1043.利用MTT法测定不同浓度顺铂对Hela细胞增殖的抑制效果

1、利用mtt法测定不同浓度顺铂对hela细胞增殖的抑制效果摘要：目的：观察不同浓度顺铂对hela细胞增殖的抑制作用，并探讨出最适合用于抑制hela增殖的浓度梯度。方法：采用mtt比色法对经不同浓度顺铂处理后的hela细胞进行测定，检测不同浓度顺铂对细胞增殖的抑制情况。结果：0.31g/ml浓度的顺铂对hela细胞的增殖主要起到促进作用；17.5g/ml梯度内的顺铂作用不清晰，而7.580g/ml这一浓度梯度内的顺铂则都是起抑制作用，且抑制作用随浓度升高而增强；只是在7.525g/ml这一浓度梯度内，不同浓度顺铂间的抑制作用存在较大差异，而在2580g/ml这一范围内顺铂的抑制作用相差不大。结论：

2、高浓度顺铂对hela细胞的增殖确实有抑制作用，而低浓度顺铂则不然，所以通过归结之后可知，较适合用于抑制hela细胞增殖的顺铂梯度应在1025g/ml之间，可以是10g/ml，15g/ml，20g/ml，25g/ml。关键词：mtt法，顺铂，hela细胞，增殖，抑制mtt全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazo-liumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。mtt比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法；其检测原理是：外源性mtt在哺乳类动物类活细胞线粒体中的琥

3、珀酸脱氢酶的作用下还原为水不溶性的蓝紫色（或蓝色）结晶甲瓒（formazan），并沉积在细胞中；在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比1。二甲基亚砜（dmso）能溶解细胞中的甲瓒，因此用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。而死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入mtt 不会有反应。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。本实验即是利用已知浓度的hela细胞培养后的吸光度生成细胞生长趋势曲线，然后通过该曲线推测出经不同浓度顺铂处理后的已知浓度的hela细胞的增殖情况，从而检测出顺铂对he

4、la细胞增殖的抑制效果，并找出最适的顺铂抑制梯度。1 材料与方法1.1 材料美国进口的hela细胞1.2 方法(1)配置mtt溶液 称取mtt 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（pbs）或无酚红的培养基中，用0.22 m滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4 避光保存(2)稀释细胞 用0.25%胰蛋白酶消化贴壁生长的对数期细胞，用含5%10胎牛血清的培养液将细胞吹打为单细胞悬液，调整细胞浓度约为5105个/ml；取200 l加入1800 l的培养液内，得到浓度约为5104个/ml作为原初浓度的细胞。对原初浓度的细胞进行1：1倍比稀释，分别得到1：2、1：4和1：8的稀释细胞 （细胞浓度约为2.

5、5104个/ml、1.25104个/ml和0.625104个/ml）(3)接种细胞 取上述的各浓度的细胞各200 l，接种到96孔板内；同一浓度的细胞接种4孔作为重复实验。同时，将剩余的各浓度混成未知浓度的细胞，吸取200 l作为待测样品同样加到96孔板的4个孔内(4)再接种 重新调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为23104/ml，在96孔板中，每孔加入细胞悬液200l，使每孔内的细胞数为40006000个，每个浓度至少接种4孔作为重复实验(5)培养与处理细胞 同一般培养条件，梯度浓度组的培养35天；药物处理组的培养24h后，吸出培养液分别加入不同浓度的抗肿瘤药物顺铂各200 l，继续培养(6)呈

6、色 由一开始培养算起，第3天于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5mg/ml的mtt溶液20l，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加dmso 150l，振荡30min，使结晶物充分融解(7)比色 选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果(8)计算与分析 通过excel软件以吸光值为横坐标，接种细胞浓度为纵坐标绘制曲线，生成接种细胞浓度与吸光值间的趋势曲线及其指数方程，根据该方程计算出各种药物处理对细胞增殖率的影响注：本实验还设置调零孔（培养基、mtt、二甲基亚砜）和对照孔（细胞、培养液、mtt、二甲基亚砜）2 结果2.1 hela

7、细胞浓度与吸光值的关系未加药物之前，利用mtt法测得的不同浓度hela细胞与吸光值之间的对应关系如表-1和图-1所示(表中od值均由均值算得)：表-1 不同浓度hela细胞对应的光吸收值细胞浓度500025001250625od4900.4180.1140.0380.015图-1 hela细胞浓度与光吸收值间的趋势曲线2.2 顺铂对hela细胞增殖的抑制作用利用mtt法检测得的不同浓度梯度的顺铂对hela细胞增殖的影响情况如表-27和图-27所示(表中od均是均值，x是由其他组的od值减去空白组的od值得到，y即是各组根据公式y=1580.9e2.2032x算得的细胞浓度)：表-2 0.37.

8、5g/ml的顺铂对hela的影响药物空白组对照组0.3g/ml顺铂1.5g/ml顺铂4.5g/ml顺铂7.5g/ml顺铂od4900.0520.1980.2630.2130.3100.198x0.1460.2110.1610.2580.146y21812518225427912181表-3 115g/ml的顺铂对hela的影响药物空白组对照组1g/ml顺铂5g/ml顺铂10g/ml顺铂15g/ml顺铂od4900.0720.6850.4070.3410.2650.221x0.6130.3350.2690.1930.149y61023307286024192195表-4 1530g/ml的顺铂对

9、hela的影响药物空白组对照组15g/ml顺铂20g/ml顺铂25g/ml顺铂30g/ml顺铂od4900.0760.4660.2070.1740.1480.161x0.3900.1310.0980.0720.085y17111624161316041608表-5 540g/ml的顺铂对hela的影响药物空白组对照组5g/ml顺铂10g/ml顺铂20g/ml顺铂40g/ml顺铂od4900.0710.7600.5610.4660.4300.228x0.6890.4900.3950.3590.157y49513427287526901852表-6 1560g/ml的顺铂对hela的影响药物空白组

10、对照组15g/ml顺铂30g/ml顺铂45g/ml顺铂60g/ml顺铂od4900.0540.2570.1420.1000.0900.075x0.2030.0880.0460.0360.021y24731919175017111656表-7 1080g/ml的顺铂对hela的影响药物空白组对照组10g/ml顺铂20g/ml顺铂40g/ml顺铂80g/ml顺铂od4900.0770.2940.1610.1080.0750.069x0.2170.0840.031-0.002-0.008y25501902169315741553图-2 0.37.5g/ml的顺铂处理后hela的生长情况图-3 115

11、g/ml的顺铂处理后hela的生长情况图-4 1530g/ml的顺铂处理后hela的生长情况图-5 540g/ml的顺铂处理后hela的生长情况图-6 1560g/ml的顺铂处理后hela的生长情况图-7 1080g/ml的顺铂处理后hela的生长情况3 分析(1)0.37.5g/ml的顺铂对hela细胞增殖的影响由表-2和图-2可看出，当顺铂浓度处在0.37.5g/ml之间时，顺铂浓度与hela细胞数之间不成比例关系，而且顺铂对hela细胞的增殖明显不是起到抑制作用，其中显然存在着促进hela细胞增殖的现象。根据公式：细胞增殖抑制率(未加药物处理的对照组吸光值药物处理组的吸光值)/未加药物处

12、理的对照组吸光值，计算得的数据如下表所示：顺铂浓度（g/ml）0.31.54.57.5细胞增殖抑制率-44.52%-10.27%-76.71%0从表中可看到0.3g/ml、1.5g/ml和4.5g/ml的顺铂对应的细胞增殖抑制率都小于0，说明这几个浓度的顺铂对细胞的增殖具有促进作用；而7.5g/ml的顺铂对应的细胞增殖抑制率为0，说明该浓度的顺铂对细胞增殖无影响。这些数据反映的情况跟上述对应的表和图一致，所以明显地，0.37.5g/ml这一梯度范围内的顺铂不抑制hela细胞的增殖。(2) 115g/ml的顺铂对hela细胞增殖的影响由图-3可看到，这一梯度范围内所有点都明显比对照点低很多，而且

13、由其细胞增殖抑制率（如下表所示）也可明显看到数值全为正，所以当顺铂在115g/ml这一浓度梯度内时，其对hela细胞的增殖可起到明显的抑制作用，并且抑制作用与浓度之间呈均匀的正比例关系。顺铂浓度（g/ml）151015细胞增殖抑制率45.35%56.12%68.52%75.69%(3)1530g/ml的顺铂对hela细胞增殖的影响下表显示，在此浓度梯度内的顺铂对细胞的抑制率都为正，即这一范围内的顺铂都能抑制hela细胞的增殖；但由相应数据及图-4可看到，25g/ml和30g/ml的顺铂的抑制作用很接近。顺铂浓度（g/ml）15202530细胞增殖抑制率66.41%74.87%81.54%78.

14、21%(4)540g/ml的顺铂对hela细胞增殖的影响顺铂浓度（g/ml）5102040细胞增殖抑制率28.88%42.67%47.90%77.21%从图-5、表-5和下表都可清楚地看到，经过该梯度内的顺铂处理过的样本孔中，不存在比对照孔还多的活细胞，而且各组计算得到的细胞增殖抑制率都明显为正，且随浓度升高，值增大，所以处在这一梯度浓度范围内的顺铂对hela细胞的增殖也起到了明显的抑制作用。(5)1560g/ml的顺铂对hela细胞增殖的影响对应图表都表明在此梯度范围内的顺铂对hela细胞增值的抑制明显，并由图6可看出，顺铂的抑制作用和它的浓度接近正比例关系，但30g/ml以上的各个浓度之间

15、相差不大。顺铂浓度（g/ml）15304560细胞增殖抑制率56.65%77.34%82.27%89.66%(6)1080g/ml的顺铂对hela细胞增殖的影响由图表及以下数据都可看出，该浓度梯度内的顺铂仍起着抑制hela细胞增殖的作用，并且在40%及以上时呈现出超过百分之百的抑制率，也即是说hela细胞在这两个浓度的顺铂中不但得不到生长和增殖，还有所死亡。顺铂浓度（g/ml）10204080细胞增殖抑制率61.29%85.71%100.92%103.69%4 讨论(1)顺铂对hela细胞增殖的作用机理铂类药物是常用的抗肿瘤药物，在淋巴瘤的根治，乳腺癌的辅助化疗等方案中均占有重要地位。顺铂是铂

16、类药物的原形，是中心以二价铂同两个氯原子和两个氨分子结合的重金属络合物，类似于双功能烷化剂，主要通过与肿瘤细胞dna结合引起内部或dna之间交连和/或dna与蛋白质之间交连，抑制dna的复制，损坏细胞膜结构，从而发挥细胞毒作用2，3，4。但是，由上述分析可知，较低浓度的顺铂反而促进了hela细胞的增殖，这可能是顺铂的水溶液不稳定，在水中容易逐渐转化为无活性的反式异构体并水解所致 5。(2)同一浓度顺铂在不同浓度梯度内抑制率不同的原因从上述的相关图表和数据中可明显地看到，同一浓度（5g/ml，10g/ml，15g/ml，20g/ml，40g/ml）的顺铂在不同梯度内的抑制率存在着明显差异，有的（

17、如5g/ml和20g/ml）甚至是倍数变化，这可能存在着以下三个原因：一是加细胞悬液的过程中，没有每加一孔就摇匀一次，导致胞液的浓度不同而使结果出现误差；二是换液过程中，出现操作上的错误，导致部分细胞被吸走而使部分孔中的细胞减少；三是加药物过程中，药液的量取不精准或加入之时有遗漏，导致药量不足而使计算上出现误差。(3)最适合用于抑制hela细胞增殖的顺铂浓度梯度综合以上的分析可总结出：在低浓度(0.31g/ml)范围内的顺铂对hela细胞的增殖是起到促进作用，在17.5g/ml梯度内的顺铂作用不清晰，而在7.580g/ml这一浓度梯度内的顺铂则都是起抑制作用，且抑制作用随浓度升高而增强；只是在

18、7.525g/ml这一浓度梯度内，不同浓度顺铂间的抑制作用存在较大差异，而在2580g/ml这一范围内顺铂的抑制作用相差不大。由于各组梯度之间存在着较大的重叠区域，并且在这些重叠区里同一浓度的抑制率存在明显差异，也因为某些浓度之间确实抑制效果不会有多大变化，所以，为了能够保证更好更稳定的作用，选用处于1025g/ml之间的顺铂梯度对hela细胞进行增殖抑制较适合；具体浓度梯度可以是10g/ml，15g/ml，20g/ml，25g/ml，因为从上述图表中可看出这几个浓度对hela细胞增殖的抑制效果存在着较自然的随浓度递增而增强的线性比例关系。5 参考文献1彭勤，彭惠，骆云鹏，汤为学.mtt比色法

19、测定药物对hela细胞作用的实验研究eb/ol. 2杨阳，刘宝瑞，钱晓萍.顺铂联合热疗抑制人肝癌细胞smmc-7721体外增殖作用的研究j.实用临床医药杂志，2006，10(3):8113 45inhibition effect of different concentrations of cisplatin on the hela cell proliferation determined by mtt methodabstract: objective: to observe the inhibition effect of different concentrations of cisp

20、latin on the hela cells, and to explore the most suitable concentration gradient for inhibiting the proliferation of hela. methods: mtt colorimetric assay for hela cells treated with different concentrations of cisplatin was determined to detect the inhibition situation of different concentrations o

21、f cisplatin on cell proliferation. results: cisplatin within the concentration gradient 0.3g/ml to 1.0g/ml had promotion on cell proliferation; those within 17.5g/ml had no clear effect; others , within the concentration gradient 7.5g/ml to 80g/ml, played a role in inhibiting the hela cell proliferation ,and