WB试验每步原理和技术及试剂的分析

1、WB试验每步原理和技术及试剂的分析 整理by李栋 2008年9月27日星期六WB试验每步原理和技术及试剂的分析 WB蛋白印迹在生物化学这一块是常规实验，就像有人说炒菜中境界最高也最难的是蛋炒饭一样，实验中常规实验也是很考验技能的，除了潜心研究原理、认真揣摩技巧以外，对于新实验试剂的信息把握，勇于尝试新方法也是非常之重要的各大厂家都在不断开发更方便更灵敏的新产品，“idea是生产力”嘛，因此生物通这里介绍一些能把我们从日常操作中解脱出来，获得“升级版”效果WB产品。讲完了Western Blotting的电泳转移仪器，蛋白分子量标准和转移膜之后，我们最后来探讨一下WB的检测系统。一般的WB检测过

2、程中，都会有封闭、一抗、二抗和底物显色这四道工序要“加工”。我个人觉得底物显色这最后一步是最关键的，也是最有文章可以作的一个部分。你看，光标记方式就有生物素标记，地高辛标记，各种酶标记等等，酶标的底物又有各种生色底物、化学发光法底物和荧光底物可供选择；就连识别一抗的配体也不一定非要二抗不可，也可以是抗生物素蛋白，链亲和素或者Protein A或G等，更别说各种试剂盒琳琅满目，叫人好像无从下手！不过不急，生物通帮你作个参考，让你对各种产品的优点缺点一览无遗，真正成为一个WB高手。另外如果实验室有已经建立的固定的显色方法，那也没关系，有时候不经意浏览到的方法可能就会对你的实验有莫大的帮助这也就达到

3、我们的目的了。封闭和一抗的选择没有太多的选择余地封闭前面介绍过了；一抗？现在的抗体产品说明书一般都有注明应用范围的，说明可以用于WB的就OK。如果没有这些信息可以遵从以下原则：单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果。如果还有多种抗体选择，那当然是来源于兔或者小鼠抗体为好，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗。还听说有用荧光标记的一抗直接检测而降低背景和非特异结合，不过由于少了二抗的级联放大信号扩增，信号也会比较弱，所

4、以需要选择荧光信号特别明亮的标记（Invitrogen收购了著名的Molecular Probes后有推出Alexa Fluor的抗体标记试剂盒，生物通这里有详细而精彩的介绍，我们就不罗嗦了。毕竟不是WB的主流方法。）一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做23个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。二级试剂的作用是信号扩增，选择是根据一抗的标记形式而决定的，对于无标记的一抗，可以选择对应一抗来源种属的标记二抗，或者更便宜的标记蛋白A（来自金黄葡萄球菌Protein A可以高度亲和来自人，兔，豚鼠的IgG，但对大鼠、山羊和鸡的IgG

5、亲和力弱）。不过，二抗是更可靠的选择除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你准备采用的检测方法选择合适的标记。 酶促反应比同位素安全且快速，已经成为Western Blot的主流检测方法。酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法：化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen，前者灵敏度很高随着各大厂家努力开发研制灵敏度更高的发光底物，化学发光法的灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。最为大家熟悉当数辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属

6、于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、半乳糖苷酶-Galactosidase。 . HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类。对于底物的选择，主要考虑的是灵敏度、背景和使用的方便性和稳定性比如底物可溶性高使用就比较方便；对于WB来说产物不可溶有助于信号在原位的积累和结果的稳定（产物可溶的底物更适合于Elisa）。

7、HRP的生色底物显色有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。 底物 DAB 4-CN AEC TMB 学名 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride 4-chloro-1-naphthol 3-amino-9-ethyl carbazol 3,3,5,5tetramethylbenzidine 分子量 214.14 178.58 210.28

8、240.4 稳定性 好 一般 避光 好 灵敏度 250pg 1ng 100pg 背景 一般 低 高 高 终产物成像性 不能很好的成像 容易成像 容易成像 颜色 褐色 介于蓝色与蓝紫色之间 （可用于double-staining） 棕红色 蓝紫色 毒性 有（疑有治癌作用） 无 有 无 最熟悉的底物应该是33二氨基联苯胺DAB，DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。DAB的选择有一点小小的技巧33二氨基联苯胺4盐酸盐的纯品分子量为360.1，通常是深棕色粉末，不太好溶于水，容易得到有色颗粒的

9、溶液而导致膜上的背景，而且价格还被炒得贵；但是如果选择2水合33二氨基联苯胺4盐酸盐（分子量396.14）就是白色粉末状晶体，易溶，溶液无色均匀，量大价格还便宜。DAB还有溶剂形式的，便于使用。由于DAB显色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有的厂家还推出了DAB+4-CN混合底物，结合了DAB灵敏度高和4-CN背景低，易成像的优点，能获得很好的黑色沉淀成像。用金属离子增强信号的DBA显色试剂灵敏度可以高达20pg。TMB的signal-to-noise信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数；AC

10、E各方面性质与DAB相似，但灵敏度要比DAB差一点。 HRP化学发光反应底物经过多个著名厂家的不断研究开发而有了更显著的改进。Luminol是经典的HRP化学发光底物。化学发光底物主要考虑的是：发光信号强弱发光信号当然越强越好，强发光信号持续的时间也是越长越好，还有就是背景低灵敏度高。化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应般形成不溶的产物于膜上累积，所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。目前最高检测灵敏度已经达到低飞克（Femto）级别而成为安全且灵敏度最高的WB检测方法。随着Cooled-CCD技术的发展，成像系统成本越来越低，因而在现在的实验室里这些

11、设备越来越普遍。Cooled-CCD照相机与X胶片相比具有瞬时影像处理、立即输出、不需要胶片处理装置及暗室等成本花费、可用软件半定量分析等优点，然而，这项技术应用于WB化学发光法显影还要求底物能产生高强度、长持续时间的信号，以被照相机捕获到。经过各大厂家的不断开发，现在的化学发光检测试剂从以前的发光时间持续几十分钟，到现在多数试剂可持续长达几个小时到一天，新的化学发光检测试剂盒很多兼容CCD成像检测，如果是实验室有CCD成像设备的不妨留意试剂盒是否有这种说明。发光时间的延长即使对于X底片的用户也是好消息因为压片显影后如果发现压片结果不理想，还可以多次重复压片而不需要重新反应。 化学发光的常见问

12、题主要是抗体浓度过高所以抗体用量要比规定的稀释倍数放大许多，确保HRP不会过量导致底物过快消耗完而引起结果不稳定。GE Healthcare（原安玛西亚）的ECL堪称是经典，ECL在许多研究人员心目中的几乎成为化学发光法的代名词，有时竟然是高品质文章的保证之一，可见其经典。后来推出的ECL Plus和ECL Advance不单将检测灵敏度提高了1020倍，发光时间也长达24小时以上，兼容CCD成像系统的检测，使得ECL系统继续领导潮流。前不久GE Healthcare公司在生物通上发布了ECL全系列的65折特价优惠，价格相当吸引，对于ECL的忠实粉丝们实在不该错过。 ECL AdvanceEC

13、LECL PlusRecommended applicationsHighest sensitivity Western blotting primary antibody and/or target is very low abundanceRoutine Western blottingHigh sensitivity Western blotting and chemifluorescent detection on scannersSensitivityUp to 10 times greater than ECL PlusUp to 10-12gUp to 20 times grea

14、ter than ECLAntibody economyOutstandingGoodVery GoodPrimary antibodyUp to 1:100 000Up to 1:10 000Up to 1:20 000Secondary antibodyUp to 1:500 000Up to 1:15 000Up to 1:200 000Blocking Agent includedYes-ECL Advance BlockCertain systemsCertain systemsSimple reprobing protocolsYesYesYesEmission duration4

15、-6 h1-2 h24-18 hRecommended membraneHybond-P or Hybond ECLHybond ECLHybond-PRecommended detectionHyperfirm ECL/CCDHyperfirm ECL/CCDFluorescent Scanner/ Hyperfirm ECL/CCD虽然延长信号持续时间让研究人员能充分利用成像系统的所有特点，但低极限的灵敏度才是研究者期望的终极目标。除了拥有王牌产品ECL的GE公司，化学发光底物方面不得不提到Pierce公司。Pierce形象广告十分有趣鲜明：用不同色彩的手掌印来表示Pierce真的很有一手

16、:）。这家已经有半个世纪历史、在蛋白质化学领域声誉卓著的的公司6年前与HyClone合并，拥有世界上最优秀的HRP化学发光底物生产技术世界上许多知名的化学发光底物试剂盒厂商都采用PIERCE提供的化学发光底物作为生产原料。其中最耀眼的璀璨之星是SuperSignal系列，就像印证上面我们提到的选择显色系统的标准一样，SuperSignal灵敏度高（有10-12g级，10-14g级，10-15g 级选择），发光持久（6-24小时），可反复曝光，稳定性好（室温贮藏6个月，4至少是12个月），节约抗体（由于灵敏度高，一抗二抗稀释倍数是同类产品的10倍以上，这对于宝贵一抗来说十分重要）。让人几乎无法从

17、中挑出毛病来，如果说有的话，当然就是希望便宜一点，再便宜一点罗。另外需要提醒的是抗体一定要比底物显色法中稀释更多倍数，不然过于灵敏（背景高）可不能怪Supersignal哦，还有记得不能拿叠氮钠来当防腐剂因为叠氮钠会抑制HRP的作用。除此之外也要注意Pierce提供的溶液要用棕色瓶避光保存。Pierce的很有一手不仅仅于此，还有更好玩的东西不用转膜直接在PAGE胶上做Western Blot的好东西！且看生物通后面慢慢介绍。SuperSignal West Pico化学发光底物SuperSignal West Femto超灵敏型底物SuperSignal West Femto增强型底物主要优点

18、与ECL 系统相比减半的价格、双倍的信号适用于HRP检测的最灵敏的化学发光底物延长的信号持续时间使这种底物用于今天的成像设备最为理想检测下限10-12g10-15g 10-14g信号持续时间6-8小时8小时24小时首选检测方法X胶片成像设备或X胶片成像设备或X胶片建议一抗稀释度1:1000-1:50001:5,000-1:100,0001:1000-1:50,000建议二抗稀释度1:20,000-1:100,0001:100,000-1:500,0001:50,000-1:250,000产品保存期室温1年41年或室温6个月室温1年建议印迹膜硝化纤维硝化纤维或PVDF硝化纤维或PVDFWeste

19、rn Blot检测系统中常用交联酶两大家族中的另外一类就是AP碱性磷酸酶。碱性磷酸酶很早就被用于检测系统包括固定化抗原（WB）检测和核酸检测。但是做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，所以就WesternBlot本身来说偏爱HRP的要比AP多分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高。所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略

20、。AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，成像性好容易拍照。早些年前，AP检测的灵敏度比HRP高，但是背景也偏高，整个显色过程更有“技术性”，有许多个人技巧在里面，让人取舍两难。如今由于HRP系的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上HRP和AP不相上下，但是生色反应来说，AP显色的灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。 AP作为一种经典常用的显色交联酶，自有其优点，比如AP的底物显然更稳定，不像HRP那样需要新鲜配制的H2O2一类的不稳定成分，作为试剂盒可以保存时间更长，也自有一批忠实的”粉丝”（fans），特别是习惯用显色方法检测WB结果的。就像HRP可以用于化学发光和底

21、物显色一样，AP也有这两种常用的检测方法的不同底物。AP显色的灵敏度就已经可以达到低皮克级，前提是封闭要做得好。常用的是BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ，NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)和INT。 BCIP NBT BCIP/NBT BCIP/INT 学名 5-Bromo-4-chloro- 3-indolyl phosphate, toluidine salt nitro-blue tetrazolium chloride 作用 与O2反应形成沉淀 氧化反应 BCIP

22、除了可以和O2反应，也可以用NBT作为电子受体 氧化反应 灵敏度 100pg 100pg 30pg 一般 沉淀颜色 紫色 蓝紫色 蓝紫色 棕红色 用途 AP显色 AP或者葡糖氧化酶 AP，原位杂交和免疫组化 AP和免疫组化 几乎出显色剂的厂家都会生产到这几种底物，比如Roche的BCIP和INT/BCIP ，Pierce的BCIP/NBT，其中以BCIP/NBT灵敏度最高，显色也比较锐利，成像性比较好，因此也就最常用到。预配的即用型显色底物不存在颗粒性底物，较少产生斑点背景。NEB和Invitrogen也有完整的检测试剂盒。 还有一些比较特殊的各家的“法宝”，这里要拿出来“显摆显摆”。比如Pi

23、erce公司的Fast Red是为Western印迹，点印迹和免疫组化过程中检测AP而专门设计的，这种底物产生的是亮红色沉淀，经过优化，灵敏度高，其中最有趣之处在于其双染色的好处：由于这种亮红色沉淀可以与不溶的HRP底物沉淀无论是NC还是尼龙膜上都能形成醒目的对比，因此可以进行两次显色，检测不同的蛋白。但是要注意的是Fast Red要比HRP底物先加，以防背景颜色加深（Fast Red可能有毒，小心操作哟）。AP的化学发光底物可以说是未来创造WB化学酶联底物灵敏度“神话”的希望所在由于AP在催化脱磷底物方法时转换数高（转换数：每秒钟每个酶分子催化底物转变为产物的量，是酶效率的一个测量单位），可快速产生强信号，因此可以获得非常漂亮灵敏的WB结果，而且不需要像生色底物那样等待半小时才能看结果。 Invitrogen的WesternBreeze就是检测灵敏度达到Femto飞克级别的AP化学发光法检测试剂盒，而且发光持续时间长达5天！真可谓是AP发光显色中的“恒星”。迅速、安全，灵敏度可比同位素，兼容成像系统，再加上优化后的极低背景，Wester