中，加入二次蒸馏水至5.00 ml，加入pH=7.5的磷酸盐缓冲液5.00 ml，加入0.05%的溴麝香草酚蓝4.00 ml，加入氯仿10.00 ml，振摇1 min， 静置30 min，分取氯仿层于具塞锥形瓶中，用无水氯化钙干燥5 min，分别在415 nm波长处测定吸光度。以浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=-0.026 3+25.675C（r=0.997 54），苦参碱检测浓度在0.0040.02 mg/ml

7、范围内与吸光度有良好的线性关系。3.3 稳定性实验移取对照品溶液2.00 ml，按“3.1.1”项下方法在415 nm波长处测定吸光度。并在室温下每隔1 h测定1次吸光度，连续测定6次，结果表明，苦生碱与溴麝香草酚蓝的显色产物在6 h内稳定，其RSD=1.65。3.4 精密度实验分别移取2.00 ml对照品溶液3份，按“3.1.1”方法在415 nm波长处测定吸光度，RSD=1.2。3.5 加样回收实验移取样品溶液(广西武鸣样品)1.00 ml，按照“3.1.1”方法测定总生物碱的含量。在样品溶液中加入3.00 ml的苦参碱对照品溶液后测定吸光度， 计算 总生物碱含量，进行加样回收实验。平行测

8、定3次。样品溶液体积1.00 ml，生物碱平均含量0.059 07 mg，加入量0.060 00 mg，平均回收率98.65%，RSD=1.98%。3.6 总生物碱的测定将6种不同产地来源的叶下珠药材粉，按照实验方法测定总生物碱含量。结果见表1。表1 不同产地来源叶下珠中总生物碱含量测定结果（略） 4 结论由于叶下珠中生物碱成分易溶于酸性溶液，因此采用0.5醋酸作为提取液，结合超声波提取方法，可以保证药材中生物碱成分的完全提取。根据在一定pH介质中，生物碱类与氢离子生成阳离子，酸性染料在此条件下解离成阴离子，两者发生离子对反应，定量结合生成有色络合物，该络合物可被有机溶剂定量萃取的原理，本实验用苦参碱作为标准物质在pH=7.5的缓冲溶液中与溴麝香草酚蓝定量显色，从而求得叶下珠中总生物碱的含量。pH环境对显色反应影响显著。本实验中使苦参碱与溴麝香草酚蓝分别在pH为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸盐缓冲液中反应后测定吸光度，结果表明，当在pH为7.5的磷酸盐缓冲液中，显色反应达到最佳。【 参考文献 】 1 刘喜纲, 刘翠哲, 常金花. 应用酸性比色法测定总生物碱的含量J. 中国 药房, 2007, 18(11): 875.2 李金陵, 程爱民, 荆宇红，等. 重要苦参抗肿瘤作用的实验研究J.中国肿瘤