第4章第2讲免疫学检测技术及在食品中的应用

1、第第4章章 第第2讲讲 免疫学检测技术及免疫学检测技术及 在食品安全中的应用在食品安全中的应用 荧光免疫技术荧光免疫技术 放射免疫技术放射免疫技术 酶免疫技术酶免疫技术 免疫胶体金技术免疫胶体金技术 o 利用免疫学技术可以检测细菌、真菌、病毒、利用免疫学技术可以检测细菌、真菌、病毒、 寄生虫、各种毒素、蛋白寄生虫、各种毒素、蛋白 o 还可检测激素、药物残留、抗生素及其他生还可检测激素、药物残留、抗生素及其他生 理活性物质理活性物质 1酶免疫技术酶免疫技术ELISA检测技术检测技术 ELISA o 全称：酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（enzyme- linked immuno sorben

2、t assay） p 将抗原抗体的特异性与酶反应的敏感性相结将抗原抗体的特异性与酶反应的敏感性相结 合，使得食品在未经分离提取的前提下，即合，使得食品在未经分离提取的前提下，即 能进行定性或定量检测能进行定性或定量检测 p 广泛用于细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种广泛用于细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种 毒素等大分子蛋白，以及激素、农兽药残留、毒素等大分子蛋白，以及激素、农兽药残留、 抗生素能小分子物质的检测抗生素能小分子物质的检测 可检测标本类型广泛可检测标本类型广泛 体液：体液：血清、血浆、胸腹水、灌洗液、脑脊液血清、血浆、胸腹水、灌洗液、脑脊液 分泌物：分泌物：唾液唾液 排泄物：排泄物：尿液

3、、粪便等尿液、粪便等 细胞培养上清细胞培养上清 组织匀浆组织匀浆 1.1 ELISA 的发展历程的发展历程 o 免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分免疫酶标记技术是继免疫荧光抗体技术和放射免疫分 析之后发展起来的一大新型的血清学技术。析之后发展起来的一大新型的血清学技术。 o 1966年，年，Nakane和和Avrameas等分别报道用酶等分别报道用酶 代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术用于生物代替荧光素标记抗体，建立了酶标抗体技术用于生物 组织中抗原的定位和鉴定。组织中抗原的定位和鉴定。 o 1971年，年，Engvall ，Van Weemen 等报道了酶等报道了酶 联免疫吸

4、附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技联免疫吸附试验，从而建立了酶标抗体的定量检测技 术术 o 目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子目前，免疫酶标记技术已成为免疫诊断、检测和分子 生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。生物学研究中应用最广泛的免疫学方法之一。 ELISA板板 酶标仪酶标仪 测吸光度测吸光度 ELISAELISA是一种是一种免疫免疫测定技术：基于抗原抗体反应测定技术：基于抗原抗体反应 酶联酶联：抗原或抗体的：抗原或抗体的酶标记酶标记 吸附吸附：抗原或抗体的：抗原或抗体的固相化固相化 测定测定：加入酶反应的底物后，被酶催化成为加入酶反应的底物后，被酶催化成为有色产物有色

5、产物，产物产物 的量的量与标本中与标本中受检物质的量受检物质的量直接相关，采用酶标仪进行测定直接相关，采用酶标仪进行测定 1.2 解释：酶联免疫吸附测定解释：酶联免疫吸附测定 间接法间接法 夹心法夹心法 竞争法竞争法 捕获法捕获法 1.3 类类 型型 酶酶 抗抗抗抗 体体 酶标记酶标记 抗抗体抗抗体 抗体抗体 抗原抗原 固相载体固相载体 1.将抗原包被在固相载体上。将抗原包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结再加入酶标记抗抗体，则结 合为抗原合为抗原-抗体抗体-酶标记抗抗体酶标记抗抗体 复合物

6、。复合物。 4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。 （1）间接法）间接法 间接法间接法测抗体测抗体 洗涤洗涤 洗涤洗涤 洗涤洗涤 待测抗体待测抗体 酶标抗抗体酶标抗抗体 病原体病原体抗体抗体的检测而进行传染病的诊断的检测而进行传染病的诊断 （2）双抗体夹心法双抗体夹心法 固相载体固相载体 抗体抗体 抗原抗原 酶酶 抗体抗体 酶标记抗体酶标记抗体 1.将抗体包被在固相载体上。将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗体，则结合再加入酶标记抗体，则结合 为抗体为抗体-抗原抗原-酶标记抗体复合酶标记抗体复

7、合 物。物。 4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。 夹心法夹心法测抗原测抗原 洗洗 涤涤 洗洗 涤涤 洗洗 涤涤 待测抗原待测抗原 在临床检验中，此法适用于检验各种在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原蛋白质等大分子抗原， 例如例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP、hCGhCG等等 产品举例产品举例 o 氟苯尼考（氟苯尼考（FF）ELISA快速检测试剂盒快速检测试剂盒 （Green Spring ） o 可用于动物组织（肌肉、肝脏）、尿液、血可用于动物组织（肌肉、肝脏）、尿液、血 清、蜂蜜、肠衣、牛奶以及水产品等样品中清、蜂蜜、肠衣、牛奶以及水产品等样品

8、中 氟苯尼考药物残留的检测。氟苯尼考药物残留的检测。 o 人金黄色葡萄球菌肠毒素人金黄色葡萄球菌肠毒素(SE) ELISA 检检 测试剂盒测试剂盒 （3）酶标抗原竞争法）酶标抗原竞争法 固相载体固相载体 抗体抗体 抗原抗原 酶酶 酶标记抗原酶标记抗原 1.将抗体包被在固相载体上。将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则优先如样品中含有抗原，则优先 竞争结合抗体，结合竞争结合抗体，结合 为抗原抗体复合物。为抗原抗体复合物。 3.同时加入酶标记抗原，抗原同时加入酶标记抗原，抗原 没有结合的位点酶标记抗原没有结合的位点酶标记抗原 去占据，则结合为酶标记抗去占据，则结合为酶标记抗 原原-抗体

9、复合物。抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。酶催化底物并显色。 抗原抗原 竞争法竞争法测小分子抗原测小分子抗原 洗涤洗涤 洗涤洗涤 待测抗原待测抗原 酶标抗原酶标抗原 小分子激素、药物等小分子激素、药物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。 4 捕获法示意图捕获法示意图 酶酶 抗体抗体 酶标记酶标记 抗体抗体 抗原抗原 抗抗体抗抗体 固相载体固相载体 抗体抗体 1.将抗抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗体，则结合 为抗抗体-抗体复合物。 3. 加入抗原及酶标记抗体， 则结合为抗抗体-抗体-抗原- 酶标记抗体复合物。 4.酶催化底物并显色。 固相抗固相抗IgM 特异特异IgM

10、 非特异非特异IgM 标本标本 特异抗原特异抗原 抗原特异酶标抗体抗原特异酶标抗体 底物底物 此法常用于病毒性感染的早期诊断。此法常用于病毒性感染的早期诊断。 捕获法捕获法 1.4 操作流程操作流程 o 将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包 被被(coating)(coating)。 o 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附物理吸附结结 合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与 固相载体表面的疏水基团间的作用。固相载体表面的疏水基团间的作用。 o 大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含

11、有更多的大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的 疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 （1 1） 包被包被 包被的条件包被的条件 pH9.6 pH9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 pH7.2pH7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液 pH7-8pH7-8的的TrisTris-HCL-HCL缓冲液。缓冲液。 o 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜， 3737中保温中保温2 2小时。包被浓度随载体和包被物的小时。包被浓度随载体和包被物的 性质可有很大的变化，性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶每批材料需通过实验与酶 结合

12、物的浓度协调选定。结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度一般蛋白质的包被浓度 为为10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。 （2 2）封）封 闭闭 o 封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋是继包被之后用高浓度的无关蛋 白质溶液再包被的过程。封闭就是让白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关大量不相关 的蛋白质充填这些空隙，从而排斥的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISAELISA后的步后的步 骤中干扰物质的再吸附。骤中干扰物质的再吸附。 o 常用封闭剂：常用封闭剂：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%B

13、SA; 10%的小牛血清的小牛血清 或或1%1%明胶明胶; ;脱脂奶粉脱脂奶粉, ,比较价廉，可以高浓度使用比较价廉，可以高浓度使用 （5%5%）。）。 o 所有的所有的ELISAELISA固相均需封闭。固相均需封闭。 （3 3）加样）加样 o 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚次加样步聚 o 即加样本，加酶结合物，加底物。即加样本，加酶结合物，加底物。 o 加样时应将所加物加在加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避免板孔的底部，避免 加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气 泡。泡。 （4 4）保）保 温温 o 抗

14、原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育 o 应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。 为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多 于两块板同时测定。于两块板同时测定。 （5 5）洗涤）洗涤 o 洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定 着实验的成败。着实验的成败。 o ELSIAELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 o 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的清

15、除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的 干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的， 而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下 来。来。 o 可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。 (6)(6)显色显色 o 显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温 育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的 因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，因素。在一定时间

16、内，阴性孔可保持无色， 而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当 提高温度有助于加速显色进行。提高温度有助于加速显色进行。 酶酶 o 在在ELISAELISA中，可以采用的有中，可以采用的有HRPHRP，APAP，葡萄糖，葡萄糖 氧化酶，氧化酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。 o HRPHRP（辣根过氧化物酶）（辣根过氧化物酶）是一种糖蛋白，含糖是一种糖蛋白，含糖 量约为量约为18%18%，分子量为，分子量为4400044000，是一种复合酶，是一种复合酶， 由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结 合

17、而成，是一种卟啉蛋白质。合而成，是一种卟啉蛋白质。 底物底物 o HRPHRP的底物的底物 o DH2+ H2O2 D+ 2H2O o DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色一般为无色化合物，经酶作用后成为有色 的产物。的产物。 o DH2如：邻苯二胺如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺、四甲基联苯胺 (TMB)等。等。 o OPDOPD氧化后的产物呈氧化后的产物呈橙红色橙红色，用酸终止酶反，用酸终止酶反 应后，在应后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高处有最高吸收峰，灵敏度高 o TMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显作用后共产物显蓝色蓝色。TMBTMB性质较性质较 稳定

18、，可配成溶液试剂，只需与稳定，可配成溶液试剂，只需与H H2 2O O2 2溶液溶液 混和即成应用液。酶反应终止后，混和即成应用液。酶反应终止后，TMBTMB产物产物 由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适 吸收波长为吸收波长为450nm450nm。 1.5ELISA 影响因素影响因素 固相载体：固相载体：ELISA ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板。中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板。 抗原：可溶性、优质、稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。抗原：可溶性、优质、稳定的制剂，纯度和免疫原性要高。 试验样品：血清、血浆或其他体液，均可作为试

19、验样品：血清、血浆或其他体液，均可作为 ELISA ELISA 的试验样品。的试验样品。 结合物：酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性，结合物：酶结合物要求稳定，具有很高的酶活性，抗原或抗体的特异性， 产量高及成本低。产量高及成本低。 底物：各种酶都有对底物的底物：各种酶都有对底物的特异性特异性，不同种类的酶要求有不同的底物。，不同种类的酶要求有不同的底物。 作用时间：加底物后终止时间？作用时间：加底物后终止时间？ 结果判断结果判断:ELISA :ELISA 的试验结果可用肉眼观察颜色反应的深浅作出判断，的试验结果可用肉眼观察颜色反应的深浅作出判断， 也可用也可用分光光度计分

20、光光度计作精确测定。作精确测定。 试验的重复性（精确度）试验的重复性（精确度） ：通常用：通常用变异系数变异系数来表示。来表示。 思考：如何研发商品化的思考：如何研发商品化的 ELISA试剂盒？试剂盒？ 需要什么原料，得到哪些组分，需要什么原料，得到哪些组分， 摸清哪些条件，才能够进行组摸清哪些条件，才能够进行组 装？装？ 2 2免疫胶体金技术免疫胶体金技术 （胶体金试纸条检测技术、胶体金层析）（胶体金试纸条检测技术、胶体金层析） 大肠杆菌大肠杆菌O157:H7快速检测快速检测 试纸（胶体金）试纸（胶体金） 2.1 2.1 简简 介介 胶体金试纸条诊断是采用胶体金免疫层胶体金试纸条诊断是采用胶

21、体金免疫层 析技术研制而成，该技术是析技术研制而成，该技术是9090年代初在免疫年代初在免疫 渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的免 疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激疫学检测技术，最先用于人绒毛膜促性腺激 素（素（HCGHCG）的测定和乙型肝炎病毒表面抗原的测定和乙型肝炎病毒表面抗原 （HBsAgHBsAg）等检测。等检测。 p胶体金胶体金（Colloidal goldColloidal gold）是氯金酸是氯金酸 （HAuClHAuCl4 4）的水溶胶，氯金酸在还原剂的作的水溶胶，氯金酸在还原剂的作 用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静用下，聚合

22、成特定大小的金颗粒，并由于静 电作用成为一种稳定的胶体状态。故称胶体电作用成为一种稳定的胶体状态。故称胶体 金金 用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、 也就是不同颜色的胶体金颗粒也就是不同颜色的胶体金颗粒 质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球质量好的胶体金：溶液呈红色，胶体金颗粒为球 形，大小均一，无棱角。形，大小均一，无棱角。 质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状质量差的胶体金：溶液呈紫色，大小不一，形状 各异。各异。 胶体金的质量判定标准胶体金的质量判定标准 p胶体金标记的原理：胶体金标记的原理： p胶体金在碱性条件下带负电荷

23、，与蛋白质分胶体金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分 子的正电荷基团静电吸引而形成牢固结合。子的正电荷基团静电吸引而形成牢固结合。 p胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸 附到胶体金颗粒表面的包被过程。附到胶体金颗粒表面的包被过程。 p标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红 色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中 2.22.2胶体金试纸条诊断技术的原理胶体金试纸条诊断技术的原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜以硝酸纤维素膜为载体，利用

24、了微孔膜 的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢 慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利慢向另一端渗移，通过抗原抗体结合，并利 用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原用胶体金呈现颜色（红色）反应，检测抗原/ / 抗体。抗体。 检测线检测线 质控线质控线 吸收垫吸收垫 样品垫样品垫 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜 胶体金垫胶体金垫 背衬背衬 （底板）（底板） 胶体金试纸条示意图胶体金试纸条示意图 2.3 分类分类 o 间接法间接法-测抗体测抗体 o 双抗夹心法双抗夹心法-测大分子抗原测大分子抗原 -食品中沙门氏菌的检测食品中沙门氏菌的检测 o 竞争法竞争法-测小分

25、子抗原测小分子抗原 -食品中瘦肉精、黄曲霉毒素的检测食品中瘦肉精、黄曲霉毒素的检测 沙门氏菌单克隆抗体沙门氏菌单克隆抗体 可能含有可能含有 沙门氏菌沙门氏菌 的样品的样品 （1）双抗夹心法检测抗原）双抗夹心法检测抗原测大分子抗原测大分子抗原 沙门氏菌多沙门氏菌多 克隆抗体克隆抗体 抗抗体抗抗体 （2）思考）思考 o竞争法的原理？竞争法的原理？ o检测线喷的是纯化的抗原，与待检测线喷的是纯化的抗原，与待 检测抗原竞争检测抗原竞争 o这种情况下的结果判定？这种情况下的结果判定？ 2.4 2.4 胶体金快速诊断技术的特点胶体金快速诊断技术的特点 p简捷快速：简捷快速：操作简单，一般只要操作简单，一般

26、只要5 5-10min -10min 就会就会 出结果，而其它方法如出结果，而其它方法如ELISAELISA需要需要1 1-2h-2h，PCR PCR 需要时间更长。需要时间更长。 p结果易于判定：结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很阴、阳性呈色很明显，肉眼很 容易判断。容易判断。 p特异性好：特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，因为该技术大多用单克隆抗体标记， 这决定了它具有很好的特异性。这决定了它具有很好的特异性。 2.5 技术分项技术分项 样品垫样品垫 吸水垫吸水垫 粘性底板粘性底板 NCNC膜膜 胶体金垫胶体金垫 干燥方法干燥方法 抗原抗体生物原料抗原抗体生物原料 胶体金制备

27、胶体金制备 标记技术标记技术 溶液喷点溶液喷点 溶液体系分析溶液体系分析 装配装配 切条切条 包装包装 （1）金标垫与样品垫的处理）金标垫与样品垫的处理 o 1，金标垫裁剪成长，金标垫裁剪成长10，宽，宽8长条长条 o 2，样品垫裁剪成长，样品垫裁剪成长30，宽，宽2.5长条长条 o 3，将裁剪好的金标垫与样品垫，分别用金标垫，将裁剪好的金标垫与样品垫，分别用金标垫 处理液与样品垫处理液浸润，放入处理液与样品垫处理液浸润，放入37温箱中烘温箱中烘 干储存在干燥器中置干储存在干燥器中置4冷库中备用。冷库中备用。 抗体抗体 Antibody 来源差异来源差异: 鼠抗鼠抗,兔抗和羊抗兔抗和羊抗 种类

28、差异种类差异: 单抗单抗,多抗多抗 腹水的处理腹水的处理: 饱和硫酸铵沉淀法饱和硫酸铵沉淀法 特异性特异性:亲和层析柱亲和层析柱 浓度浓度: 浓缩浓缩 溶解液溶解液:不含盐不含盐,例如例如PB （2）抗原抗体生物原料）抗原抗体生物原料 抗原抗原 Antigen 偶联抗原物质偶联抗原物质: BSA, OVA等等 毒品检测来源毒品检测来源: 合成抗原合成抗原 （3）标记技术）标记技术 Conjugate 容器硅化处理容器硅化处理 金颗粒制备金颗粒制备 (负电负电) 颜色与颗粒的关系颜色与颗粒的关系. 最佳标记颗粒大小最佳标记颗粒大小40nm. 蛋白质最适用量测定蛋白质最适用量测定:盐析法盐析法 （

29、4）胶体金制作流程 1，向硅化过的三角瓶中加入向硅化过的三角瓶中加入100ml去离子水，再加入去离子水，再加入1ml浓度浓度 为为1%的氯金酸的氯金酸 2,将三角瓶放入微波炉中加热，沸腾时取出，一次性迅速加将三角瓶放入微波炉中加热，沸腾时取出，一次性迅速加 入入1850l浓度浓度1%柠檬酸三钠，摇动约柠檬酸三钠，摇动约20s（柠檬酸三钠经（柠檬酸三钠经0.22滤滤 膜过滤）膜过滤） 3,再将三角瓶放入微波炉中大火再将三角瓶放入微波炉中大火1分钟，调中火继续加热五分分钟，调中火继续加热五分 钟。钟。 4，拿出来冷却，待温度降至室温时用去离子水补足到，拿出来冷却，待温度降至室温时用去离子水补足到1

30、00ml, 用用0.1M的碳酸钾调节的碳酸钾调节PH至略高于待标记蛋白的等电点，至略高于待标记蛋白的等电点，0.22过过 滤转移至硅化过的平底蓝盖瓶中。滤转移至硅化过的平底蓝盖瓶中。 5，蓝盖瓶中放入搅拌子，搅拌，向金溶液中加入蛋，蓝盖瓶中放入搅拌子，搅拌，向金溶液中加入蛋 白白,标记量为标记量为2g/ml，缓慢加入标记蛋白。，缓慢加入标记蛋白。 6,搅拌搅拌,半小时后加入浓度为半小时后加入浓度为10%的的BSA至终浓度为至终浓度为 0.2%，继续搅拌一小时。，继续搅拌一小时。 7，将标记好的溶液转至，将标记好的溶液转至50ml离心管中，离心管中， 3500rpm/min，4离心离心30min.弃去沉淀，收集上弃去沉淀，收集上