广东省自然科学基金项目cMaf调控IL4参与多发性硬化发病的分子机制研究申请书

1、顺 序 号类 别a申报学科代 码 1h0906广东省自然科学基金项目自由申请申 请 书项 目 名 称： c-maf调控il-4参与多发性硬化发病的分子机制研究申 请 者：高聪所 在 单 位： 广州医学院第二附属医院神经科学研究所邮 政 编 码： 510260通 讯 地 址： 广州市海珠区昌岗东路250号申请者电话： 真： 电 子 邮 件：smilegaocong申 请 日 期： 2010-3-2广 东 省 自 然 科 学 基 金 管 理 委 员 会 二八 年 制填 报 说 明 一、填写申请书前 ，请先查阅广东省自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内容 ，应实

2、事求是，逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达 。第一次出现的缩写词 ，须注出全称。二、申请书第三页起各栏空格不够时，请自行加页 。 三、封面右上角“顺序号”暂不用填写；“项目类别”栏由申请者填写, 申请“省自然科学基金自由申请项目”此栏为“a”, “省自然科学基金重点项目”为“b”。一、简表研究项目情况名称c-maf调控il-4参与多发性硬化发病的分子机制研究类别a. 自由申请项目研究类型a. 基础研究b. 重点项目ab. 应用基础研究b申报学科名称1神经免疫疾病代码1h0907名称2代码2申请金额10万元研究期限2011年1月至2012年12月所用实验室

3、实验室全称广州医学院神经科学研究所实验室类别a. 国家重点b. 部门开放实验室编号c. 省重点实验室c申请者情况姓名高聪性别a. 男身份号族名称汉b. 女b代码01专业技术职务名称教授学位a.博士b.硕士c.学士最终学位授予国国(地区)名中国其他身份a. 院士b. 博士生导师c. 在站博士后d. 留学回国人员代码011c代码86所在单位全称广州医学院第二附属医院系(所)及科室神经科学研究所神经内科项目组情况主要成员（不含申请者）姓名身份证号码专业技术职务所在单位全称及代码项目中的分工签章梁师广州医学院 510182

4、01纳米材料的合成周智师广州医学院 51018201细胞学实验蒲蜀任医师广州医学院 51018201免疫组化袁师广州医学院 51018201基因转染张师广州医学院 51018201动物模型建立侯清师广州医学院 51018201文章撰写谭丽管技师广州医学院 51018201统计分析林美士生广州医学院 51018201病理

5、学实验占婷士生广州医学院 51018201分子生物学实验人员统计总人数高级中级初级在站博士后在读博士生在读硕士生参加单位数1025121研 究 内 容 和 意 义摘 要我们最新的研究发现c-maf在多发性硬化（ms）病人中表达降低，提示其与ms发病相关；同时发现il-4的表达也降低，提示我们il-4和c-maf同时参与ms发病。c-maf具有转录因子的作用，可以控制下游基因的转录，从而发挥其功能，但c-maf参与ms发病的具体分子机制并不十分明确。本项目在前期研究和文献挖掘的基础上，推测c-maf通过去甲基化组蛋白调控il-4与ms发病。为了验证这一假设

6、，我们一方面检测il-4和c-maf在ms血液和脑脊液中的相关性表达及其表达失调对多发性硬化发展的影响，另一方面证实c-maf通过组蛋白去甲基化修饰促进il-4转录从而增加该基因表达。c-maf表达降低导致il-4的表达也降低，从而导致ms发病。本项目如获成功，不但为多发性硬化发生机理提供新的理论依据，还将为寻找多发性硬化的分子标志物和基因治疗的新靶点提供实验依据。主题词（主题词应反映研究内容，主题词数量不多于三个，各主题词之间以逗号分隔）多发性硬化，c-maf，il-4，简 表 填 写 要 求一、简表内容必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码，以国家自然科学基金规定的代

7、码为准填写。二、凡选择性栏目，将相应提示符、等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称应确切反映研究内容和范围，最多不超过个汉字（包括标点符号）。基础研究指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。应用基础研究指有广泛应用前景,但以获取新原理、新知识、新方法为主要目的的研究。申报学科申请项目所属的最基础学科。 如涉及多学科可填写两个，先填写主学科。申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示。研究期限研究期限一般从申请的次年月算起。终止时间为完成年度的月。所用实验室系指研究项目将利用的实验室。留学回国人员指在国外取得学位或访问学者一年以上的回国人员。所在单位名称及

8、代码按单位公章填写全称。首次申请广东省自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码应向广东省自然科学基金管理委员会办公室申请后填写。参加单位数指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿拉伯数字表示。项目组主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。 24 二、立论依据请按以下提纲填写：1、研究意义（对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用前景）2、国内外研究现状3、本项目的创新之处4、主要

9、参考文献及出处（格式：论文作者题目刊名年份卷(期)页码专著作者书名出版者年份）1、研究意义多发性硬化（multiple sclerosis，ms）是一种中枢神经系统炎症性脱髓鞘性疾病，其特征表现为脱髓鞘、局部t细胞和巨噬细胞浸润、轴突损害及神经功能丧失，迄今尚未明确其病因和发病机制，也尚无公认的根治性措施，因此，全面解析多发性硬化发病的分子机制，积极寻求切实有效且安全可靠的治疗新途径，是有效控制多发性硬化从而提高患者生存质量的关键1。关于多发性硬化的发病机制，最初的研究提示其与病毒等（外因）通过感染易感个体（内因）启动其自身免疫应答有关。目前，已能在基因(microrna等)、蛋白和分泌的细胞

10、水平测定细胞因子，了解病灶的细胞、蛋白和mrna水平变化，这将有助于进一步了解多发性硬化发病机制和处于疾病哪一阶段2。2、国内外研究现状随着对分子生物学的深入研究和生物技术的飞速发展，在各种基因工程细胞因子、分子靶向类药物和治疗性抗体通过美国fda认证成功上市，并应用于临床后，基因治疗再次成为万众瞩目的焦点。近三年来，基于多发性硬化的基因治疗研究层出不穷3。为了探寻多发性硬化的发病机理，项目申请人所在的研究团队一直致力于筛选并鉴定调控多发性硬化发病的关键基因。在前期研究中，通过基因芯片技术筛选出多个与多发性硬化发病密切相关的候选基因。我们发现在15例多发性硬化病人的血液和脑脊液pbmc中c-m

11、af mrna和蛋白水平的表达下降，该结果提示我们c-maf可能在多发性硬化的发病机制中发挥重要作用。为此，我们首次针对c-maf在多发性硬化中的表达和功能进行了一部分预实验，结果表明利用sirna干扰c-maf的表达后，免疫细胞因子il-4的表达水平显著下降，提示我们c-maf的表达失调参与了多发性硬化的发病，但c-maf的下游基因是什么？又通过何种机制参与多发性硬化发病？还知之甚少。此外，经文献检索未发现有关c-maf在多发性硬化中的表达特性和功能研究的相关报道。由于c-maf的作用方式主要是通过cpg岛去甲基化修饰，激活下游基因启动子从而实现基因转录，因此，为了进一步明确c-maf参与多

12、发性硬化发病的分子机制，我们希望找到c-maf直接调控的下游基因。在挖掘文献的过程中，细胞因子白介素-4（interleukin-4, il-4）吸引了我们的注意力4。转录因子c-maf属于巨噬细胞激活因子（macrophage-activating factor，maf）家族，此家族成员均拥有高度保守的氨基端激活域和羧基端碱性亮氨酸拉链dna结合域(extended homology region，ehr)，ehr结合dna上的maf-识别序列(maf-recognition elements，mares) 后造成下游基因启动子区cpg岛去甲基化，也可能通过改变染色质结构促进转录因子与启动子

13、区结合，最终实现靶基因的转录5。c-maf是最早被克隆的th2特异性转录因子，仅特异性地表达于th2细胞，而不表达于th1细胞6。c-maf缺陷小鼠cd4+t细胞il-4的合成障碍，而il-5、il-10、il-13的合成不受影响。而且将c-maf异位表达于th1细胞克隆、b细胞甚至非淋巴细胞时，c-maf能反式激活il-4启动子，使il-4在这些细胞中表达，增加血清中igg1和ige含量。因而推测c-maf决定着il-4在th2细胞中的特异性表达4。但另一些研究资料显示这种调控作用较原先想象的更为复杂：虽然将c-maf转染至正在向th1分化的幼稚t细胞能引起il-4表达，但将它转染至已完全分

14、化为th1的成熟t细胞时，却未见il-4表达，但此时ifn-的表达却受到抑制。因此推测c-maf并不是仅特异性作用于il-4基因，它还可能作用于其他靶基因如ifn-等7。以往认为，c-maf激活后不影响其他th2型细胞因子的表达，只是通过选择性地与il-4近侧启动子结合，诱导il-4表达促使th2分化8。最近的研究发现，c-maf亦可通过il-2r（cd25）介导但不依赖il-4的途径促使th2分化9。th1/th2极化是免疫应答调节中的关键环节，th1/th2平衡失调是许多疾病的分子免疫基础，因而th1/th2极化已成目研究的新热点10。在th细胞分化过程中，细胞因子被认为是最重要的因素。抗

15、原刺激机体时，th细胞所在局部微环境中的细胞因子类型是影响th1/th2极化的关键因素。il-12、ifn-、il-2等i型细胞因子促使th0向th1分化，并抑制th2细胞分化；而il-4、il-10、il-5、il-6等ii型细胞因子则促使th0向th2分化，同时也抑制th1细胞增殖11。抗原刺激机体时，th细胞所在局部微环境中的细胞因子类型是影响th1/th2极化的关键因素12。il-4是促进th0向th2分化的核心因素，也是th1分化的强烈抑制物，因此它也可能参与了th1占优势的多发性硬化的发病13。il-4基因定位于11号染色体。在il-4基因位点处发现了与th2分化相关的几个dna酶

16、1高敏感位点，提示th2分化时往往伴有il-4基因启动子的去甲基化14。il-4有二种受体：一种包含il-4r和，信号转导通过激活jak1和jak3；另一种包含il-4r和il-13r，通过激活jak1、jak2和tyk2起到信号转导的作用。il-4与其中任何一种受体结合都能激活stat6。il-4主要通过活化stat6蛋白促进th2分化，stat6基因敲除的小鼠则th2细胞分化受损，而这些小鼠也会表现出多发性硬化的临床特征15。受此启发，结合il-4在多发性硬化中的表达特性，我们推测在多发性硬化发病中低表达的c-maf可以使il-4启动子区的组蛋白去甲基化修饰减少，不能通过改变染色质结构来促

17、进转录因子与其结合，也不能引起该基因启动子区cpg岛去甲基化，最终导致il-4在多发性硬化的表达降低，使得th1/th2极化异常，易于产生自身免疫性疾病。3、本项目的创新之处本项目拟在前期工作和预实验的基础上，提出如下研究假说：在多发性硬化中c-maf的表达降低，低表达的c-maf很难与其他效应分子组成ehr复合体，在mares的参与下，使il-4启动子区的组蛋白去甲基化，因此无法进一步改变染色质结构或引起启动子区cpg岛去甲基化，从而抑制该基因转录，低表达的il-4造成th1/th2极化异常，从而导致多发性硬化发病。因此我们拟通过本项研究，阐明c-maf去甲基化组蛋白调控il-4参与多发性硬

18、化发病的分子机制，为多发性硬化的发生机理提供新的理论依据，为寻找多发性硬化基因治疗的新靶点提供实验依据。参考文献1klauer t, zettl uk: compliance, adherence, and the treatment of multiple sclerosis. j neurol 2008;255 suppl 6:87-92.2korn t: pathophysiology of multiple sclerosis. j neurol 2008;255 suppl 6:2-6.3ji j, shi j, budhu a, yu z, forgues m, roessler

19、s, ambs s, chen y, meltzer ps, croce cm, qin lx, man k, lo cm, lee j, ng io, fan j, tang zy, sun hc, wang xw: microrna expression, survival, and response to interferon in liver cancer. n engl j med 2009;361:1437-1447.4kang h, choi tw, ahn ks, lee jy, ham ih, choi hy, shim es, sohn nw: upregulation o

20、f interferon-gamma and interleukin-4, th cell-derived cytokines by so-shi-ho-tang (sho-saiko-to) occurs at the level of antigen presenting cells, but not cd4 t cells. j ethnopharmacol 2009;123:6-14.5natkunam y, tedoldi s, paterson jc, zhao s, rodriguez-justo m, beck ah, siebert r, mason dy, marafiot

21、i t: characterization of c-maf transcription factor in normal and neoplastic hematolymphoid tissue and its relevance in plasma cell neoplasia. am j clin pathol 2009;132:361-371.6hiramatsu y, suto a, kashiwakuma d, kanari h, kagami si, ikeda k, hirose k, watanabe n, grusby mj, iwamoto i, nakajima h:

22、c-maf activates the promoter and enhancer of the il-21 gene, and tgf-beta inhibits c-maf-induced il-21 production in cd4+ t cells. journal of leukocyte biology 20097ogawa k, funaba m, chen y, tsujimoto m: activin a functions as a th2 cytokine in the promotion of the alternative activation of macroph

23、ages. j immunol 2006;177:6787-6794.8leavenworth jw, ma x, mo yy, pauza me: sumo conjugation contributes to immune deviation in nonobese diabetic mice by suppressing c-maf transactivation of il-4. j immunol 2009;183:1110-1119.9sasaki y, ohtani t, ito y, mizuashi m, nakagawa s, furukawa t, horii a, ai

24、ba s: molecular events in human t cells treated with diesel exhaust particles or formaldehyde that underlie their diminished interferon-gamma and interleukin-10 production. int arch allergy immunol 2009;148:239-250.10mariotti s, sargentini v, marcantonio c, todero e, teloni r, gagliardi mc, ciccagli

25、one ar, nisini r: t-cell-mediated and antigen-dependent differentiation of human monocyte into different dendritic cell subsets: a feedback control of th1/th2 responses. faseb j 2008;22:3370-3379.11fenton a, lamb t, graham al: optimality analysis of th1/th2 immune responses during microparasite-macr

26、oparasite co-infection, with epidemiological feedbacks. parasitology 2008;135:841-853.12de mello lm, bechara mi, sole d, rodrigues v: th1/th2 balance in concomitant immediate and delayed-type hypersensitivity diseases. immunol lett 2009;124:88-94.13leng j, yao h, shen j, wang k, zhuo g, wang z: co-e

27、xpression of il-18 binding protein and il-4 regulates th1/th2 cytokine response in murine collagen-induced arthritis. acta biochim biophys sin (shanghai) 2008;40:116-124.14noble a, thomas mj, kemeny dm: early th1/th2 cell polarization in the absence of il-4 and il-12: t cell receptor signaling regul

28、ates the response to cytokines in cd4 and cd8 t cells. eur j immunol 2001;31:2227-2235.15nan cl, lei zl, zhao zj, shi lh, ouyang yc, song xf, sun qy, chen dy: increased th1/th2 (ifn-gamma/il-4) cytokine mrna ratio of rat embryos in the pregnant mouse uterus. j reprod dev 2007;53:219-228.三、研究方案. 研究目标

29、、研究内容和拟解决的关键问题1.1 研究目标：（1）明确c-maf和il-4在多发性硬化中的表达特性及其表达失调对多发性硬化发病的影响。（2）阐明c-maf通过组蛋白去甲基化调控il-4表达参与多发性硬化发病的分子机制。1.2 研究内容：（1）明确c-maf和il-4在多发性硬化病人的血液和脑脊液pbmc中的表达特性采用荧光定量rt-pcr、western blot以及免疫荧光双标法检测多发性硬化病人的血液和脑脊液pbmc中c-maf和il-4的表达特性，分析两者在正常与ms免疫细胞中的相关性表达。同时，检测pbmc中il-4启动子区cpg岛的去甲基化程度以及与多发性硬化的相关性。（2）探讨c

30、-maf和il-4表达失调对多发性硬化发病的影响分别通过过表达和rna干扰改变c-maf和il-4表达水平，观察其对多发性硬化pbmc细胞活力和免疫特性的影响。（3）检测c-maf对il-4启动子区组蛋白去甲基化和cpg岛去甲基化的影响建立稳定过表达c-maf的鼻咽癌细胞株，首先通过荧光素酶报告基因检测c-maf能否抑制il-4的转录，然后通过免疫共沉淀检测c-maf、ehr和mares是否存在相互作用形成复合体，接着利用染色质免疫共沉淀（chromatin immunoprecipitation, chip）检测c-maf、ehr和mares与il-4启动子区结合以及组蛋白发生去甲基化反应，

31、最后采用亚硫酸氢盐修饰后测序法（bisulfite genomic sequencing pcr, bsp）检测il-4启动子区cpg岛的甲基化，明确c-maf通过招募一系列效应蛋白形成复合体使il-4启动子区的组蛋白甲基化，以进一步明确组蛋白去甲基化是否引起il-4启动子区cpg岛去甲基化，从而揭示多发性硬化中il-4基因表达受抑制的分子机理。1.3 拟解决的关键科学问题：问题一：如何鉴定c-maf和il-4在多发性硬化中呈相关性表达是阐明c-maf调控il-4参与多发性硬化发病分子机制的前提。本项目一方面将通过荧光定量rt-pcr和western blot检测血液和脑脊液pbmc中两者的表

32、达水平，通过统计学分析证实其相关性表达，另一方面将通过免疫荧光双标记法分别标记c-maf和il-4，将pbmc爬片进行激光共聚焦扫描，进行精确的定位定量分析，从形态学上直接证实两者的相关性表达。问题二：如何证实c-maf通过招募其他效应蛋白组成复合体引起il-4启动子区组蛋白甲基化从而抑制转录的？本项目将利用荧光素酶报告基因实验直接证实c-maf对il-4的转录抑制作用，然后通过免疫共沉淀、chip以及检测甲基化的相应实验方法，明确c-maf、ehr和mares是否与il-4启动子区结合以及组蛋白是否发生去甲基化反应，并检测该组蛋白修饰是否引起il-4启动子区cpg岛去甲基化从而导致转录抑制。

33、. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析2.1 拟采取的研究方案：（1）明确c-maf和il-4在多发性硬化病人的血液、脑脊液及pbmc细胞株中的相关性表达（部分已完成） 检索我们的ms患者资料库，选取确诊为多发性硬化病人的血液和脑脊液标本60例；收集正常人血液和脑脊液标本60例。 细胞培养：体外培养人和大鼠外周血单个核细胞（pbmc）株。 抽提两种细胞株及多发性硬化病人血液和脑脊液标本的小分子rna、总rna和总蛋白，通过荧光定量rt-qpcr 和western blot分别检测c-maf和il-4在多发性硬化病人的血液和脑脊液中的表达差异。采用免疫荧光双标技术和激光共聚焦显微镜

34、扫描成像技术观察pbmc中c-maf和il-4的共定位情况。实验按常规方法进行，具体步骤如下：已固定的pbmc细胞爬片经血清封闭后，使用mouse anti- il-4 antibody（sc-28361）和rabbit anti-c-maf antibody（sc-7866）同时进行一抗孵育，pbs缓冲液洗片后用不同标记的二抗即alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody（cat#cst4413）和alexa fluor 555-conjugated anti-mouse antibody（cat#cst4408）同时孵育，充分洗片后封片观察

35、，应用激光共聚焦显微镜扫描成像。统计学分析c-maf和il-4在正常人与ms患者多发性硬化病人的血液、脑脊液及pbmc细胞株中的相关性表达。 抽提pbmc基因组dna，亚硫酸氢钠修饰后进行纯化回收，根据文献报道设计il-4启动子区引物进行pcr扩增，随后将pcr产物与t载体连接、转化和蓝白斑筛选，然后挑克隆送测序，根据测序结果判断pbmc中il-4启动子区cpg岛是否发生去甲基化，并结合标本对应的临床资料，分析该基因异常甲基化与多发性硬化的相关性。（2）探讨c-maf和il-4表达失调对多发性硬化发病的影响 利用美国invitrogen公司网站设计软件在线设计并合成针对鼠源性c-maf和il-

36、4基因的小干扰rna（sirna），同时合成阳性对照和阴性对照。 查询genbank数据库获得c-maf和il-4的cds区全长，分别设计上、下游引物，上、下游引物5端分别引入kpn i和ecor i限制性内切酶位点，以正常人基因组dna为模板进行pcr扩增，扩增产物经t-a克隆和测序证实后，通过kpn i和ecor i酶切位点定向克隆到pcdna4真核细胞表达载体，然后对重组质粒pcdna4/c-maf和pcdna4/ il-4进行双酶切和测序鉴定。 将c-maf sirna和pcdna4/c-maf利用靶向纳米材料分别转染pbmc细胞株，经rt-pcr和western blot检测c-ma

37、f表达变化，同时检测c-maf的表达改变对il-4表达的影响，观察两者是否成正相关。 将il-4 sirna和pcdna4/ il-4分别转染pbmc细胞株，观察il-4表达改变对免疫相关细胞因子（如il-12、ifn-和il-2及il-10、il-5和il-6）分泌的影响。（3）证实c-maf通过引起il-4启动子去甲基化启动该基因的转录 pcr扩增il-4基因上游1.4kb区域的基因组序列，克隆到pgl3荧光素酶报告基因载体，重组质粒经鉴定正确后，转染pbmc/c-maf细胞株，通过检测荧光素酶活性的改变，证实c-maf与il-4启动子区结合且发挥转录启动作用。 按照免疫共沉淀试剂盒说明书

38、操作，进行免疫共沉淀实验，即采用ripa buffer温和裂解pbmc/c-maf细胞，抽提蛋白后进行定量，向稀释后的总蛋白中加入c-maf抗体，将抗原抗体复合物进行孵育，然后利用试剂盒的aminolink plus coupling resin捕捉抗原抗体复合物，将沉淀下来的蛋白复合体进行western blot，通过c-maf、ehr和mares的相应抗体检测三者之间是否存在相互作用。 按照试剂盒说明书操作，进行chip实验，即用甲醛处理pbmc/c-maf细胞使蛋白和dna发生交联，交联后的染色质采用超声剪切法，产生较小的dna片段，并预先纯化以降低非特异性免疫沉淀，随后用c-maf、e

39、hr和mares抗体分别进行免疫沉淀。采用protein a/g plus agarose琼脂糖树脂洗脱蛋白-dna复合物，加热样品取消交联，纯化出dna片段，然后进行pcr扩增分析，检测c-maf、ehr和mares是否均与il-4启动子区结合以及启动子区组蛋白是否发生去甲基化修饰。 采用bsp法检测il-4启动子区cpg岛是否发生去甲基化修饰，具体步骤如下：抽取pbmc/c-maf基因组dna，采用亚硫酸氢钠修饰基因组dna，然后将修饰后的dna进行纯化回收，根据文献报道设计引物进行pcr扩增，随后将pcr产物与t载体连接、转化和蓝白斑筛选，然后挑克隆送测序，根据测序结果判断cpg岛是否发

40、生甲基化。 分别采用dna甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza-cdr）和hdac抑制剂saha处理稳定过表达c-maf的pbmc/c-maf，然后检测c-maf mrna和蛋白水平的表达是否发生改变，进一步验证c-maf能否通过dna去甲基化促进il-4的表达。（4）统计学方法数据拟采用spss17.0软件进行统计处理，计量资料采用表示，计数资料采用百分率表示，分别采用t检验、方差分析比较均值间的差异，计数资料则采用卡方检验。两变量间的相关性采用直线相关和回归评价，多变量间的相关性关系采用逐步多元回归和cox回归进行处理。p0.05为显著性差异。2.2 技术路线：检测c-maf

41、和il-4在ms病人的血液和脑脊液中的相关性表达在pbmc细胞中过表达和干扰c-maf在pbmc细胞中过表达和干扰il-4c-maf通过组蛋白去甲基化调控il-4参与ms发病c-maf对il-4的转录启动ehr与il-4启动子结合c-maf、ehr和mares形成复合体il-4启动子去甲基化观察c-maf和il-4表达失调对多发性硬化发病的影响荧光素酶报告基因免疫共沉淀chip直接测序法rt-qpcr和western blot检测c-maf和il-4表达2.3 可行性分析：（1）坚实的理论基础前期实验结果已明确表明c-maf在ms患者血液和脑脊液pbmc中低表达，提示c-maf参与ms发病的分

42、子机制。结合前期研究基础，本项目提出c-maf通过调控il-4表达参与ms发病的分子机制，并拟进行实验验证，立论依据充分，理论上切实可行。（2）成熟的技术平台本项目已具备良好的前期研究基础，课题所使用的关键技术如rna干扰、靶向纳米材料的制备和表达质粒的构建以及eae动物模型建立等均已建立了成熟的技术平台，为本课题的完成提供了技术保障。由于地处大城市，申请人所在科室每年诊疗大量多发性硬化患者，课题组已积累了多发性硬化病人和正常人血和脑脊液样本上百例，并保存了完整的病例资料，完全可以满足课题需要。此外，实验所需pbmc细胞株、质粒和实验动物等本实验室均已具备，主要试剂和试剂盒均已商品化。 （3）

43、完善的实验室条件本课题是一跨学科的研究，将以广州医学院第二附属医院和中山大学化学与化工学院为平台完成整个实验过程。本课题组所在实验室是广东省重点实验室及省部共建教育部重点实验室。本实验室拥有分子生物学实验操作所需的所有仪器设备。工作人员有从事分子生物学实验的技术人员，还配有细胞培养及神经元培养的专门实验室及技术员。另外，还备有激光共聚焦显微镜、生物发光仪、电穿孔系统和脑立体定向仪等重要仪器设备。因此，本项目实施所需的实验条件完全具备，仅需补充试剂等消耗性用品及购买部分仪器配件及耗材。（4）有实力的研究队伍申请人承担并参与过多项国家及省部级课题，大部分课题已顺利结题，具备丰富的组织项目和实施工作

44、的经验。其中梁兵博士曾在香港中文大学进行基因治疗研究，在分子生物学、细胞生物学及基因治疗方面均经过严格的科研训练，参与过国家和省级相关研究课题，发表与本课题相关sci收录文章2篇，影响因子达9.3分以上。课题组人员结构安排合理，所有成员均接受过正规的科研培训，具备良好的分子生物学、细胞生物学、实验动物学和组织病理学等与本研究密切相关的基础理论和技术，有信心有能力保证本课题的顺利完成。c-maf对il-4的转录启动ehr与il-4启动子结合c-maf、ehr和mares形成复合体il-4启动子去甲基化直接测序法免疫共沉淀3. 年度研究计划及预期进展3.1 年度研究计划2011.12011.6检测

45、c-maf和il-4在多发性硬化中的表达特性2011.72012.12研究c-maf和il-4表达失调对多发性硬化发病的影响2012.42012.9明确c-maf通过去甲基化组蛋白促进il-4转录2012.102012.12整理数据，撰写论文3.2 预期进展（1）阐明c-maf通过去甲基化组蛋白调控il-4参与多发性硬化发病的分子机制，为多发性硬化发生机理提供新的理论依据。（2）在国内外重要学术刊物上发表高水平科研论文3-4篇，其中sci论文1-2篇。四、研究条件与基础. 已取得的研究工作成绩及与本项目有关的研究工作积累（对于自由申请项目，请着重填写申请人近期的主要工作业绩；对于重点项目，请着

46、重填写本课题组与本项目相关的研究工作积累和近五年的主要研究业绩）1.1 工作基础：（1）申请人简介：申请人高聪，教授，主任医师，硕士研究生导师。1982年毕业于中山医科大学，毕业后一直在广州医学院第二附属医院神经内科从事临床、教学与科研工作，从事脑血管病和神经免疫疾病的临床诊治与研究多年，特别是在多发性硬化的临床诊治和研究中有很深的造诣。1996年开始至今一直担任神经内科行政副主任，现任中华医学会广州疼痛分会副主委，中华医学会广东神经免疫学组副组长。近十余年来高聪教授长期从事多发性硬化的临床与实验系列研究，共承担、参与了省市级多个有关多发性硬化的科研课题，在省级、国家级核心期刊发表相关论文20

47、多篇。近年来，mirna成为研究关注的焦点，该课题组在申请人的领导下与时俱进，建立了纳米材料介导的基因表达和基因沉默技术平台，致力于多发性硬化发病机制的研究，试图为多发性硬化的诊断、分型、转归及预后判断寻找新的分子标志物，为多发性硬化的生物治疗提供新的有效手段。目前已有多篇相关英文文章正在撰写和投稿审阅中，有望近期发表。主要成果和获奖申请人于2006年10月获广州市科学技术奖励二等奖，项目名称：“神经肽y对心血管重构的影响、相关机理以及药物干预系列研究”；2007年7月获广东省科学技术奖励二等奖，项目名称：“神经肽y对心血管重构的影响、相关机理以及药物干预系列研究”。近年部分论文（*为通讯作者

48、）：1、shijie liang, fuhua xie, tengfei ou, jieyang, xinfeng, cong gao*. y-39983, a selective rho-kinase inhibitor, attenunates experimental autoimmune encephalomyelitis via inhibition of demyelination. （toxicology and applied pharmacology，impact factor：3.364，in press）.2、bing liang, fang yuan, xiaodong

49、 cai, ling long, ying peng, cong gao*. tumor-targeted nonviral vector folate-peg -pei mediated combined antitumor effects of cytosine deaminase and trail genes in vitro. （brain research, in reviewing）.3、高聪*，郑建筝，谢富华。小胶质细胞活化在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用机制。中国神经免疫学和神经病学杂志，2008；15(2)：9296。4、高聪*，谢富华，殷建瑞，杨洁，冯欣，马鹏程。nf-

50、bp65及环氧化酶2在实验性变态反应性脑脊髓炎中的表达及其作用机制。中华神经医学杂志，2008；11(2)：11471150。5、高聪*，谢富华，区腾飞。地黄合剂在多发性硬化患者中抗炎性反应及调节免疫平衡机制探讨。中华神经医学杂志，2008；7(9)：923927。6、高聪*，郑健筝，区腾飞。阿托伐他汀在实验性变态反应性脑脊髓炎中的作用机制研究。实用医学杂志，2008；24(1)：20 23。7、高聪*，杨洁，区腾飞。吲哚美辛对实验性变态反应性脑脊髓炎模型干预研究。实用诊断与治疗杂志，2008；04：246248。8、高聪*，谢富华，区腾飞，杨宁，高敏。地黄合剂对多发性硬化的作用及其作用靶点的

51、研究。实用诊断与治疗杂志，2007；05：323325。2项目组主要成员：1）梁兵博士：1978年出生，2008年6月于中山大学博士毕业，专业为神经病学。20022005年在青岛医学院攻读硕士学位期间研究方向为神经免疫疾病的临床与基础研究。20052008年攻读博士学位期间研究方向为纳米材料介导的基因治疗。自2005年开始一直运用纳米材料作为基因转移的有效载体，开展应用基因的治疗研究，并于2006年-2007年在香港中文大学进行基因治疗研究，在分子生物学、细胞生物学及基因治疗方面均经过严格的科研训练，已发表与本课题相关sci收录文章2篇，影响因子达9.3分以上。近期已发表与本项目有关的主要论著

52、目录（*为第一作者）：1、bing liang*, fang yuan, xiaodong cai, ling long, ying peng, cong gao. tumor-targeted nonviral vector folate-peg -pei mediated combined antitumor effects of cytosine deaminase and trail genes in vitro. brain research, in reviewing.2、bing liang*, xin-tao shuai, chu-yan chan, yang-chao che

53、n, yi li, xiang-ping li, dexian zheng, marie c lin, hsiang-fu kung, ming-liang he, ying peng. the use of folate-peg-grafted-hybranched-pei nonviral vector for the inhibition of glioma growth in the rat. biomaterials, 2009 (30): 40144020.（biomaterials: impact factor: 6.646.）3、b. liang*, m.l. he, z.p.

54、 xiao, y. li, c.y. chan, h.f. kung, x.t. shuai, y. peng. synthesis and characterization of folate-peg-grafted-hyperbranched-pei for tumor-targeted gene delivery, biochem biophys res commun , 2008（367）: 874-880. (bbrc: impact factor：2.749.)4、李艺，彭英，梁兵，廖奕佶，龙玲。饮酒法建立胎儿酒精中毒综合征大鼠模型。中国生育健康杂志，2007；18（6）：3573

55、59。5、梁兵*，肖中鹏，李艺，孔祥复，帅心涛，彭英。新型靶向纳米材料介导基因治疗胶质瘤的体外研究。重庆医科大学学报，2008；33(z1)：1419。2）张斌博士，一直从事多发性硬化的研究，从神经免疫，神经影像，神经遗传等多个方面开展研究，已经发表sci收录文章三篇（影响因子分别为3.26、1.62、1.62），在多发性硬化及神经免疫研究方面积累了丰富的经验。近年部分论文（*为第一作者）：1. bin zhang*, ying jiang, yu yang, fuhua peng, xueqiang hu. correlation between seurm thyroxine and co

56、mplements in patients with multiple sclerosis and neuromyelitis optica. neuroendocrinology letters 2008; 29(2),256-260 (第一作者, 影响因子1.62, sci收录).2. fuhua peng, bin zhang*, xiufeng zhong, jin li, guihong xu, xueqiang hu,wei qiu and zhong pei. serum uric acid levels of patients with multiple sclerosis and other neurological diseases. multiple sclerosis 2008; 14: 188196 (共同第一作者, 影响因子3.26, sci收录).3. ying jiang, yu yang, bin zhang, fuhua peng, jian bao, xue