农杆菌感受态制备[致远书屋]

1、版本一1.1农杆菌感受态细胞的制备1.1.1. 取-70保存的EHA105于含50g/ml链霉素平板划线，28培养。1.1.2. 挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28振荡培养12-16 hr。1.1.3. 取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28220rpm振荡培养至OD600=0.5。1.1.4. 转入无菌离心管，5000rpm离心5min,去上清液。1.1.5. 加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。45000rpm离心5min，去上清。1.1.6. 加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl2溶液，轻轻悬浮

2、。1.1.7. 农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管200l冻存于-70。1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105取1g左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min，-70放置10min 。再在37水浴5min或42水浴1min，接着冰浴2min，加入800mlYM液体培养基28，175rpm摇培3hr后涂在含50g/ml Kanamycin的YM平板上。28培养到形成单菌落。其中 YM 可以用LB 代替 ，第一次的 CaCl2 溶液可用溶液（0.1MCaCl2 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。版本二普通农杆菌感受

3、态制备与转化：1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28过夜活化。2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。3. 5k rpm离心5分钟。4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。如不是马上使用，可以将之按200ul分装储存于-80待用。6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。7. 液氮中冷冻1分钟。8. 37水浴溶化细胞。9. 加1ml YEP培养基，28摇床培养2-4hr（低速）。10. 离心1分钟，悬浮细

4、胞在100ul YEP培养基中。11. 涂板，28培养2-3天。版本三农杆菌感受态细胞的制备1.挑取少许农杆菌LBA4404，接种于5ml LB液体培养基 (含50mg/L STR)中，28、200r/mim培养过夜。2.取2ml培养物于LB液体培养基 (含50mg/L STR) 中继续培养，直至OD800 为0.5左右。3.将培养物置冰浴中30min，4、5000r/min、离心5min，弃去上清液。4.用10ml冷的0.1mol/L NaCl悬浮菌液。5.4、5000r/min，离心5min，弃去上清液。6.用1ml冷的CaCl2 (20mmol/L)悬浮，分装成50l管，液氮中冷冻后至-

5、80保存。农杆菌感受态细胞的制备：1.试剂配制：solution1 ： Rbcl 1.21g 100mMMgCl2.4H2O 1.02g 50mMK-Acetate 0.29g 30mMCaCl2.2H2O 0.15g 10mMGlycerol 15% 15ml，定容至100ml。pH=5.8，121度，高压灭菌30min。solution2： Rbcl 0.12g 10mMK-Acetate 0.1g 10mMCaCl2.2H2O 1.1g 75mMGlycerol 15% 15ml，定容至100ml。pH=5.8，121度，高压灭菌30min。2.农杆菌感受态细胞的培养：15-20ml无抗

6、生素的LB培养基，用牙签挑取农杆菌放入小三角瓶中，28度120转震荡培养过夜。（注意牙签和小三角瓶均需灭菌）3.制备感受态农杆菌：把已培养过夜的小三角瓶中的农杆菌分装到1.5ml小离心管中，室温下，4，000g，离心10min。弃去上清，每管加0.5ml solution1，用手指弹管底部，以使菌体悬浮。冰上放置15mim-2h。4度，4，000g，离心10min。取出后放在冰上，弃去上清，每管加0.5ml solution2，用手指弹管底部，以使菌体悬浮，冰上放置15mim。分装 感受态农杆菌 ，每管可分装3-4管。用液氮速冻后至-80冰箱中保存。版本四1) 从新鲜YEP（5g/LNaCl，

7、10g/L胰蛋白胨，10g/L酵母浸出物，10g/L琼脂，50mg/L利福平，pH7.0）平板上挑取农杆菌 LBA4404的单菌落，接种于5ml液体YEP培养基（含50mg/L利福平）中，28 200r/min振摇培养过夜。2) 取1ml菌液接种于50ml液体YEP培养基（含50mg/L利福平）中扩大培养，28 200r/min振摇培养至OD600为0.5。3) 冰浴30min，4 5000r/min离心收集菌体，重悬浮于10ml 0.15mol/L NaCl溶液中。4) 再次4 5000r/min离心收集菌体，重悬浮于1ml 20mmol/LCaCl2溶液中，按200µl/管分装

8、。制备好的感受态细胞若不立即使用，液氮速冻1min后，放于-70冰箱保存，半年内使用。版本五YEB培养基（用于农杆菌培养及感受态制备）蛋白冻（peptone） 5g/L蔗糖（sucrose） 5g/L牛肉膏（Beef extract） 1g/L酵母提取物（Yeast extract） 5g/L硫酸镁（MgSO47H2O） 0.5g/L固体培养基加1.5%琼脂粉，Ph7.2 高压灭菌。农杆菌电击感受态制备方法一1、 挑取单菌落于YEB振荡过夜28培养。2、 以1:200接种于400500mlYEB培养基中（2000ml三角瓶中），摇菌至0.81.0，冰浴10min。3、 2000g， 4离心10

9、mi后弃上清，用预冷的10甘油重悬沉淀。4、 3000g，4离心10min弃上清，用回流甘油重悬沉淀后集中在一管中。5、 3000g，4离心10min弃上清，用回流甘油重悬沉淀。6、 50l分装一管，70保存。方法二1、 O/N culture in 10ml of YEB/Rif 100+Str 100 at 28;2、 1:100 dilutiongrow till OD600=0.50.8,on ice 30 min;3、 Pellet at 6000rpm for 20min in precooled centrifuge, then resuspend with 1 Vol of p

10、recooled H2O;4、 Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with 0.5 Vol of precooled H2O;5、 Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with 1/50 Vol of precooled 10% glycerol;6、 Pellet at 6000rpm for 20min, then resuspend with 1/500 Vol of precooled 10% glycerol;7、 Aliquot 80l.农杆菌化学感受态制备1、 挑取单菌落于YEB振荡过夜28培养；2、 1:50接种于5