课题3-血红蛋白的提取与分离完整版

1、 宜宾县二中生物备课组宜宾县二中生物备课组 课题 3 血红蛋白的提取和分离 课题背景课题背景 蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组 计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨计划的进展以及多种生物基因组测序工作的完成，人类跨 入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用， 首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混 合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常 要做

2、的工作。要做的工作。 血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成 分负责血液中分负责血液中O2和和CO2的运偷。在本课题中，我们将以血的运偷。在本课题中，我们将以血 红蛋白为实验材抖，学习蛋白质提取和分离的一些基本才红蛋白为实验材抖，学习蛋白质提取和分离的一些基本才 技术技术 占细胞干重的占细胞干重的5050以上，细胞中含量最多的有机物以上，细胞中含量最多的有机物 关于血红蛋白关于血红蛋白 1、元素组成：、元素组成：C、H、O、N、Fe 2、分子结构、分子结构:由四条肽链组成由四条肽链组成 3、颜色：红色、颜色：红色 4、存在细胞：红细胞、存在细胞

3、：红细胞 5、生理功能：运输氧或二氧化碳、生理功能：运输氧或二氧化碳 6 、获得方法：选用哺乳动物的血液来分离、获得方法：选用哺乳动物的血液来分离 根据蛋白质各种特性的差异，根据蛋白质各种特性的差异， 如如分子的形状和大小分子的形状和大小、所带、所带电荷的性质和多少电荷的性质和多少、溶解度溶解度和和 吸附的性质吸附的性质和和对其他分子的亲和力对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不等等，可以用来分离不 同蛋白质。同蛋白质。 问：问：依据什么来分离和提取蛋白质（依据什么来分离和提取蛋白质（原理原理P65P65图图5 51313） 基础知识基础知识 阅读并回答（阅读并回答（P64P64） 1 1、凝

4、胶色谱法另一个名称；凝胶色谱法另一个名称； 2 2、凝胶色谱法分离蛋白质的依据；凝胶色谱法分离蛋白质的依据； 3 3、凝胶的实质；凝胶的实质； 4 4、凝胶色谱法的原理；凝胶色谱法的原理； 5 5、凝胶色谱法的具体过程。、凝胶色谱法的具体过程。 基础知识基础知识（一）（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法 1 1、凝胶色谱法的凝胶色谱法的别名：别名：分配色谱法分配色谱法 是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。是根据相对分予质量的大小分离蛋白质的有效方法。 4 4、凝胶、凝胶 性质：一些性质：一些微小的多孔球体微小的多孔球体，球球内含许多内含许多贯穿的通道；贯穿的通道； 化学本质：化学本质：多糖类

5、化合物：多糖类化合物： 实例：实例：葡聚糖、琼脂糖：葡聚糖、琼脂糖： 2 2、凝胶色谱法的凝胶色谱法的概念：概念： 根据被分离物质的根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，蛋白质相对分子质量的大小，利利 用具有网状结构的凝胶的用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，分子筛作用，来进行分离。来进行分离。 基础知识基础知识（一）（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法 3 3、依据的特性、依据的特性蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。 原理：原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，当不同的蛋白质通过凝胶时， （ ）的蛋白质容易进入凝）的蛋白质容易进入凝 胶内部的通道，路程（胶内部的通道，路程（ ），移动速度），移动速

6、度 （ ），而（），而（ ）的）的 蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 （ ）移动，路程（）移动，路程（ ），移），移 动速度（动速度（ ），相对分子质量不同的），相对分子质量不同的 蛋白质因此得以分离。蛋白质因此得以分离。 相对分子质量较小相对分子质量较小 较长较长 较慢较慢 相对分子质量较大相对分子质量较大 凝胶外部凝胶外部较短较短 较快较快 基础知识基础知识（一）（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法 基础知识基础知识（一）（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法 基础知识基础知识（一）（一） 凝胶色谱法凝胶色谱法 1、我们在什么地方遇到过缓冲物质的？、我们在什么地方遇到

7、过缓冲物质的？ 2、缓冲物质有哪些？、缓冲物质有哪些？ 3、缓冲溶液的作用是什么？、缓冲溶液的作用是什么？ 4、怎样配制缓冲溶液？、怎样配制缓冲溶液？ 基础知识基础知识（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 1 1、缓冲溶液概缓冲溶液概念念 在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱 或稍加稀释不引起溶液或稍加稀释不引起溶液PHPH发生明显变化的作用叫发生明显变化的作用叫 做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PHPH值的影值的影 响，维持响，维持PHPH

8、基本不变。基本不变。 缓冲溶液缓冲溶液 基础知识基础知识（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 3 3、缓冲溶液配缓冲溶液配制制 通常由通常由1 12 2种缓冲剂种缓冲剂溶解于水中配制而成。调溶解于水中配制而成。调 节缓冲剂的节缓冲剂的使用比例使用比例就可以制得在不同就可以制得在不同PHPH范围内范围内 使用的缓冲液。使用的缓冲液。 弱酸和弱酸盐组合弱酸和弱酸盐组合 4 4、缓冲溶液的缓冲溶液的组分分类组分分类 基础知识基础知识（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 弱碱和弱碱盐弱碱和弱碱盐 多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐 思考：思考： 你认为在血红蛋白的提取和分离整个实

9、验中用的缓你认为在血红蛋白的提取和分离整个实验中用的缓 冲液是什么？冲液是什么？ 它的目的是什么？它的目的是什么？ 使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内 的的PHPH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察 ( (红色红色) )和科学研究和科学研究( (活性活性) )。 基础知识基础知识（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液 生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH 下进行的，为了能够在实验室条件下下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟准确模拟生物体内

10、的生物体内的 过程，就必须保持体外的过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。因此，与体内的基本一致。因此， 缓冲溶液的正确配制和缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研的准确测定，在生物化学的研 究工作中有着极其重要的意义。究工作中有着极其重要的意义。 问：问：在生物化学的研究工作，为什么要正确配制缓冲溶液在生物化学的研究工作，为什么要正确配制缓冲溶液 和准确测定缓冲溶液的和准确测定缓冲溶液的pH？ 阅读阅读第第65页的相关内容，页的相关内容，回答回答以下问题：以下问题： 1、电泳的概念；、电泳的概念； 2、电泳的原理；、电泳的原理； 3、电泳的种类；、电泳的种类； 4、SDS的

11、作用。的作用。 基础知识基础知识（三）电泳（三）电泳 1 1、概念、概念 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2 2、原理、原理 许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解 离的基团，在一定的离的基团，在一定的PHPH下，这些基团会带上正电或负电。下，这些基团会带上正电或负电。 基础知识基础知识（三）电泳（三）电泳 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 相反的电极移动。相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以电泳利用了待分离样品

12、中各种分子带电性质的差异以 及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁 移速度，从而实现样品中各种分子的分离。移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3 3、电泳的类型、电泳的类型 琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳、 聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳。 基础知识基础知识（三）电泳（三）电泳 原理：许多重要的生物大分子，如原理：许多重要的生物大分子，如 （ ）等都具有）等都具有( ) 在在( )下，这些基团会带上下，这些基团会带上 （ ） 。在电场的作用下，这些。在电场的作用下，这些 带电分子会向着与其（带电分子会向着与其（ ） 移动

13、。电泳利用了待分离样品中各种分子移动。电泳利用了待分离样品中各种分子 （ ）以及分子本身）以及分子本身 （ ）、（）、（ ）的不同使带电分）的不同使带电分 子产生不同的（子产生不同的（ ），从而实现），从而实现 样品中各种分子的分离。样品中各种分子的分离。 多肽、核酸多肽、核酸 可解离的基团可解离的基团 正电或负电正电或负电 所带电荷相反的电极所带电荷相反的电极 带电性质的差异带电性质的差异 大小大小 形状的形状的 迁移速度迁移速度 一定的一定的PH 基础知识基础知识（三）电泳（三）电泳 十二烷基磺酸钠（十二烷基磺酸钠（SDSSDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 由单体丙烯酰胺和交联剂

14、由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 在在引发剂引发剂和和催化剂催化剂的作用下聚合交联成三维网状的作用下聚合交联成三维网状 结构的凝胶。结构的凝胶。 测定蛋白质分子量。测定蛋白质分子量。 烯烯 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 它所带它所带静电荷的多少静电荷的多少以及以及分子的大小分子的大小等因素。等因素。 原理原理 基础知识基础知识（三）电泳（三）电泳 4 4、实例、实例 SDS SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组 成的蛋白质复合体在成的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下会解

15、聚成单条肽的作用下会解聚成单条肽 链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDSSDS 能与各种蛋白质形成蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质SDSSDS复合物，复合物，SDSSDS所所 带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。 因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁 移率完全取决于分子的大小。移率完全取决于分子的大小。 SDS SDS作用机理作用机理 为了消除为了消除静电荷对迁移率的影响静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入可以在凝胶中加入SDSSDS。 基础知识基础

16、知识（三）电泳（三）电泳 为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶 中加入中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。 由几条肽链组成的蛋白质复合体在由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用的作用 下会解聚成单条肽链，下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是因此测定的结果只是 ( )。SDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质 形成蛋白质形成蛋白质SDS复合物，复合物，SDS所所带负电荷带负电荷的的 量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而因而 掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳掩盖了不同种蛋白质间的电荷差

17、别，使电泳 迁移率完全取决于迁移率完全取决于( )。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于 它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。 SDS 单条肽链的分子量单条肽链的分子量 分子的大小分子的大小 实验操作实验操作 阅读阅读课本相关内容，课本相关内容，思考思考以下问题：以下问题： 1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？、蛋白质的提取和分离一般分成几步？ 2、样品怎样处理？、样品怎样处理？ 3、蛋白质怎样分离？、蛋白质怎样分离？ 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴

18、定纯度鉴定 问：问：蛋白质提取和分离步骤？蛋白质提取和分离步骤？ 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。在红细胞的 组成中，约组成中，约9090是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成是血红蛋白。血红蛋白由四个肽链组成( (如图如图) )，包，包 括两个括两个-肽链和两个肽链和两个-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素 基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有 血红素而呈现红色。血红

19、素而呈现红色。 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，亚铁血红素基团，此基团此基团 可携带可携带一分子氧或一分子二氧化碳，一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因血红蛋白因 含有含有血红素血红素而呈红色而呈红色 血红蛋白组成及作用血红蛋白组成及作用 选材选材 本课题可选用猪、牛、羊或其他本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物哺乳动物的的 血液来分离血红蛋白。血液来分离血红蛋白。 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 1 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤 阅读阅读课本内容，课本内容，回答回答以下问题：以下问题： 1、洗涤的目的？、洗涤的

20、目的？ 2、怎样洗涤？、怎样洗涤？ 3、洗涤干净的标志是什么？、洗涤干净的标志是什么？ 1 1 除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。 2 2 采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次 3 直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 1 1、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉、速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉 淀达不到分离的效果。淀达不到分离的效果。 问：问： 1 1、洗涤操作过程中，为什么要、

21、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间低速短时间离心？离心？ 2 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？ 3 3、用质量分数为用质量分数为0.90.9的氯化钠溶液洗涤，的氯化钠溶液洗涤， 能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？ 1 1、红细胞的洗涤、红细胞的洗涤 2 2、重复洗涤三次重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞直至上清液中没有黄色，表明红细胞 已洗涤干净。已洗涤干净。 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 红细胞的洗涤红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是洗涤红细胞的目的是去除杂去除杂 蛋白蛋白

22、，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要 及时分离红细胞，分离时采用及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心低速短时间离心，如，如 500 rrain离心离心2min，然后用胶头吸管吸出上层，然后用胶头吸管吸出上层 透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入 烧杯，再加入五倍体积的生理盐水烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质量分数为质量分数为0.9 的的NaCl溶液溶液)，缓慢搅拌，缓慢搅拌10min，低速短时间离，低速短时间离 心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有

23、黄色， 表明红细胞已洗涤干净。表明红细胞已洗涤干净。 1.1.红细胞的洗涤红细胞的洗涤 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 2.2.血红蛋白的释放血红蛋白的释放 血红蛋白的释放血红蛋白的释放 将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，将洗涤好的红细胞倒入烧杯中， 加蒸馏水到原血液的体积，再加加蒸馏水到原血液的体积，再加40体积的甲苯，置于磁体积的甲苯，置于磁 力搅拌器上充分搅拌力搅拌器上充分搅拌10 min。在蒸馏水和甲苯的作用下，。在蒸馏水和甲苯的作用下， 红细胞破裂，释放出血红蛋白。红细胞破裂，释放出血红蛋白。 说出：说出：蒸馏水和甲苯的作用。蒸馏水和甲苯的作用。 实验操作实验操作 （一）样

24、品处理（一）样品处理 3.3.分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液 分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合液转移到离心将搅拌好的混合液转移到离心 管中，以管中，以2000 rmin的速度离心的速度离心10min后，可以明显看后，可以明显看 到试管中的溶液分为到试管中的溶液分为4层。从上往下数，第层。从上往下数，第1层为无色透明层为无色透明 的甲苯层，第的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀 层，第层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4 层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过

25、层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过 滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出 下层的红色透明液体。下层的红色透明液体。 问：问： 1 1、采用什么方法、采用什么方法分离血红蛋白？分离血红蛋白？ 2 2、离心分层后，各层的成分各是什么？、离心分层后，各层的成分各是什么？ 3 3、用滤纸过滤，去掉什么成分？、用滤纸过滤，去掉什么成分？ 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 取取1mL1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入 盛有盛有300mL300mL的物质的量浓度为

26、的物质的量浓度为20mmol/L20mmol/L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液 中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析12h12h。 4.4.透析透析 问：问：透析过程及透析过程及透析目的？透析目的？ 透析目的是：透析目的是：除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。 说明：说明：透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大 分分 子不能通过。子不能通过。 思考：思考：根据材料进行实验设计：现有烧杯一只、透析袋一根据材料进行实验设计：现有烧杯一只、透析袋一 个、碘液、淀粉溶液、铁架台一个、棉线若干。探究碘液、个、碘液、淀粉溶液、铁架

27、台一个、棉线若干。探究碘液、 淀粉是否能通过透析袋。写出实验步骤和结果预测。淀粉是否能通过透析袋。写出实验步骤和结果预测。 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 4.4.透析透析 实验操作实验操作 （一）样品处理（一）样品处理 阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。阅读课本相关内容，了解凝胶色谱的操作过程。 实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 注意事项：注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的 凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋凹穴底面，否

28、则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋 白质分离不彻底。白质分离不彻底。 2凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填 装柱前要将色谱柱垂直固定在支装柱前要将色谱柱垂直固定在支 架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别 很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的 凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。“G”表示凝表示凝 胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，表示凝胶得水值， 即每克凝胶膨胀时吸水即每克

29、凝胶膨胀时吸水7.59。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，。凝胶用蒸馏水充分溶胀后， 配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情 况下，况下， 一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色 谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有气泡存在，谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有气泡存在， 一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液 洗脱瓶，在约洗脱瓶，在约50 cm高的操作压下，用高的操作压下，用300 mL的物质的的物质的 量浓度为量浓度为20

30、mmolL的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液(pH为为7.0)充分洗涤平充分洗涤平 衡凝胶衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密。，使凝胶装填紧密。 实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填 问问: :1 1、凝胶的选择材料、凝胶的选择材料? G? G代表意义代表意义? ? 2 2、简单步骤、简单步骤? ? 3 3、注意点：、注意点： 实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 选择交联葡聚糖凝胶（选择交联葡聚糖凝胶（G-75G-75） “G G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围, 75, 75表示表

31、示 凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.57.5克。克。 固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡 3.3.凝胶装填时尽量紧密，以降凝胶装填时尽量紧密，以降 低凝胶颗粒之间的空隙；低凝胶颗粒之间的空隙； 装装 填凝胶柱时不得气泡存在。填凝胶柱时不得气泡存在。 （因为气泡会搅乱洗脱液中蛋因为气泡会搅乱洗脱液中蛋 白质的洗脱次序，降低分离效白质的洗脱次序，降低分离效 果。）果。） 2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填 实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 问问: :1 1、凝胶的选择材料、凝胶的选择材料?

32、 G? G代表意义代表意义? ? 2 2、简单步骤、简单步骤? ? 3 3、注意点：、注意点： 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作高的操作 压下，用压下，用300mL300mL的的20mmol/L20mmol/L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分）充分 洗涤平衡洗涤平衡12h12h。 问：问：洗涤平衡的溶液？洗涤平衡的溶液？注意什么？注意什么？ 1 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响 液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果；液体在柱内的流动与最

33、终生物大分子物质的分离效果； 2 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 2.2.凝胶色谱柱的装填凝胶色谱柱的装填 3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱 加样前，打开色谱柱下端的流加样前，打开色谱柱下端的流 出口，使柱内凝胶面上的出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，缓慢下降到与凝胶面平齐， 关闭出口。用吸管小心地将关闭出口。用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱透析后的样品加到色谱柱 的顶端的顶端(图图5-22)，注意不要破坏，注意不要破坏凝胶面凝胶面。加样后，打开

34、下端。加样后，打开下端 出口，使样品出口，使样品渗入凝胶床渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，内。等样品完全进入凝胶层后， 关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20 mmolL的的 磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH为为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶， 打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底 端时，用试管收集流出液，每端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集收集一管，连续收集 (图图521)。 实验操作实验操作 （二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 3.3.样品加入与洗脱样品加入与洗脱 调节缓冲液面调节缓冲液面 滴加透析样品滴加透析样品 吸管吸吸管吸1mL1mL样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸吸 管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面 上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭