第7讲种质资源的离体保存

1、第七讲 植物种质资源的保存 种质资源保存的方式 广西河池地区的九万山自然保护区 桂林花坪国家自然保护区 占地面积6.7亩，采用种茎盆栽保存，有围 墙、喷灌和遮光设施。现有圃管理和研究 人员5人，已保存国内外野生稻及其近缘种 27个种共4383份资源。 国家种质广州野生稻圃 中国轻工总会甘蔗糖业研究所海南三亚市崖城镇的 海南甘蔗育种场的种质资源圃，保存有甘蔗种质资 源2003份 水稻品种资源的保存 离体保存的意义 离体保存： 短期保存 按保存时间长短 中期保存 长期保存 一般保存 按保存方式不同 缓慢生长法保存 超低温保存 一般保存：在常规培养条件下对培养物通过 不断继代的方法进行保存的方式，属

2、于短期 培养。 如华中农大采用该种方法保存柑橘胚性愈伤 组织达16年之久。 优点：有利于种质的交换运输和去病毒，可 以随时进行扩繁，便于利用。 缺点：保存过程比较繁杂，需要不断继代培 养，如果不慎，易导致材料的污染和混淆， 且由于连续继代，常会导致遗传变异的发生。 缓慢生长保存法：通过调节培养条件，抑制 保存材料的生长，实现延长继代时间，减少 操作和劳力的保存方法。 具体的技术措施: （l）降低培养环境中的氧气浓度：如在保存 材料上覆盖一层矿物油(CaPlin 1959；Bill etal, 1989)或直接减少环境中的氧气浓度 (Engelmann etal，1990)。如印度萝芙木的保 存

3、中，10和5保存的材料在3个月内相继 死去，用聚丙醇帽代替棉塞封试管口，在 15下培养物保存9个月,成活率达100%; （2）高渗保存法： 在培养基中加入高渗物质提高培养基渗透 压，抑制培养物生长的保存方法。 高渗物质：甘露醇、山梨醇、蔗糖、 PEG（分子量6000-8000） 高渗保存配合低温条件效果更好，如6-10 低温下，培养基+4%甘露醇，可使马铃薯 保存1-2年，存活率最高达90%。 龙眼的愈伤组织： MS+1.0mg/L2,4-D+2%甘露醇，使继代时 间由20天延长至35-40天，配合16的低温， 可使继代时间延长至60天。 (3)营养控制（饥饿法）： 降低培养基中的养分，延缓材

4、料的生长速 度，达到保存的目的。 如菠萝试管苗在无菌水和1/4MS中保存一 年，存活率81%，且比保存在完全的MS培养 基中的试管苗活力强,这一技术己在美国Hilo 国家无性系资源圃菠萝种质保存中应用。 甘蔗顶芽在不添加生长调节剂的1/2MS培 养基中在18保存14个月。 香蕉茎尖在只含核糖的棉花基质中,17 下可保存2年。 (4)培养基中加入一定量的生长抑制剂： ABA、CCC、PP333、B9、青鲜素等 如在猕猴桃离体保存时,培养基中加入 0.1PPmABA 和50PPmB9 能够有效地抑制试 管苗的生长，在室温下能保存9个月(郭延平 等,1992)。 马铃薯试管苗： 4C，MS+CCC6

5、00mg/L，继代时间由100天 左右延长到240天以上。 如木薯种质资源离体保存：将试管苗继代培 养在生长抑制培养基中 ：MS+0.2mg/L NAA+80mg/L Kana +30g/L蔗糖+9g/L琼 脂,pH=5.8。 试管苗能正常生长保存2224个月以上,是 对照(不加Kana)保存时间的1012倍,且试管 苗的根系较发达、节间显著缩短、茎节数显 著增加、茎杆明显增粗、叶色浓绿, 温室移栽 成活率高达90%以上,是对照的58倍。 或加入抗生素 几种方法结合取得更好效果： 9低温下，培养基中加入甘露醇,芋每 3a继代一次，保存时间超过8年，仍有90%以 上的培养物保持活力,但其再生率显

6、著低于2 年继代一次的材料(Bessembinder etal, 1993)。 Seibi等用1/4MS培养基加入多效唑的方法 对近200个梨品种进行了离体保存(Seibi andTakao，1997)。 (5)降低培养温度： 采用控制温度来降低或完全抑制保存材 料生长的研究更为普遍。 其原理：组织的代谢活动随着温度的降低 而减弱甚至完全停止,对保存冷敏性的热带植 物,低温保存往往不易进行。 常用的温度范围有四种： 常温(1030) 常低温(0-10) 低温(0-80) 超低温(-80以下) 超低温保存法： 在-80以下的超低温中保存种质资源的 技术方法。 超低温常用的冷源有干冰（-79)、超

7、低温冰 箱（-80）、液氮（-196)及液氮蒸汽相 （-140) 优点：超低温保存可以克服常温及低温保存 过程中,由于不断继代而产生的遗传变异,并且 还可以减少工作量,减少污染等。 不同的植物材料如愈伤组织、胚轴、茎 尖、花粉、根尖、休眠芽、原生质体等。 至今已有70多种植物采用芽及茎尖分生 组织成功地进行超低温保存, 超低温保存的理论基础 （一）细胞冰冻结冰与伤害理论： 冰冻产生的伤害： 1、 胞内结冰使细胞结构破坏-机械伤害。 2、 使原生质体过度脱水，细胞内无机盐浓 度升高，破坏蛋白质和酶的结构，膜的完整 性受到伤害，即产生溶液效应。 在冷冻期间，细胞 间隙的水分 比细胞原生质体 中的水

8、分先结 冰 ，甚至低到 一15的冷冻温度下 ，原生质体仍能维持其过 冷状态 。细胞 内过冷 的水分比细胞外的冰晶体具有较高的蒸 汽压和 自由能，因而胞内的水分通过细胞壁流向胞外 ，致使胞 外冰晶体不断增长，胞 内部的溶液浓度不断提高 ，这种状况直 至胞内水分冻结为止 。果蔬组织 的冰点以及结冰速度都受到其 内部可溶性 固形物 ，如盐类 、糖类和酸类等浓度的控制。 在缓冻的情况下 ，冰晶体主要是在细胞间隙中形成 ，胞内水 分不断外流 ，原生质体中无机盐浓度不断上升 ， 达到足以沉 淀蛋白质 ，使其变性或发生不可逆 的凝 固 ，造成细胞死亡 ， 组织解体 ，质地软化 。在速冻 的情况下则不同。如速

9、冻的番 茄 ，其薄壁细胞组织在显微镜下观察，揭示出在细胞 内和胞壁 中存在的 冰晶体都是非常细小的，细胞 间隙没有扩3v，原生质 紧贴着细胞壁，阻止水分外移，这种微小的冰 晶体对组织结构 的影响很小 。在较快的解冻 中观察到对原生质 的损害也极其 微小 ，质体保存较完整 ，液泡膜有时未受损害 。保持细胞膜 的结构完整，对维持细胞 内静压是非常等，都可防止褐变。 一 般认为，冷冻造成 的果蔬组织破坏，引 起 的软化、流汁等，不是 由于低温的直接 影响，而是 由 于晶体的膨大而造成的机械 损伤。同时，细胞间隙的结冰引起细胞脱 水，盐液浓度增高，破坏原生质的胶体性 质 ，造成细胞死亡，失去新鲜特性的

10、控制 能力。 在超低温保存过程中，如能避免细胞内水 分结冰并防止解冻过程中细胞内水分再次结 冰，即可达到保存植物材料的目的。 方法和技术：进行预处理和加冷冻保护剂 （二）溶液的玻璃化理论 溶液结冰过程：经晶核形成和晶核生长过程 而固化。 溶液在降温时,如果没有均一晶核或晶核 生长缺乏足够的时间,就首先形成过冷的溶液, 它是低于冰点而不结冰的液态。 如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶; 降温速度足够快,均一晶核很少或几乎没有形 成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液 就进入不定形的玻璃化状态，玻璃化状态下 细胞内分子没有发生重排, 不会产生溶液效应 对细胞的损伤,也不会造成胞内结冰产生机械 伤

11、害。 影响超低温冷冻保存的因素： 预处理方法和技术 冷冻降温速度 保存时间 材料的性质和特点 冷冻保护剂的种类及其浓度 作为冷冻保护剂应具备下列特性： 分子量较小 易与溶剂混合 能快速渗入细胞 无毒或毒性较小 易洗脱 按保护剂功能和性质分类： 冻干保护剂：在冻结和干燥过程中，可以防止 活性组分发生变性的物质，如甘油、二甲亚砜 （DMSO）、海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）等； 填充剂：能防止有效组分随水蒸气一起升华逸 散，并使有效组分成形的物质，如甘露醇、乳 糖、明胶等； 抗氧化剂：防止植物组织和细胞在冷冻干 燥过程以及贮藏过程中发生氧化变质的物 质，如维生素D、维生素E、维生素C、蛋

12、白 质水解物、硫代硫酸钠等； 酸碱调整剂：在冷冻干燥过程和贮藏过程 中，能将生物制品的pH值调整到活性物质 的最稳定区域的物质，如磷酸、山梨醇、 EDTA（乙二胺四醋酸二纳）、氨基酸等。 冷冻保护剂的作用： （1）降低冰点，促进过冷却和“玻璃化” 状态的形成。 （2）增加细胞膜透性，加速水分外渗。 （3）提高溶液的粘滞性，阻止冰晶形成。 （4）稳定细胞内大分子的结构，防止低温 对膜的伤害。 常用的小分子冷冻保护剂： 蔗糖、海藻糖、脯氨酸、甘油； DMSO 甘露醇、山梨醇（通常作填充剂）等。 此外，一些大分子聚合物如聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）、牛血清（BSA）、右旋糖苷 （dextran）、聚乙

13、二醇（PEG）等也具有保 护作用。 聚合物类保护剂的作用和特点： 在冻结过程中优先析出； 具有一定的表面活性； 在蛋白质分子之间产生位阻作用； 提高溶液黏度； 显著提高玻璃化转变温度； 抑制小分子（如蔗糖）的结晶； 抑制溶液pH的降低。 保护剂保护剂浓度对保护效果的影响浓度对保护效果的影响 冻干 PFK活性恢复 率（%） 海藻糖浓度（mM） 海藻糖浓度对磷酸果糖激酶（PFK）的冻 干保护效果的影响 超低温保存常用的方法： 玻璃化法 包埋/脱水法 玻璃化法的特点： 在冰冻前,使用高浓度的冰冻保护剂，在 25或O处理一段时间,诱导组织脱水，然 后直接浸入液氮中,使冰冻保护剂溶液和保存 材料一同进入

14、玻璃化状态。 包埋/脱水法： 参照人工种子的技术,结合低温保存的需 要,将包埋和脱水结合起来,应用于超低温保存 中。 具体方法：用藻酸盐包埋茎尖，在含高浓 度蔗糖的培养基中预培养后，在通风橱中处 理26h或用硅胶处理，通过空气蒸发脱水, 然后进行超低温保存。 包埋/脱水法优点： 操作简便，脱水过程比较缓慢，一次能处 理较多材料,避免使用一些对细胞有毒性的冰 冻保护剂。 缺点：某些植物成苗率低，与玻璃化法相比， 组织恢复生长较慢，脱水所需的时间长。 超低温保存后细胞和组织活力检测 根本方法：再培养 染色法：FDA、酚藏花红、TTC 如王永林的试验：将马铃薯试管苗10mm长的 茎尖，用MS+5%D

15、MSO的培养基中预培养3-4 天，切取2-3mm长的茎尖置于冷冻管中，用冷 冻保护剂（30%(W/V)甘油+15%(W/V)乙 二醇+15%(W/V)二甲亚砜+0.4 mol/L蔗糖）室 温下处理20-30min，置于液氮中冷冻10、20、 30、40、50、60 min保存。在37的水浴中快 速解冻2 min，用MS+1.2 mol/L蔗糖液体培养基 洗涤2次,每次10 min后进行恢复培养，茎尖成活 率为38. 7%-42. 5%。在60min内冷冻时间对成 活率没有明显影响。 荔枝胚性愈伤的冷冻保存：摘自郭玉琼的博士论文 预处理： 1、预培养：荔枝胚性愈伤继代生长15d后,转接于 Ms+

16、50mL/LDMSO+lmg/L2,4-D+20g/L蔗糖+6g/L琼 脂糖的预培养基上,在5下低温预培养1-5d。 2、冷冻保护剂预处理：将经预培养后的胚性愈伤移 入1.8mL专用冻存管中,每管含有0.39g胚性愈伤，于常 温下用60%玻璃化溶液(2PVS2)处理20min; 再于0下用玻璃化溶液(PVS2)溶液平衡40min;移去 PVS2溶液,加入新鲜的PVS2保护剂; 3、冷冻保存：迅速将冷冻管投入液氮中保存 1周。 4、进行解冻和恢复培养，愈伤成活率为 28.46%-36.31%。 冷冻保护剂： PVS2：Ms+0.4moL/L蔗糖+30%甘油 +l5%乙二醇+l5%DMSO 2PVS2：0.15mol/L蔗糖液体培养基+PVS2 溶液体积比为40：60 解冻方法： 40水浴、室温(25左右)化冻、5