细胞培养学课件：第二节肿瘤细胞培养

1、 第二节第二节 肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养 肿瘤细胞的培养在细胞培养中有核心的位置。肿瘤细胞的培养在细胞培养中有核心的位置。 癌细胞较易培养，目前建立的细胞系主要是癌癌细胞较易培养，目前建立的细胞系主要是癌 细胞系。细胞系。 肿瘤是对人类威胁最大的疾病，肿瘤细胞培养肿瘤是对人类威胁最大的疾病，肿瘤细胞培养 是研究癌变机理、抗癌药物检测和癌细胞分子生物是研究癌变机理、抗癌药物检测和癌细胞分子生物 学的重要手段。学的重要手段。 一、体外培养肿瘤细胞的生物学特性一、体外培养肿瘤细胞的生物学特性 生长在体内的肿瘤细胞和体外培养的肿瘤生长在体内的肿瘤细胞和体外培养的肿瘤 细胞，其差异较小，但也并非完全相同

2、，培养细胞，其差异较小，但也并非完全相同，培养 中的肿瘤细胞具有以下突出特点：中的肿瘤细胞具有以下突出特点： 1.形态和性状：形态和性状： 光镜下无特异形态，大多数肿瘤细胞镜光镜下无特异形态，大多数肿瘤细胞镜 下观察较二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓下观察较二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓 明显，核糖体颗粒丰富。电镜下细胞表面的明显，核糖体颗粒丰富。电镜下细胞表面的 微绒毛多而细密，微丝走形不如正常细胞规微绒毛多而细密，微丝走形不如正常细胞规 则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着 依赖性有关。依赖性有关。 2. 生长增殖：生长增殖：与体内相同，与体内相同，生

3、长失控生长失控，有以下特点：，有以下特点： 自泌或内泌功能：产生促增殖因子，自泌或内泌功能：产生促增殖因子，癌细胞在低癌细胞在低 血清培养基中（血清培养基中（25%）仍能生长）仍能生长。 正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中 生长的能力，已成为检测细胞恶变的一个指标。生长的能力，已成为检测细胞恶变的一个指标。 癌细胞或培养中发生恶性转化的单个细胞培养时，癌细胞或培养中发生恶性转化的单个细胞培养时， 形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。 接触抑制消失接触抑制消失，细胞能相互重叠向三维空间发展，细胞能相互重叠向三维

4、空间发展， 形成堆积物。形成堆积物。 3. 永生性或不死性：永生性或不死性：表现为细胞可无限传代而不发生表现为细胞可无限传代而不发生 凋亡（凋亡（Apoptosis）或程序化死亡（）或程序化死亡（PCD）。事实上多）。事实上多 数肿瘤细胞初代培养也并不容易，生长增殖并不旺盛数肿瘤细胞初代培养也并不容易，生长增殖并不旺盛 增殖若干代后出现类似增殖若干代后出现类似diploid cell培养中的停滞期培养中的停滞期 过此阶段后才获得永生性。过此阶段后才获得永生性。 体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得 的。的。 从一些具有永生性而无恶性性的细胞如从一

5、些具有永生性而无恶性性的细胞如NIH3T3 等细胞证明，永生性和恶性性是两种性状，受不同基等细胞证明，永生性和恶性性是两种性状，受不同基 因调控，但有相关性。可能永生性是细胞恶变阶段。因调控，但有相关性。可能永生性是细胞恶变阶段。 4. 浸润性：浸润性：为肿瘤细胞扩张性增殖行为。与正常组织混为肿瘤细胞扩张性增殖行为。与正常组织混 合培养时，能浸润入其他组织细胞中，并有穿透人工隔合培养时，能浸润入其他组织细胞中，并有穿透人工隔 膜的能力。膜的能力。 5. 异质性：异质性：表现同一肿瘤组织内细胞的活力有差别，如表现同一肿瘤组织内细胞的活力有差别，如 处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中

6、处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中 心区有的细胞衰老退化，有的处于周期停滞期，只有增心区有的细胞衰老退化，有的处于周期停滞期，只有增 殖活跃的细胞才是支持肿瘤生长的成分如干细胞（殖活跃的细胞才是支持肿瘤生长的成分如干细胞（Stem Cells）。（异质性是指肿瘤组织由增殖能力、遗传性、）。（异质性是指肿瘤组织由增殖能力、遗传性、 起源和周期状态等性状不同的细胞组成。）起源和周期状态等性状不同的细胞组成。） 6. 遗传特征：遗传特征：失去二倍体核形、呈异倍体或多倍体等。失去二倍体核形、呈异倍体或多倍体等。 二、培养方法二、培养方法 初代培养应用组织块和消化培养法均可初代培养应用组织

7、块和消化培养法均可( (具具 体方法与正常细胞无差别体方法与正常细胞无差别) ) 。 肿瘤细胞培养成功的关键在于：肿瘤细胞培养成功的关键在于： 1. 取材：取材：要挑选活力好的部位，尽量避免用要挑选活力好的部位，尽量避免用 退变组织。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养退变组织。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养 材料。取材后需尽快培养，注意化疗后的肿瘤组材料。取材后需尽快培养，注意化疗后的肿瘤组 织易坏死。织易坏死。 2. 适宜的培养基：适宜的培养基： 要求不如正常细胞严格要求不如正常细胞严格 肿瘤细胞对血清的需求较低，对培养环肿瘤细胞对血清的需求较低，对培养环 境适应性较大境适应性较大 大多数大

8、多数肿瘤细胞仍需生长因子，个别需肿瘤细胞仍需生长因子，个别需 特异性生长因子特异性生长因子 3. 成纤维细胞的排除成纤维细胞的排除 是获得纯肿瘤细胞的关是获得纯肿瘤细胞的关 键。混杂时，成纤维细胞键。混杂时，成纤维细胞肿瘤细胞。排除方肿瘤细胞。排除方 法多种：法多种： 机械刮除法：镜下用不脱色笔标记肿瘤细机械刮除法：镜下用不脱色笔标记肿瘤细 胞生长部位胞生长部位去培养液去培养液无菌胶刮刮除（无菌胶刮刮除（scraper） 无标志空间无标志空间Hanks液冲洗液冲洗继续培养（可反复继续培养（可反复 刮除）刮除） 胰蛋白酶消化反复贴壁法胰蛋白酶消化反复贴壁法 依据：依据： 肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁

9、慢肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁慢 结合使用无血清或低血清培养基结合使用无血清或低血清培养基 单层细胞胰蛋白酶消化后单层细胞胰蛋白酶消化后 Hanks液冲洗液冲洗2次次 加无血清培养基吹打细胞制成单细胞悬液加无血清培养基吹打细胞制成单细胞悬液 A 培养瓶培养瓶 37静置静置520min全部培养液移入全部培养液移入B 培养瓶培养瓶 37静置静置520min全部培养液移入全部培养液移入C 培养瓶，培养瓶，A、B培养瓶补充完全培养液继续培养，培养瓶补充完全培养液继续培养， 次日观察。次日观察。 A瓶主要为成纤维细胞，瓶主要为成纤维细胞， B瓶为两类细胞混杂，瓶为两类细胞混杂， C瓶则主要为肿瘤细胞瓶则主要

10、为肿瘤细胞。 消化排除法：利用成纤维细胞对胰蛋白消化排除法：利用成纤维细胞对胰蛋白 酶和胶原酶敏感的特点，以胶原酶较为常用，消酶和胶原酶敏感的特点，以胶原酶较为常用，消 化的同时注意在倒置显微镜下观察，可重复进行。化的同时注意在倒置显微镜下观察，可重复进行。 其他方法：聚丙烯酰胺、其他方法：聚丙烯酰胺、SOD等抑制成纤等抑制成纤 维细胞生长；聚蔗糖制成密度梯度离心液维细胞生长；聚蔗糖制成密度梯度离心液 （1.025 1.085)，23 800g 离心离心10min， 1.025 1.050层为成纤维细胞，层为成纤维细胞， 1.065 1.085 为为 上皮细胞上皮细胞。 选用上述任何一种方法，

11、都需进行预试验，选用上述任何一种方法，都需进行预试验， 找出适合的条件，才能获得好的效果。找出适合的条件，才能获得好的效果。 三、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施三、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施 肿瘤细胞原代培养成功后，常出现以下情况： 完全无细胞游出或移动完全无细胞游出或移动 有细胞游出或移动，但无细胞增殖，细胞长时间处有细胞游出或移动，但无细胞增殖，细胞长时间处 于停滞状态难以传代于停滞状态难以传代 有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡 传数代后细胞增殖缓慢，经一段停滞期后才又呈旺传数代后细胞增殖缓慢，经一段停滞期后才又呈旺 盛生长状态，

12、形成稳定生长的肿瘤传代细胞系盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系 说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求。说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求。 二、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施二、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施 1适宜底物：适宜底物： v如：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾如：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾 胶原底层、饲细胞层等。胶原底层、饲细胞层等。 2生长因子：生长因子： v应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促 细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同

13、的促生长 物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生 长因子。长因子。 3动物体媒介培养动物体媒介培养（裸鼠为佳）（裸鼠为佳）： v为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活 力癌细胞力癌细胞(干细胞干细胞) 的数量，可采用动物体转嫁接种成的数量，可采用动物体转嫁接种成 瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养 的成功率。受体动物以裸鼠最好。的成功率。受体动物以裸鼠最好。 Hela细胞细胞 肝癌细胞肝癌细胞 人乳腺癌细胞株人乳腺癌细胞株MCF-

14、7 四、四、 体外培养肿瘤细胞的生物学检测：体外培养肿瘤细胞的生物学检测： 目的：目的： 确为来源于原体内具有恶性的肿瘤细胞而非其确为来源于原体内具有恶性的肿瘤细胞而非其 他细胞他细胞 具有瘤种特异性具有瘤种特异性 阐明一般生物学性状阐明一般生物学性状 主要包括：主要包括： 1. 异体动物接种致瘤（裸鼠）异体动物接种致瘤（裸鼠） 2. 软琼脂培养软琼脂培养 3. 核型分析核型分析 4. 细胞骨架和电镜分析细胞骨架和电镜分析 5. 癌基因和抗癌基因的分析癌基因和抗癌基因的分析 五、对肿瘤细胞系或细胞株的评价五、对肿瘤细胞系或细胞株的评价 应用这些细胞系时，应持特别审慎态应用这些细胞系时，应持特别

15、审慎态 度，要考虑到这些细胞在长期传代中是否度，要考虑到这些细胞在长期传代中是否 发生遗传性改变的可能。发生遗传性改变的可能。 用癌细胞系所获实验结果应尽量做分用癌细胞系所获实验结果应尽量做分 析性的结论，避免做概括性的与体内等同析性的结论，避免做概括性的与体内等同 的结论。的结论。 3 器官培养器官培养 概念：概念：将来自于供体的器官或器官组织块，在不将来自于供体的器官或器官组织块，在不 进行组织分离的前提下，于体外环境中让其生存、进行组织分离的前提下，于体外环境中让其生存、 生长并生长并保持一定的结构和功能特征保持一定的结构和功能特征，这一体外培，这一体外培 养的方法即为养的方法即为器官培

16、养（器官培养（organ culture）。 可直接观察体外环境下器官组织的生长过程及其变可直接观察体外环境下器官组织的生长过程及其变 化规律，了解组织细胞间的正常联系及相互作用。化规律，了解组织细胞间的正常联系及相互作用。 通过改变外界条件、人为施加一些因素，还能进一通过改变外界条件、人为施加一些因素，还能进一 步研究局部环境对培养器官生长的调节作用。步研究局部环境对培养器官生长的调节作用。 与细胞培养相比，器官培养使培养物在结构及功能与细胞培养相比，器官培养使培养物在结构及功能 上，均更接近于其在机体内生长的情况。上，均更接近于其在机体内生长的情况。 器官培养的发展：器官培养的发展： 18

17、97年，年，Leob首次利用血浆凝块对成年兔的肝、肾、甲状首次利用血浆凝块对成年兔的肝、肾、甲状 腺及卵巢等器官组织块进行培养，使其在体外培养腺及卵巢等器官组织块进行培养，使其在体外培养3天内，天内， 可维持正常的组织结构。可维持正常的组织结构。 20世纪初，器官培养的材料主要来自于世纪初，器官培养的材料主要来自于胚胎器官胚胎器官，以鸡胚，以鸡胚 较为常用。较为常用。1914年，年，Thompson用悬滴培养法，对鸡胚的脚用悬滴培养法，对鸡胚的脚 趾、羽毛等做了器官培养，使之在体外条件下生长、增大并趾、羽毛等做了器官培养，使之在体外条件下生长、增大并 出现形态的分化。出现形态的分化。 以后的几

18、十年，器官培养技术发展迅速，培养材料不仅包以后的几十年，器官培养技术发展迅速，培养材料不仅包 括脊椎动物的多种胚胎器官，还扩展到胚胎以外的成体器官。括脊椎动物的多种胚胎器官，还扩展到胚胎以外的成体器官。 培养基的来源和成分也有所改进。随着半固体、液体培养基培养基的来源和成分也有所改进。随着半固体、液体培养基 被引入培养系统，被引入培养系统，Fell、Spratt、Wolff 等创立了等创立了表玻皿器官表玻皿器官 培养法、琼脂固化技术及培养法、琼脂固化技术及Wolff器官培养法器官培养法。 在静置培养基础上发展起来的在静置培养基础上发展起来的动态器官培养法动态器官培养法，可，可 同时促进培养器官

19、对培养基及气体的利用，及时消除同时促进培养器官对培养基及气体的利用，及时消除 培养系统中代谢产物的影响，因而成为器官培养技术培养系统中代谢产物的影响，因而成为器官培养技术 发展历程中一个重要的突破。已发展成为发展历程中一个重要的突破。已发展成为胚胎培养的胚胎培养的 经典技术经典技术。 体内器官培养法体内器官培养法，即利用动物本身的某些器官或组，即利用动物本身的某些器官或组 织作为培养的环境，来进行器官培养，也是器官培养织作为培养的环境，来进行器官培养，也是器官培养 技术一个重要的发展，如兔眼前房、鸡胚早期胚盘、技术一个重要的发展，如兔眼前房、鸡胚早期胚盘、 鸡胚尿囊绒膜等均是体内培养法常用的器

20、官，对研究鸡胚尿囊绒膜等均是体内培养法常用的器官，对研究 一些体外条件下难以存活的器官提供了一条较为适用一些体外条件下难以存活的器官提供了一条较为适用 的途径。的途径。 一、器官培养的要求一、器官培养的要求 体外条件下，由于缺乏血液循环系统，体外条件下，由于缺乏血液循环系统， 培养器官的养分及氧气供应主要依靠自然渗培养器官的养分及氧气供应主要依靠自然渗 透和气体扩散来完成，与单层培养的细胞不透和气体扩散来完成，与单层培养的细胞不 同，同，培养器官在结构上是三维立体的培养器官在结构上是三维立体的，为保，为保 证其在体外的生存及生长，对培养过程的各证其在体外的生存及生长，对培养过程的各 环节均有一

21、定的要求。环节均有一定的要求。 （一）取材（一）取材 为避免在培养过程中，培养器官的组织中心因缺乏营养或为避免在培养过程中，培养器官的组织中心因缺乏营养或 氧气而坏死，通常要求氧气而坏死，通常要求培养材料的体积在培养材料的体积在8mm3以下以下。对于。对于 一些氧消耗量大的器官，如肝、肾等，尤其需要控制体积的一些氧消耗量大的器官，如肝、肾等，尤其需要控制体积的 大小。大小。 胚胎器官因其对氧需求量较低（能量来源主要为糖酵解）胚胎器官因其对氧需求量较低（能量来源主要为糖酵解） ，因此既可以作为整体，也可取其一部分进行器官培养。，因此既可以作为整体，也可取其一部分进行器官培养。 对胚胎器官的一部分

22、进行培养时，对胚胎器官的一部分进行培养时，所取材料的大小会影响所取材料的大小会影响 其分化的方向及进程其分化的方向及进程，应，应根据培养目的来确定所取材料的大根据培养目的来确定所取材料的大 小小。如培养鸡胚胚盘时，体积较大将向神经组织分化，小块。如培养鸡胚胚盘时，体积较大将向神经组织分化，小块 胚盘则倾向于形成角化的表皮细胞或肠样细胞。胚盘则倾向于形成角化的表皮细胞或肠样细胞。 u体积体积： u完整性完整性 应尽量保持材料的完整性，减少操作过程对材料应尽量保持材料的完整性，减少操作过程对材料 的损伤，所取的材料的损伤，所取的材料创面要平整，结构上具立体的三创面要平整，结构上具立体的三 维特征，

23、同时还能反映出原器官的结构及功能特点维特征，同时还能反映出原器官的结构及功能特点。 如肾脏器官取材时必须同时具有皮质和髓质；皮如肾脏器官取材时必须同时具有皮质和髓质；皮 肤取材时，应根据皮肤的层次，同时取得包括表皮、肤取材时，应根据皮肤的层次，同时取得包括表皮、 真皮及皮肤其他附属部分结构的功能性皮片。真皮及皮肤其他附属部分结构的功能性皮片。 u所取材料要所取材料要保持新鲜保持新鲜，应尽量缩短材料离体到应尽量缩短材料离体到 培养的时间。培养的时间。 u取材过程中保持取材过程中保持无菌环境和无菌操作无菌环境和无菌操作。 （二）培养基（二）培养基 所用培养基既可是固体的，也可是液体的。所用培养基既

24、可是固体的，也可是液体的。 从来源可分为天然培养基及合成培养基两大类：从来源可分为天然培养基及合成培养基两大类： 天然培养基：动物血清、鸡血浆及鸡胚汁等天然培养基：动物血清、鸡血浆及鸡胚汁等 天然培养基含有丰富的能促进器官生长、发育及分化的天然培养基含有丰富的能促进器官生长、发育及分化的 因子，在器官培养中其重要作用，而对于胚胎器官的培养更因子，在器官培养中其重要作用，而对于胚胎器官的培养更 是必不可少。是必不可少。 合成培养基：通常也需加入一定比例的天然培养基。合成培养基：通常也需加入一定比例的天然培养基。 培养的器官不同，其适应的培养基有所差异，如培养的器官不同，其适应的培养基有所差异，如

25、1066培培 养基适用于培养成年器官，养基适用于培养成年器官，BGJ则常用于鸡胚长骨的培养。则常用于鸡胚长骨的培养。 在培养基中加入细胞因子、激素或维生素等，可更好地在培养基中加入细胞因子、激素或维生素等，可更好地 维持培养器官的结构、促进其生长，但应严格控制剂量。维持培养器官的结构、促进其生长，但应严格控制剂量。 （三）培养环境中的气体（三）培养环境中的气体 氧气氧气：对于培养器官的生长起重要作用，其在培养基中溶：对于培养器官的生长起重要作用，其在培养基中溶 解的程度，直接影响培养器官体积的大小及存活的时间。解的程度，直接影响培养器官体积的大小及存活的时间。 不同的培养器官，对氧气的消耗量有

26、差异：不同的培养器官，对氧气的消耗量有差异： 多数成体器官及某些胚胎器官，在多数成体器官及某些胚胎器官，在氧分压为氧分压为95%的条件下的条件下 进行器官培养较为适宜；进行器官培养较为适宜； 骨骼原基在氧分压骨骼原基在氧分压35%条件下，可很好地发育、生长，产条件下，可很好地发育、生长，产 生胶原，超过生胶原，超过35%骨将发生碎裂；骨将发生碎裂； 45%的氧适合于胚胎皮肤的培养。的氧适合于胚胎皮肤的培养。 二氧化碳二氧化碳：是器官培养所必需，作用主要为维持培养基的：是器官培养所必需，作用主要为维持培养基的 酸碱平衡，常用浓度为酸碱平衡，常用浓度为5%。 （四）培养器官的支持物（四）培养器官的

27、支持物 选用不同的支持物，可使培养器官的结构及分选用不同的支持物，可使培养器官的结构及分 化产生不同的变化。为化产生不同的变化。为保持培养器官的三维结构保持培养器官的三维结构， 常需常需抑制培养过程中细胞发生迁移抑制培养过程中细胞发生迁移，支持物可在此，支持物可在此 方面其重要作用。方面其重要作用。 琼脂：较为常用。可将培养器官直接种植于琼脂琼脂：较为常用。可将培养器官直接种植于琼脂 上，也可将培养的器官包裹于琼脂块中。上，也可将培养的器官包裹于琼脂块中。 网格状支持物网格状支持物 经常将培养器官移动到新的培养支持物上经常将培养器官移动到新的培养支持物上 二、器官培养技术的特点二、器官培养技术

28、的特点 利用器官培养技术能直接的研究、观察个体某一器官形利用器官培养技术能直接的研究、观察个体某一器官形 态的发生、结构的形成及分化过程。态的发生、结构的形成及分化过程。 利用器官培养技术，可独立地在体外环境中，系统研究利用器官培养技术，可独立地在体外环境中，系统研究 器官的功能活动及组成器官的各组织间的相互作用。器官的功能活动及组成器官的各组织间的相互作用。 在器官培养中，通过施加一种或多种实验因素，可研究在器官培养中，通过施加一种或多种实验因素，可研究 器官生长、分化中的调节过程及影响因素，而排除了体器官生长、分化中的调节过程及影响因素，而排除了体 内复杂因素的干扰。内复杂因素的干扰。 优

29、点：优点： 不足：不足： 器官培养中，培养物所在的人工环境与体内环境器官培养中，培养物所在的人工环境与体内环境 相比，仍存在较大差异。因此，不能将器官培养相比，仍存在较大差异。因此，不能将器官培养 中获得的结果，尤其是某些药物的作用效果，直中获得的结果，尤其是某些药物的作用效果，直 接推论于体内的情况。接推论于体内的情况。 器官培养中，培养物的存活时间有限，限制了对器官培养中，培养物的存活时间有限，限制了对 其进行长时间的研究，不能实现对某些外界因素其进行长时间的研究，不能实现对某些外界因素 效应的跟踪。效应的跟踪。 三、器官培养的方法三、器官培养的方法 （一）固体培养基器官培养法（一）固体培养基器官培养法 表玻璃器官培养法表玻璃器官培养法（watch glass techniques） 经典的器官培养法，固体培养基由鸡胚提取汁与鸡血浆经典的器官培养法，固体培养基由鸡胚提取汁与鸡血浆 混合后凝聚而成，常用于混合后凝聚而成，常用于胚胎器官原基胚胎器官原基的形态发生研究。的形态发生研究