蛋白质含量的测定

1、林琳林琳 蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定 基于蛋白质的基于蛋白质的 元素组成特点元素组成特点 基于蛋白质的基于蛋白质的 化学显色反应化学显色反应 基于蛋白质的基于蛋白质的 光吸收特性光吸收特性 选择测定选择测定方法主要基于几点考虑方法主要基于几点考虑： 实验对测定所要求实验对测定所要求 的灵敏度和精确度的灵敏度和精确度 检测条件检测条件 溶液中存在溶液中存在 的干扰物质的干扰物质 蛋白质特点蛋白质特点 测定所要花测定所要花 费的时间等费的时间等 在选择方法时应考虑在选择方法时应考虑 【实验目的】【实验目的】 1. 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理原理

2、2. 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验 技术和使用方法技术和使用方法。 紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量 【实验原理】【实验原理】 蛋白质中蛋白质中酪氨酸酪氨酸、色氨酸色氨酸和苯丙氨酸和苯丙氨酸残基残基的苯的苯 环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在280nm具有一具有一 个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内内（0.1- 10mg/mL），蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光 度与其浓度成正比，因此可作蛋白质定量分析。度与其浓度成正比，因此

3、可作蛋白质定量分析。 Tyr Trp Phe 【仪器与试剂】【仪器与试剂】 1.1.紫外分光光度计，紫外分光光度计，比色皿比色皿，吸量，吸量 管。管。 2. 2.标准蛋白质溶液：标准蛋白质溶液：0.9% NaCl0.9% NaCl溶液溶液 溶解溶解0.25g0.25g结晶牛结晶牛血清蛋白血清蛋白，稀释到，稀释到250ml250ml。 3. 3.待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓 度在度在1.0-2.5mg/ml1.0-2.5mg/ml 4.0.9% NaCl 4.0.9% NaCl溶液溶液 5. 5.试管试管1.5cm1.5cm15cm15cm（9 9） 6. 6.移

4、液管移液管1ml1ml（3 3），），2ml2ml（2 2），）， 5ml5ml（2 2）。）。 【实验步骤】【实验步骤】 项 目12345678 标准蛋白液/ml00.51.01.52.02.53.04.0 蒸馏水/ml4.03.53.02.52.01.51.00 蛋白质浓度/ml00.1250.250.3750.500.6250.751.0 A280 表表1-2 1-2 紫外分光光度法测定蛋白质浓度紫外分光光度法测定蛋白质浓度-标准曲线的绘制标准曲线的绘制 1 1、标准曲线、标准曲线法法 （1 1）标准曲线的制作：取）标准曲线的制作：取8 8只试管按表只试管按表1-21-2加入试剂，摇匀。

5、选择加入试剂，摇匀。选择 光程光程1cm 1cm 石英比色皿，在石英比色皿，在280nm280nm波长测定波长测定A280A280，以，以A280A280值为纵坐标，值为纵坐标， 蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 （2 2）样品测定：）样品测定： 配制待测蛋白质溶液配制待测蛋白质溶液1ml1ml，加入蒸馏水，加入蒸馏水3ml3ml，摇匀，摇匀， 测定测定A280A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度，从标准曲线中查出蛋白质浓度。 吸吸 光光 度度 蛋白质浓度蛋白质浓度 简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收

6、使用 低浓度的盐低浓度的盐(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4 等和大多数缓冲液不干扰测定等和大多数缓冲液不干扰测定 紫紫外吸收法的外吸收法的缺点：缺点： 紫外吸收法的优点：紫外吸收法的优点： 测定测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多 在在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋 白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差 附注附注 对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀 释至

7、光密度在释至光密度在0.22.00.22.0之间，选用光程为之间，选用光程为1cm1cm的石英比色杯，的石英比色杯， 在在280nm280nm及及260nm260nm处分别测出光密度，用下面的经验公式，即处分别测出光密度，用下面的经验公式，即 可算出蛋白质的浓度可算出蛋白质的浓度。 此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的此经验公式是通过一系列已知不同浓度比例的 蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）蛋白质（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸） 的混合液所测定的数据来建立的。的混合液所测定的数据来建立的。 蛋白质浓度蛋白质浓度=1.45=1.45A280A2800.740.74A260 (mg/

8、ml)A260 (mg/ml) 分光光度计的分类分光光度计的分类 分光光度计的分类分光光度计的分类 红外分光光度计红外分光光度计: 可见光分光光度计可见光分光光度计: 紫外分光光度计紫外分光光度计: 测定波长范围为测定波长范围为大于大于760 nm的红外光区的红外光区 测定波长范围为测定波长范围为400760 nm的可见光区的可见光区 测定波长范围为测定波长范围为200200400 400 nmnm的紫外光区的紫外光区 分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括无论哪一类分光光度计都包括5 5个基本部件：光源、单个基本部件：光源、单 色器、吸收池、检测器和测量仪表。色

9、器、吸收池、检测器和测量仪表。 分光光度计各部件的次序如图所示分光光度计各部件的次序如图所示: : 分光光度计分光光度计 1光源：钨灯或卤钨灯光源：钨灯或卤钨灯可见光源可见光源 400760nm 氢灯或氘灯氢灯或氘灯紫外光源紫外光源 200400nm 2单色器：单色器：把混合光波分解为单把混合光波分解为单波长光的装置波长光的装置 3吸收池吸收池（比色皿）（比色皿） ： 玻璃玻璃能吸收能吸收UV光，仅适用于可见光区光，仅适用于可见光区 石英石英不能吸收不能吸收UV光，适用于紫外和可见光区光，适用于紫外和可见光区 4检测器：将光信号转变为电信号的装置检测器：将光信号转变为电信号的装置 5记录装置：

10、讯号处理和显示系统记录装置：讯号处理和显示系统 分光光度计使用方法（分光光度计使用方法（72007200型）型） （1 1）通电）通电-仪器自检仪器自检-预热预热20min20min； （2 2）用）用 键设置测试方式：透射比（键设置测试方式：透射比（T T），吸光度（），吸光度（A A），）， 已知标样浓度方式（已知标样浓度方式（C C）和已知标样浓度斜率（）和已知标样浓度斜率（K K）方式；）方式； （3 3）波长选择：用波长调节旋钮设置所需的单色光波长）波长选择：用波长调节旋钮设置所需的单色光波长; ; （4 4）放样顺序：打开样品室盖，在）放样顺序：打开样品室盖，在1414号放置比色皿

11、槽中，依号放置比色皿槽中，依 次放入次放入%T%T校具（黑体），参比液，样品液校具（黑体），参比液，样品液1 1和样品液和样品液2 2。 （5 5）校具（黑体）校）校具（黑体）校“0.000”0.000”：将：将%T%T校具（黑体）置入光路，校具（黑体）置入光路， 在在T T方式下按方式下按“%T”%T”键，此时仪器自动校正后显示键，此时仪器自动校正后显示“0.000”0.000” （6 6）参比液校）参比液校“100”%T100”%T或或“0.000”A0.000”A：将参比液拉入光路中，：将参比液拉入光路中， 按按“0A/100%T”0A/100%T”键调键调0A/100%T0A/100%

12、T，此时仪器显示，此时仪器显示“BLA”BLA”，表示仪器，表示仪器 正在自动校正，校正完毕后显示正在自动校正，校正完毕后显示“100”%T100”%T或或“0.000”A0.000”A后后, ,表示校表示校 正完毕，可以进行样品测定。正完毕，可以进行样品测定。 （7 7）样品测定：将两样品液分别拉入光路中，此时若在）样品测定：将两样品液分别拉入光路中，此时若在“T”T” 方式下则可依次显示样品的透射比（透光度）；若在方式下则可依次显示样品的透射比（透光度）；若在“A”A”方式下，方式下， 则显示测得的样品吸光度。则显示测得的样品吸光度。 分光光度计使用注意事项分光光度计使用注意事项 （1）

13、预热是保证实验结果准确可靠的必要步骤，不预热是保证实验结果准确可靠的必要步骤，不 可忽略。可忽略。 （2） 在波长在波长320nm以下的实验范围一定要选用石以下的实验范围一定要选用石 英比色皿，绝不可以玻璃比色皿替代。英比色皿，绝不可以玻璃比色皿替代。 （3）比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。先用比色皿的清洁程度，直接影响实验结果。先用 自来水将用过的比色皿反复冲洗，然后用蒸馏水淋自来水将用过的比色皿反复冲洗，然后用蒸馏水淋 洗，倒立于滤纸片上，待干后收回比色皿盒中。必洗，倒立于滤纸片上，待干后收回比色皿盒中。必 要时，比色皿用浓硝酸或铬酸洗液浸泡、冲洗。要时，比色皿用浓硝酸或铬酸洗液浸泡、冲洗。 (4) 比色皿内盛液应为其容量的比色皿内盛液应为其容量的2/33/4，过少会，过少会 影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，污染影响实验结果，过多易在测量过程中外溢，