黑曲霉发酵柠檬酸合成途径与代谢调控

1、黑曲霉发酵柠檬酸合成途径与代谢调控摘要:柠檬酸是微生物发酵法生产的重要有机酸,用途极为广泛。我们厂柠檬酸发酵采用的是黑曲霉深层发酵技术，所以对黑曲霉发酵的过程的了解和分析有利于我们实现对发酵的控制和对发酵现在出现的问题从根本上找到解决的途径。关键词:柠檬酸;黑曲霉合成途径; 黑曲霉代谢调控发酵有机酸以柠檬酸为主,它占酸味剂市场的70 %左右。柠檬酸又名枸橼酸，学名-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citric acid，分子式c6h8o7。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。一、柠檬酸发酵菌黑曲霉积累柠檬酸

2、的机理1、 黑曲霉柠檬酸生物合成途径上面的生物反应可以通过化学方程式来表示：（1）c6h12o62ch3cocooh+2atp+2nadh（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸） 葡萄糖通过酵解生成分子的丙酮酸（2）ch3cocooh+co2+atpc4h4o5+adp+pi 丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下氧化脱掉一个cooh（羧基）生成草酰乙酸（3）ch3cocoohcoanadch3c0-coanadhco2 丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的作用下脱氢生成乙酰coa（即活化的乙酸：ch3cooh）（4）c4h4o5+ ch3coohc6h8o7 草酰乙酸和乙酰coa缩合成为柠檬酸黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸,其生物合

3、成途径现普遍认为是:葡萄糖经emp、hmp 途径降解生成丙酮酸,丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰coa ,另一方面经co2 固定化反应生成草酰乙酸,草酰乙酸与coa 缩合生成柠檬酸。 (1)生长期与产酸期都存在emp与hmp途径，前者emp:hmp=2:1，后者emp:hmp=4：1(2)黑曲霉柠檬酸产生菌中存在tca循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，tca和乙醛酸循环被阻断或减弱。(3)由于tca和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（pyr）或磷酸烯醇式丙酮酸（pep）羧化生成的。即由两个co2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化co2生成草酰乙酸为主。二、

4、 黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控 柠檬酸是tca 中一员,是许多组织和微生物中广泛存在的一种重要有机酸,它不仅为许多微生物利用同化,而且是一种重要的代谢调节因子。通常微生物细胞中合成的柠檬酸进一步经tca 循环,生物合成其他有机酸,提供合成细胞物质的中间体或彻底氧化产生能量,为细胞活动和耗能合成代谢提供能量。因此正常生长的细胞中柠檬酸是不会过量积累的。而黑曲霉积累柠檬酸受到四个方面的调节:糖酵解及丙酮酸代谢的调节和mn2 + 调节;三羧酸循环的调节;o2 的调节。（1）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节1、磷酸果糖激酶（pfk）：mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响.当培养基中mn2+ 缺乏时，微生物体内积累

5、几种氨基酸（ga、glu、arg、oin等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样nh4+的消耗下降，nh4+浓度就会升高。2、丙酮酸羧化酶：催化生成草酰乙酸。3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰coa。（2）三羧酸循环的调节1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是tca循环第一个酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸90:3:7。 顺乌头酸

6、水合酶、nad和nadp-异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/l，铁离子2mg/l和ph2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个ph条件下积累的。 3、-酮戊二酸脱氢酶的调节在黑曲霉柠檬酸产生菌中，tca循环的一个显著特点是，-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是tca循环中唯一不可逆反应，一旦-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：tca循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆tca循环生成，使tca循环成“马蹄形”。-酮戊

7、二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。(3)氧对柠檬酸积累的调节乙酰coa和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物。它对柠檬酸发酵的作用为：(1)氧是发酵过程生成的nadh2重新氧化的氢受体。(2)近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链。 当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。三、 黑曲霉积累柠檬酸的机理(1) 由于严格限制供给锰离子等金属离子,或筛选耐高浓度锰离子、锌离子、铁离于等金属离子的菌株,降低菌体中糖代谢转向合成蛋白质、脂肪酸、核酸的能力,使细胞中形成高水平的铵

8、离子,从而解除柠檬酸和atp 对pfk酶的反馈抑制,使emp 的代谢流增大。(2) 黑曲霉中存在一条呼吸活动性强的侧系呼吸链,对氧敏感,但不产生atp ,这样使细胞内的atp 浓度下降。因而减轻了atp 对pfk、cs 的反馈抑制,促进了emp 的畅通,增加柠檬酸的生物合成。(3) 丙酮酸羧化酶是组成性酶,不受代谢调节控制,可源源不断地提供草酰乙酸,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰coa 和co2固定反应取得平衡,保证前体物乙酰coa 和草酰乙酸的提供,柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱,增强了柠檬酸的合成能力。(4)- 酮戊二酸脱氢酶是受葡萄糖和铵离子的阻遏,使黑曲霉中的tca 变成“马蹄形”的代谢方式,减弱tca ,降低细胞内atp 浓度,另外使- 酮戊二酸浓度升高。反过来,又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶,降低柠檬酸的自身分解。(5) 顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸= 90