第4章DNA复制

1、第四第四章章 DNADNA的生物合成的生物合成 1953年Watson和Crick在提 出DNA双螺旋结构。几周以后， Watson和Crick提出了DNA复制 的半保留机制，并于1958年得 到Meselson和Stahl的同位素实 验证实。 探索DNA复制的详细机制 及其调控，对于我们深入理解 遗传物质的传递模式，控制生 物体的生长过程，控制肿瘤和 艾滋病等严重疾病，均有重要 意义。 4.1 DNA复制的概况复制的概况 DNA复制复制(replication)是指亲本DNA双螺旋解开，两条链 分别作为模板，合成子代DNA分子的过程。 染色体外的遗传物质如质粒和噬菌体，以及线粒体和叶绿 体D

2、NA也有基本相似的复制过程，但它们的复制受到染色体 DNA复制的控制。 DNA复制过程的研究一般采用三类系统：一是X174 DNA或质粒DNA及其完成复制所必需的酶、蛋白质及其因子 构成的体外系统。二是以E.coli为模式生物，研究原核生物的 复制。三是以酵母和动物病毒为模式生物，研究真核生物的 DNA复制。 半保留复制半保留复制 (semiconservative replication)的设想， 即DNA的两条链彼 此分开各自作为模 板，按碱基配对规 则合成互补链。由 此产生的子代DNA 的一条链来自亲代， 另一条链则是以这 条亲代链为模板合 成的新链。 4.1.1 DNA的半保留复制的半

3、保留复制 1958年，Meselson和 Stahl应用同位素标记 法和CsCl密度梯度超速 离心技术研究E.coli的 DNA复制，才证实了 半保留复制是正确的。 4.1.2 复制的起点和方向复制的起点和方向 基因组中能独立进行复制的单位称复制子复制子 (replicon) ，在每个细胞周期中，每个复制子只复制一 次。 原核细胞基因组、质粒、许多噬菌体、某些病毒 的DNA及真核生物的细胞器DNA，一般由单个复制子 构成。 复制起点起点(origin) 复制叉复制叉(replication fork)。 复制泡或复制眼(replication eye)。 1963年Cairns观察在大肠杆菌D

4、NA复制 时所形成的放射自 显影图片，结果低放射活性区在复制泡的中间，而高放射活性 区则在两端，这说明肠杆菌染色体的复制是朝两个方向进行的 (图4-2)。 环形DNA复制时，DNA 会形成类似字母的形状， 故称作型复制。 Visualization of bidirectional DNA replication. Replication of a circular chromosome produces a structure resembling the Greek letter theta (). (a) Labeling with tritium (3H) shows that bot

5、h strands are replicated at the same time (new strands shown in red). The electron micrographs illustrate the replication of a circular E. coli plasmid as visualized by autoradiography. DNA复制的起始点 （origin）是含有100 200个碱基对的一段DNA。 原核生物的环状DNA只有 一个复制起点，其复制叉 移动的速度约为105 bp/min。E.coli的DNA复 制一次需40min，但在迅 速生长的原

6、核生物中，第 一次复制尚未完成，第二 次复制就在同一个始点上 开始，从而，使原核生物 可以用更快的速度繁殖。 在真核生物染色体的不同位置上有多个复制起点，真核生 物的复制叉移动较慢(51025103bp /min)，但由于同时起 作用的复制叉数目很大，真核生物染色体DNA复制的总速度比 原核生物更快。例如，果蝇胚胎的基因组DNA总长为大肠杆菌 的40倍，却可在3min内完成复制。 4.2 原核生物原核生物DNA的复制的复制 4.2.1 参与原核生物参与原核生物DNA复制的酶和蛋白质复制的酶和蛋白质 4.2.1.1 DNA 聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶I(DNA polymerase I,

7、DNA pol I)，它是Mr为109000 的一条肽链，催化DNA新链合成时，需要四种脱氧核苷三磷酸 作为底物，还需Mg2+和DNA模板，以及与模板DNA互补的一 小段RNA引物，合成的方向是从5-末端到3-末端。 (图4-3)。 The search for an enzyme that could synthesize DNA began in 1955. Work by Arthur Kornberg and colleagues led to the purification and characterization of DNA polymerase from E. coli ce

8、lls, a single-polypeptide enzyme now called DNA polymerase I (Mr 103,000; encoded by the polA gene). Much later, investigators found that E. coli contains at least four other distinct DNA polymerases. 脱氧核苷酸单位遵循碱基配 对的原则逐个加到引物的3-端， DNA pol I不但可催化DNA链的 延长，也能催化DNA链的水解， 它具有35方向的外切酶活力， 和53方向的外切酶活力。 35外切酶可

9、切除错配的核苷 酸，即具有校对功能校对功能 (proofreading function)。53外 切酶可用于切除RNA引物。 DNA polymerase I has three enzymatic activities in a single polypeptide chain, which can be cleaved into two functional parts by mild protease treatment. Protease cleavage Crystal structure of phage T7 DNA polymerase has a right hand st

10、ructure. DNA lies across the palm and is held by the fingers and thumb. 在DNA复制时，DNA pol I的主要作用是利用其53外 切酶活力切除RNA引物，利用 其53聚合酶活力，将脱氧 核苷酸连接到相邻DNA片段的 3-羟基上，逐渐用DNA链取代 RNA引物。此外，在DNA损 伤的修复中，DNA pol I可用类 似的机制切除有损伤的DNA片 断，并用正确的DNA片段填补 缺口(图4-5)。上述过程可以使 DNA链上的切口移动，称切口 平移。 1970年代，先后发现了DNA聚合酶聚合酶II (DNA polymerase

11、II, DNA pol II)和DNA聚合酶聚合酶III(DNA polymeraseIII, DNA pol III)。 DNA pol I主要参与DNA损伤的修复，DNA pol III是主要的复制 酶。E.coli 3种DNA聚合酶的主要数据如表4-1所示， 表 4-1 大肠杆菌DNA聚合酶的有关数据 DNA聚合酶的类型IIIIII 结构基因polApolB(dnaA)polC(dnaE) 亚基数 1 710 Mr(kD) 10388 830 35外切酶活性有有有 53外切酶活性有无无 聚合速度(核苷酸/秒)1620402501 000 连续合成能力(核苷酸)32001500500 00

12、0 DNA pol III含有两个核心酶核心酶 (core enzyme)，其亚基组成均为 ，其中的亚基具有聚合酶活 性，亚基具有校对活性， 亚 基二聚体将两个核心酶连接为一 个复合物。每个核心酶连接一个 -滑动夹子滑动夹子(-sliding clamp)结构， 每个-滑动夹子由2个亚基构成， 可将正在复制的DNA固定在夹 子中心，并能随DNA复制沿着 模板DNA链滑动(图4-7)。 1990年代末发现的DNA聚 合酶IV和V在DNA出现严重损 伤时，参与DNA损伤的修复。 4.1.2.2 参与原核生物参与原核生物DNA复制的其它酶和复制的其它酶和蛋白质蛋白质 (1) DNA解旋酶解旋酶 DN

13、A双螺旋的解开需DNA解旋酶解旋酶(DNA helicase) 参与，该酶一般由六个亚基组成，解开双螺旋需ATP 提供能量。 解旋酶具有内在的依赖于DNA的NTP酶活性， DNA解旋酶都具有移位酶(translocase)活性。 解链的极性，解旋酶在与DNA结合以后的移位 一般是单向的。 (2) 单链结合蛋白单链结合蛋白 单链结合蛋白单链结合蛋白(single strand binding protein, SSB) 本身并无任何酶的活性，但通过与DNA单链区段的结 合，起到稳定单链DNA的作用 E.coli 的SSB以四聚存在，Mr为74 KD，原核生 物的SSB与DNA单链的结合具有正协同

14、效应。 （3） 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶(topoisomerase)是一类通过催化DNA 链的断裂、旋转和再连接而直接改变DNA拓扑学性 质的酶。 拓扑异构酶I(TopoI)曾 被称作 (Omega)蛋白， 松驰酶等，可消除和减 少负超螺旋，对正超螺 旋不起作用。其作用机 制是切开DNA双链中 的一条链，绕另一条链 一周后再连接，可以改 变DNA的连环数，从 而改变超螺旋的圈数， 其作用过程不需要ATP 提供能量。(图4-8)。 拓扑异构酶拓扑异构酶II(topII)可以切断DNA的两条链， 使其跨越另一段双链DNA后再连接，在消耗ATP 的情况下，每作用一次可引入2个负超

15、螺旋(见图 2-28)。在DNA复制时，引人负超螺旋有利于两条 链解开。此外，DNA复制时，随着双链的解开， 会产生形成正超螺旋的扭曲张力，TopII引入负超 螺旋，可消除这种扭曲张力，使复制可持续进行。 Top I 和 Top II广泛存在于原核和真核生物， Top I主要集中在转录区，与转录有关，Top II分 布于染色质骨架蛋白和核基质部分，与复制有关。 （4） 引发酶引发酶 原核生物DNA复制时，首先要在引发酶引发酶(primase)的作用下 合成RNA引物，随即在DNA聚合酶III催化下合成DNA链。 E.coli引发酶由一条肽链组成，但具有三个相对独立的结构域， N-端结构域(p1

16、2)具有锌指结构，是结合DNA的结构域。C-端 结构域(p16)可以与复制叉内的DnaB蛋白相互作用，通过这种 相互作用，引发酶被招募到复制叉上。核心结构域(p35)位于中 央，是RNA聚合酶的活性中心。 （5） DNA连接酶连接酶 如前所述，DNA pol I可以催化切口平移，但不 能催化1个DNA片段的3-OH和另一个DNA片段的 5-磷酸基之间最后一个键的形成。在细胞中，切口 的连接是由DNA连接酶连接酶(DNA ligase)催化的。连接酶 均是基因工程中常用的工具酶。 酶或蛋白质 Mr （103） 亚基数功能结构基因 SSB（单链结合蛋白）764稳定解开的单链ssb Dna T663

17、预引发 n蛋白282预引发引物体装配 Dna A504在复制起点特异部位解开双链DNAdna A Dna C291传送Dna B至解旋的模板DNA上dna C Dna B(解旋酶)3006利用ATP水解能量解开链DNAdna B HU（类组蛋白）192促进起始 DnaG(引物酶)601合成RNA引物dna G DNA聚合酶III40010合成DNA DNA聚合酶I1091修复（填充缺口）切除RNA引物pol A DNA连接酶741共价连接切口lig 拓扑异构酶I1004松弛负超螺旋 拓扑异构酶II4004引入负超螺旋 A亚基1052链的断裂、再连接gyr A B亚基952ATP酶gry B R

18、ep蛋白66135解旋sep 解旋酶I180解链 解旋酶II751解链 解旋酶III20解链 表 4-3 参与原核物DNA复制的酶和蛋白质 4.2.2 复制的起始复制的起始 E.coli只有一个复制起点称OriC，由245bp组成。这一顺序在 大多数细菌中是高度保守的，其排列方式如图4-11所示，关键顺 序是3个13bp的正向重复顺序，和4个9bp(TTATCCACA)的重复序 列，此外还有11个拷贝的甲基化位点序列GATC。 DNA复制的起始阶段需要在引发体引发体(primosome)作用下合成 RNA引物。 (1) 在HU蛋白、整合宿主因子 (integration host factor

19、, IHF)的帮助下， Dna A蛋白四聚体在ATP参与下，结合 于OriC的9bp重复顺序(富含A-T)。 (2) Dna A组装成蛋白核心，DNA 则环绕其上形成类似核小体的结构。 (3) Dna A蛋白所具有的ATP酶活 性，水解ATP以驱动13 bp重复序列内 富含AT碱基对的序列解链，形成长约 45 bp的开放起始复合物。 (4) 在Dna C蛋白和Dna T蛋白的帮 助下，2个Dna B蛋白被招募到解链区， 此过程也需要消耗ATP。 (5) 在Dna B蛋白的作用下，OriC 内的解链区域不断扩大，形成复制泡 和2个复制叉。随着单链区域的扩大， 多个单链结合蛋白(SSB)结合于解开

20、的 DNA单链部分，稳定单链DNA (图4- 12)。Dna B解螺旋形成的扭曲张力， 在 TOPII的作用下被消除。 4.2.3 DNA链的延伸链的延伸 DNA的两条链是反向 平行的，但DNA合成的 原料均为5-核苷三磷酸， 形成酯键时，只能将5- 位的磷酸基连接到引物 的3- OH上。与此相对应， 迄今发现的DNA聚合酶 只能催化53方向的新 链合成。实验的结果说 明，新链的合成方向是 53。 1968年冈崎等用3H标记的脱氧胸苷短时间处理 噬菌体感染的大肠杆菌，然后分离标记的DNA产物， 发现短时间内首先合成的是较短的DNA片段，接着 很快即可出现较大的分子。这些DNA短片段被定名 为冈

21、崎片段冈崎片段(Okazaki fragment)。 DNA复制时，一条链是连续合成的，另一条链 是由间断合成的短片段连接而成的，这样的复制过 程称作半不连续复制半不连续复制(semidiscontinuous replication)。 前导链前导链(leading strand)。 后随链：后随链：另一条链是在 已经形成一段单链区后， 先按与复制叉移动的方 向相反的方向，沿53 方向合成短片段(冈崎片 段)，再通过酶的作用将 短片段连在一起构成完 整的链 (lagging strand)。 后随链的模板链环化， (图4-14)。 (1) 在Pri A, Pri B和PriC 蛋白的帮助下，

22、Dna G蛋白(引 发酶)被招募到2个复制叉上， 与DnaB 蛋白结合在一起， DnaA 蛋白逐渐脱离复合物。 (2) Dna G沿着DNA模板 链合成前导链的RNA引物。 (3) DnaG沿着DNA模板链 合成后随链的RNA引物。 (4) DNA pol III结合到两 个复制叉上。 (5) 由DNA pol III分别合 成前导链和后随链。 DNA合成的速度是每条链每秒加接约1000个核苷酸。 冈崎片段一旦合成完毕，它的RNA引物被DNA pol I除去并用DNA链来替换。留下一个切口(mick)由 DNA连接酶连接。 由于DNA复制是半不连续性的，前导链上只需 要合成一个RNA引物，而在

23、后随链上则每一个冈崎 片段均需要合成一个RNA引物。这些RNA引物随后 要被切除，这是一个高度耗能的过程。？ 4.2.4 复制的终止复制的终止 单向复制的环状DNA分子，其复制的终点就是其 原点。双向复制的DNA环形分子，在两个复制叉相遇 时即完成复制。但两个复制叉合成新链的速度一旦出 现差异，就可能为复制的终止造成麻烦。 E.coli的顺时针复制叉有4个 连续排列的称作终止子终止子 (terminator, ter)的序列。逆 时针复制叉有3个连续排列 的终止子，当复制叉移动到 终止子处，被称作终点利用 物质(terminus utilization substans, Tus)的蛋白质会结

24、 合在ter序列上，阻止复制叉 的移动。这样，当一个复制 叉先期到达终止区时，其复 制会停止，待另一个复制叉 到达同一位置，两个复制叉 相遇，即完成了整个DNA 的复制过程(图4-17)。 DNA复制完成后两个子代分子 以连环体（catenanes）的形 式存在，需要由拓扑异构酶 将其中的一个环状分子切开， 使两个子代分子脱离后再将切 开的DNA连接成环状分子。 4.3 真核生物真核生物DNA的的复制复制 研究真核生物DNA的复制是一项困难的工作， 目前有关的资料主要是从对SV40病毒和酵母菌的研 究中得到的。真核生物DNA复制的基本过程与原核 生物相似，但参与复制的酶和蛋白质与原核生物不 同

25、，复制起始的调控更加复杂。 4.3.1 参与真核生物参与真核生物DNA复制的酶和蛋白质复制的酶和蛋白质 在真核细胞中发现的DNA聚合酶已超过15种， 其中最重要的是较早发现的5种，即DNA聚合酶, , , 和(表4-4)，而新发现的10多种DNA聚合酶，如 聚合酶, , , , , , , 和，除外均无3-外切酶 活性，也就是说没有校对的功能，它们主要参与 DNA损伤的修复。 4.3.1.1 DNA 聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶聚合酶(DNA pol)是一种四聚体蛋白， p180亚基具有类似原核生物DNA pol I的手型结构。 DNA pol的三个小亚基中有两个具有引发酶的活 性，负责合成R

26、NA引物。 DNA pol缺乏3-外切酶活性，因此无校对能力。 但在DNA复制过程中，复制蛋白A(replication protein A, RPA)与它相互作用，稳定其与引物末端的结合， 同时降低参人错误核苷酸的机会，抵消了无校对能力 对复制忠实性的不利影响。 4.3.1.2 DNA聚合酶聚合酶和和 DNA聚合酶聚合酶(DNA pol)由35个亚基组成。 DNA聚合酶聚合酶(DNA pol)由四个亚基组成。DNA pol 和都有3-外切酶活性，因此具有校对能力。 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)为聚合酶的辅助蛋

27、白，其作用相当于E.coli DNA pol III的亚基。在真核细胞DNA复制中，由 PCNA三个亚基组成滑动钳，以提高聚合酶合成 DNA的连续性 (图4-18) 。冈崎片段合成后，PCNA 会从聚合酶及DNA链上脱落，加入另一个冈崎片段 合成。 4.3.1.3 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶(DNA pol)是真核细胞中最小的 DNA聚合酶，由一条Mr为39 kD的多肽链组成。其N- 端较小的结构域可与单链DNA结合，且具有5-脱氧 核糖磷酸酶(5-deoxyribose phosphatase)的活性，C-端 较大的结构域具有聚合酶的活性。DNA pol参与 DNA损伤的修复，能够填补DNA链上的短缺口。 4.3.1.4 DNA聚合酶聚