尼古丁在新生大鼠耳蜗毒性机制及17-DMAG的保护作用

1、尼古丁在新生大鼠耳蜗毒性机制及17-DMAG勺保护作用第一局部：SD大鼠乳鼠耳蜗器官体外培养技术目的：探讨内耳器官培养技 术使毛细胞、螺旋神经元及听神经纤维在体外培养环境维持完整形态 , 为进一步 开展药物的耳毒性及其保护性研究奠定了实验技术的根底。方法：选用 Sprague Dawley大鼠2-3天的新生乳鼠,解剖显微镜下解剖别离前庭器官膜、外侧壁、基 底膜。将基底膜分成三段 , 顶、中、底回三个节段 , 利用培养基的液体外表张力铺放 将基底膜和前庭器官等各个器官 , 平整向上平整铺放在培养皿外表 , 培养 48 小时 后观察基底膜形态并计数毛细胞数量。 结果：前庭毛细胞和耳蜗毛细胞静纤毛整

2、 齐排列 , 无紊乱 , 前庭毛细胞排列整齐无缺失 , 基底膜三个节段的三排外毛细胞和 一排内毛细胞沿柯替氏器螺旋器 (OC, Organ of Corti) 整齐排列 , 无缺失。螺旋神经结细胞排列密集 ,呈椭圆形,细胞体积大,胞核清晰,听神经纤维排 列整齐 , 无断裂。结论：运用液体外表张力贴壁方法 , 可以在体外环境下获得观察 方便、形态结构完整的的耳蜗器官和组织。第二局部： 尼古丁对新生大鼠体外培养基底膜的毒性作用目的： 建立尼古丁 耳毒性的体外培养损伤模型 , 探讨尼古丁在耳蜗毛细胞、螺旋神经结细胞和神经 纤维及的毒性作用及剂量反响关系。 方法：别离培养2-3天SD大鼠耳蜗基底膜，

3、按照不同作用浓度 (0-100ng/ml) 处理尼古丁 24 小时。对耳蜗毛细胞和螺旋神经结及听神经纤维丝采用免疫荧光染色进行观测 , 分 别对毛细胞 , 螺旋神经纤维和神经元计数。对毛细胞、支持细胞及毛细胞静纤毛 束的超微结构使用扫描和透射电子显微镜观察。结果：通过对不同尼古丁浓度处理的毛细胞计数 , 毛细胞损失量随尼古丁浓 度的增加。尼古丁的内、外毛细胞受到类似的损伤 ,毛细胞的损伤 , 且基底膜底回 毛细胞较顶、中损伤严重。尼古丁的处理导致毛细胞胞浆空泡增多 , 静纤毛束紊乱和缺失 ,线粒体数量 减少、内质网肿胀和脱颗粒改变。螺旋神经元和听神经纤维未受到明显损伤。结论：尼古丁主要损害体外

4、培养毛细胞 , 尼古丁所造成的毛细胞损伤模式有 耳蜗底回扩展到顶、 中回, 尼古丁耳毒性呈剂量依赖关系 ,但对螺旋神经元和听神 经纤维无明显损伤。第三局部：格尔德霉素衍生物17-DMAG通过上调HSP70寸新 生大鼠耳蜗尼古丁毒性保护作用目的：研究格尔德霉素衍生物17-DMAG在体外培 养的环境下能否保护尼古丁引起的耳蜗毛细胞损伤。方法：别离培养2-3天SD大鼠耳蜗基底膜,筛选出具有培养能够保护毛细胞 的17-DMAG理浓度,基底膜分为空白对照组、单独尼古丁处理组和17-DMAG处理5小时后尼古丁处理组。运用 ELISA和实时定量PCR佥测HSP70勺蛋白和 mRN表达水平：通过荧光免疫组织化

5、学技术检测 HSP7睢离体培养基底膜的细 胞定位 , 并对各组内、外毛细胞进行计数。结果：在体外培养基底膜,HSP70主要定位于体外培养基底膜周围局部新生 的支持细胞及内、外毛细胞的胞浆内。17-DMAG诱导HSP70勺蛋白和mRN水平 的表达上调。经过17-DMAG处理5小时后尼古丁处理,通过对基底膜内、外毛细胞计数, 预处理组毛细胞数量大于单独尼古丁处理组，两者有显著性差异(P<0.001)。 17-DMAC能够保护尼古丁对毛细胞的损伤。结论：17-DMAG通过上调HSP7C蛋白及mRN的表达水平对新生大鼠耳蜗 毛细胞尼古丁损伤保护作用。17-DMAG作为保护尼古丁导致的毛细胞损伤的耳毒性保护剂。第四局部：钙依赖性钾通道BK在C57BL/6J小鼠耳蜗的年龄相关性表达及老 年性聋的关系目的：研究C57BL/6J小鼠耳蜗钙依赖性钾通道BK年龄相关性表达， 探讨BK通道与老年性聋的关系。方法：将小鼠按照年龄分为4、12、26和52周四个实验组。利用免疫荧光组化技术定位 BK通道在各个年龄段的小鼠耳蜗表达部位，荧 光实时定量PCF法和免疫印记法检测BK通道在mRN和蛋白水平的在不同周龄组 的表达情况。结果：免疫荧光提示：在各年龄段的小鼠耳蜗内 BK主要定位在毛 细胞、耳蜗外侧壁和螺旋神经元。实时定量PCR法和免疫印记法提示BK的蛋白及mRN水平随着年龄增加而逐