酶工程实验报告三( 纤维素酶最适反应pH值的测定)

1、本科学生实验报告仅供参考责任自负学号 104120440 姓 名 孙 永 升 学院 生命科学学院 专业、班级 10生物技术 实验课程名称 酶 工 程 教师及职称 李 俊 俊 开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期 填报时间 2013 年 4 月 24 日 云南师范大学教务处编印实验名称实验方式小组成员实验三 纤维素酶最适反应pH值的测定小组合作XXXXXXXX1、 实验目的掌握酶最适pH值的测定方法及原理。2、 实验仪器、试剂和溶液：A 2 仪器：紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅(4台)、试管架（1个）、1ml移液管（1根）、10ml移液管（1根）、玻璃棒（1根）、1000

2、ml烧杯（1个）、500ml烧杯（2个）、1000ml容量瓶（1个)、洗耳球（1个）、标签（若干）等。B 2 试剂和溶液 DNS试剂(CMCA-DNS )：称取 3,5 一二硝基水杨酸(10士0.1) g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠log，在50水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。 乙酸-乙酸钠缓冲液，0.01mol/L CMC-Na溶液（底物溶液） 纤维素酶液(pH4 .8 和pH6 .0)。3、实验原理及实验流程或装置示

3、意图：A 3原理:pH值对酶反应速度有显著影响。每一种酶都有一个特定的最适反应pH值，在此pH值下酶反应速度最快，而在此pH值两侧酶反应速度都会受到影响而放缓。因为酶蛋白是两性电解质，具有许多可解离基团，在不同的酸碱环境中这些基团的解离状态不同，所带电荷不同，而他们的解离状态对保持酶的结构，底物与酶的结合能力以及催化能力都有重要作用。表现酶最大活性的pH值即为该酶的最适pH值。不同的酶其最适pH值不同。pH与酶活性关系的测定是在其它条件（如底物浓度、酶浓度、反应温度等）恒定的最适情况下，选用一系列变化的pH环境中进行初速度测定，其图形一般为钟形曲线。B 3 实验流程: 酶液的稀释（不同pH所用

4、酶液用对应pH缓冲液稀释）不同pH下（55）水浴30min 沸水浴10min迅速冷却至室温,用水定容至25ml540nm处测吸光度（OD540）绘制pH -酶活力曲线求出纤维素酶最适pH 4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：A 4 、实验方法1、本实验在pH值3.0至10.0之间选择不同pH值环境下测定酶活力，以找出 纤维素酶在此条件下的最适pH值。2、 待测酶液制备 称取固体纤维素酶1g，精确至0.1mg，用蒸馏水溶解，用不同pH值的乙酸-乙酸钠缓冲液准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差落在0.20.5范围内，不在此范围内，酶液要进行重新稀释），待测。本实验在室温下55下选择不同的p

5、H值来测定酶活力，以找出在此条件下的最适pH值。编号123456789101112131415pH3.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.09.510.0 表一B 4、操作步骤:（1）取3支25mL刻度具塞试管（1支做空白管，2支做样品管）。（2）分别向3支管中准确加入不同pH值的CMC-Na溶液2.00mL 注意：加入CMC-Na溶液时应缓慢，不可粘在试管壁上。（3）分别准确加入稀释好的待测酶液0.5mL于2支样品管中（空白管不加） 用涡旋混合器混匀。（ 注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可顺 着试管壁加入）（4）将3支试管同时置于酶反应最适温度水浴中，

6、准确计时，反应30min， 取出。（5）迅速准确地向3支管中加入3mLDNA试剂（加液顺序和加酶液顺序相同以保证反应时间相同），振荡摇匀，于空白管中准确加入稀释好的待测酶液0.5mL，摇匀。将3支管同时放入沸水浴中，准确计时，煮沸10min取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL。（6）以空白管调零，在分光光度计540nm波长下，用1cm比色皿，分别测量2支样品管中样液的吸光度OD值，分别记为ODE1、ODE2 ，取二者平均值。带入标准曲线方程计算酶活力。D 4 实验注意事项 反应温度准确，酶液准确稀释。不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸

7、水加热时脱落；移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；5 实验处理A 5葡萄糖标准曲线如 图1：图1 标准曲线葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程y=kx-0.0747，k=0.7023，R2=0.99920.99，该标准曲线相关性很好。式中Y表示表示测定的吸光度（OD）值，X表示还原糖的浓度, 0.0747表示补偿参数。B 5 纤维素酶酶活力（U/g）=(K平均OD+b)N/(0.50.5)式中： K标准曲线的斜率;b标准曲线的截距;N试样的总稀释倍数;0.5反应酶液的体积，mL;0.5反

8、应时间，h。酶活力的计算值保留3位有效数字注意：同一试样两个平行测定值的相对偏差在8%以内，二者的平均值为最终的酶活力测定值。C 5实验数据与结果处理：如表二：pH（温度55）酶液稀释倍数OD540值纤维素酶酶活力（U/g）3.05002.4233552.746 3.55002.5043666.5184.021031.2037356.5354.51040.55018438.6005.01040.43115095.6525.51040.41114533.8126.01040.40014224.8006.51040.31311780.7967.051030.0171732.7827.521030.

9、1151243.7168.05000.6671086.2688.55000.299569.3759.05000.243490.7189.55000.223462.62610.05000.024183.110（注：本实验酶反应设定温度55） 表二D 5 SPSS统计分析作图： 图二 图二 图三 不同pH值对酶活力影响，引自张永凤等（2007）E 5分析与讨论：此次实验中为测定纤维素酶最适反应pH，最后根据pH与酶活力作酶活与pH曲线，由上图二可初步得出结论：温度55，pH 4时，稀释104。纤维素酶活最大，最适条件下的酶活力为18438.600 U/g。黄燕华等（2004）1纤维素酶的酶活测定最

10、适为pH 4.8, 最适温度为50 , 最适反应时间为60min,同时需要设置以有底物无酶或有酶无底物的空白作为对照。谭占仙（2009）2在研究pH 值、温度对纤维素酶活力的影响时测定结果为：酸性纤维素酶最适宜的pH 值为4.85，温度为60或65碱性纤维素酶最适宜的pH 值为6.0，温度为60或65；张永凤等（2007）3用DNS 法测定酸性纤维素酶活力。分析了酶促反应时间、pH、酶液稀释度、温度对酶活力测定结果的影响。研究表明, 该纤维素酶酶促反应的最适条件为: 酶促反应时间为30 min, 最适pH 为5.0, 酶液稀释至130 倍, 最适温度50。最适条件下的酶活力为1685 IU/g

11、，如图三。其测定结果和本实验相似，设置pH范围2.07.0间。由于酶促反应影响因素的复杂与综合性，因此测定结果存在一定偏差。就总体而言纤维素酶最适pH应该在4.55.0（酸性环境下）这个范围。只能得出大概范围值，而非一个准确的值。实验中各个测定结果受个人操作因素影响，使得结果存在误差，为精确结果应在可能情况下：各个pH测定应由同一个人完成，减少差异。 6、实验小结掌握了纤维酶活最适pH的测定方法，了解纤维素酶一般的最适反应pH范围。测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH等。量取液体时精确，如缓冲液、酶液、DNS试剂等。对反应后的实验结果认真仔细观察做好记录。养成科学分析问题的习惯。改进：为精确结果应在可能情况下：各个pH测定应由同一个人完成，减少差异。7实验思考题：纤维素酶的pH耐受性如何测定？ 答：首先在温度选定下测定（如本实验设定为55）出纤维素酶的最适反应pH，本实验已做； 将待测样品液（纤维素酶液和底物混合液）5.5 ml分别放置在pH：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0下保温30min。再将待测样品放置在最适反应pH下，按照本次试验方法测不同pH环境下反应的后的纤维素酶活力。绘制pH相对活力曲线图。8参考文献：1 黄燕华, 冯定远.DNS法测定纤维素酶活性