序列分析软件DNAMAN_的使用方法中文

1、序列分析软件序列分析软件DNAMAN 的的 使用方法简介使用方法简介 饶志明饶志明 博士/教授 博士生导师 江南大学生物工程学院工业微生物中心江南大学生物工程学院工业微生物中心 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江南大学工业生物技术教育部重点实验室 E-mail: nDNAMAN 是一种常用的核酸序列分析是一种常用的核酸序列分析 软件。由于它功能强大，使用方便，已软件。由于它功能强大，使用方便，已 成为一种普遍使用的成为一种普遍使用的DNA 序列分析工具。序列分析工具。 打开打开DNAMAN，可以看到如下界面：，可以看到如下界面： n 第一栏为主菜单栏。除了帮助菜单外，有十第一栏为主菜单栏。

2、除了帮助菜单外，有十 个常用主菜单，个常用主菜单， n第二栏为工具栏：第二栏为工具栏： n第三栏为浏览器栏：第三栏为浏览器栏： 在浏览器栏下方的工作在浏览器栏下方的工作 区左侧，可见区左侧，可见Channel 工具条，工具条，DNAMAN 提提 供供20 个个Channel，点击，点击Channel 工具条上相工具条上相 应的数字，即可击活相应的应的数字，即可击活相应的Channel。 n每个每个Channel 可以装入一个序列。将要分析可以装入一个序列。将要分析 的序列（的序列（DNA 序列或氨基酸序列）放入序列或氨基酸序列）放入 Channel 中可以节约存取序列时间，加快分中可以节约存取

3、序列时间，加快分 析速度。析速度。 如何使用如何使用DNAMAN 分析序列分析序列 n1将待分析序列装入将待分析序列装入Channel n通过通过File Open 命令打开待分析序列文件，则命令打开待分析序列文件，则 打开的序列自动装入默认打开的序列自动装入默认Channel。 n通过通过Sequence/Load Sequence 菜单的子菜菜单的子菜 单打开文件或将选定的部分序列装入单打开文件或将选定的部分序列装入 Channel 。 n通过通过Sequence/Current Sequence/Analysis Defination 命令打开命令打开 一个对话框，通过此对话框可以设定序

4、列的性一个对话框，通过此对话框可以设定序列的性 质（质（DNA 或蛋白质），名称，要分析的片段或蛋白质），名称，要分析的片段 等参数。等参数。 2 以不同形式显示序列以不同形式显示序列 n通过通过Sequence/Display Sequence 命令打开对话框，命令打开对话框， n根据不同的需要，可以选择显示不同的根据不同的需要，可以选择显示不同的 序列转换形式。序列转换形式。 n对话框选项说明如下：对话框选项说明如下： nSequence &Composition 显示序列和显示序列和 成分成分 2 以不同形式显示序列以不同形式显示序列 nReverse Complement Sequen

5、ce 显示待分显示待分 析序列的反向互补序列析序列的反向互补序列 nReverse Sequence 显示待分析序列的反向显示待分析序列的反向 序列序列 nComplement Sequence 显示待分析序列的显示待分析序列的 互补序列互补序列 nDouble Stranded Sequence 显示待分析序显示待分析序 列的双链序列列的双链序列 nRNA Sequence 显示待分析序列的对应显示待分析序列的对应RNA 序列序列 3DNA 序列的限制性酶切位点分析序列的限制性酶切位点分析 n将待分析的序列装入将待分析的序列装入Channel，点击要分析的，点击要分析的 Channel，然后

6、通过，然后通过Restriction/Analysis 命令打开命令打开 对话框，对话框， n参数说明如下：参数说明如下： nResults 分析结果显示分析结果显示 n其中包括：其中包括： nShow summary（显示概要）（显示概要） nShow sites on sequence（在结果中显示酶切位点）（在结果中显示酶切位点） nDraw restriction map（显示限制性酶切图）（显示限制性酶切图） nDraw restriction pattern（显示限制性酶切模式图）（显示限制性酶切模式图） 3DNA 序列的限制性酶切位点分析序列的限制性酶切位点分析 nIgnore

7、enzymes with more than（忽略大于某设（忽略大于某设 定值的酶切位点）定值的酶切位点） nIgnore enzymes with less than（忽略小于某设定（忽略小于某设定 值的酶切位点）值的酶切位点） nTarget DNA （目标（目标DNA 特性）特性） nCircular（环型（环型DNA），）， ndam/dcm methylation（dam/dcm 甲基化）甲基化） nall DNA in Sequence Channel（选择此项，在（选择此项，在 Sequence Channel 中的所有序列将被分析，如果选中的所有序列将被分析，如果选 择了择了D

8、raw restriction pattern，那么当所有的，那么当所有的 channel 中共有两条中共有两条DNA 时，则只能选择两个酶分时，则只能选择两个酶分 析，如果共有三个以上析，如果共有三个以上DNA 时，则只能用一个酶分时，则只能用一个酶分 析。）析。） n选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下选择所需的项目，然后按提示操作点击按扭，出现下 列对话框：列对话框： n参数说明如下：参数说明如下： nEnzyme n代表（代表（enzyme data file），点击旁边的下拉按钮，），点击旁边的下拉按钮， 出现两个默认选项，出现两个默认选项，restrict.enz 和和d

9、namane.enz， n如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文如果添加过自制的酶列表，则附加显示自制酶列表文 件名。件名。 n其中其中restrict.enz 数据文件包含数据文件包含180 种限制酶，种限制酶， dnamane.enz 数据文件包含数据文件包含2524 种限制酶。种限制酶。 n选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中选择其中一个数据文件，相应的酶在左边的显示框中 列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则列出（按酶名称字母表顺序），鼠标双击酶名称，则 对应的酶被选中，在右边空白框中列出。对应的酶被选中，在右边空白框中列出。 n要自制酶切列表，可以从左边酶列

10、表中双击鼠标选择多种酶（例要自制酶切列表，可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶（例 如如puc18 multiple cloning sites），）， n然后点击按钮出现下列对话框：然后点击按钮出现下列对话框： n输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可输入要保存酶列表的文件名，点击按钮即可保存。自制酶列表可 以方便分析特定的酶切位点。以方便分析特定的酶切位点。 nCutter 酶切识别序列长度；酶切识别序列长度； nEnd 酶切产生的末端，其中包括，酶切产生的末端，其中包括， nBlunt（平头末端），（平头末端）， n5Overhang（5突出粘性末端）突出粘性末端）,

11、n3Overhang(3突出粘性末端突出粘性末端)， n系统根据系统根据cutter 和和end 的设定情况的设定情况,在左边酶列表中显示符合条在左边酶列表中显示符合条 件的酶。最后，点击按钮执行操作。件的酶。最后，点击按钮执行操作。 4DNA 序列比对分析序列比对分析 （Dot Matrix Comparision） n要比较两个序列，可以使用要比较两个序列，可以使用DNAMAN 提供的序列比对工具提供的序列比对工具Dot Matrix Comparision （点矩阵比较）通过（点矩阵比较）通过 Sequense/Dot matrix comparision 命令打开比对界面，命令打开比对

12、界面， n点击对比界面左上角的按钮，出现下列点击对比界面左上角的按钮，出现下列 对话框：对话框： 参数说明如下： nSequence type 序列类型序列类型 nSequence 1 参加比对的第一序列选择框，框内选项参加比对的第一序列选择框，框内选项 说明如下：说明如下： n如果要比对的序列在如果要比对的序列在Channel 中，点击下拉箭头，选中，点击下拉箭头，选 择相应的择相应的Channel，则被选中的，则被选中的Channel 中的序列作中的序列作 为参加比对的第一序列；为参加比对的第一序列； n也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在也可以从文件夹中选择参加比对的序列，在File

13、选择选择 框上点击即可。通过框上点击即可。通过Length 选择参加比对的序列片选择参加比对的序列片 段。段。 nSequence 2 参加比对的第二序列选择框；选项说明参加比对的第二序列选择框；选项说明 同上同上 nShow Sequence 选择此项，当同源性大于设定值时，选择此项，当同源性大于设定值时， 将显示同源性；将显示同源性； nAnnotations 是否显示注释是否显示注释 nComparision 比对参数，比对参数， n其中其中Window 代表代表Window size（单位比对长度），（单位比对长度）， nMismatch 代表代表Mismatch size（单位比对长

14、度中许（单位比对长度中许 可的错配值）要快速比对，需将此项设为可的错配值）要快速比对，需将此项设为0。 nBoth stran 代表代表Both strand（双链比对）选择此项，（双链比对）选择此项， 是指用是指用Sequence 2 中的序列的正链和负链分别和中的序列的正链和负链分别和 Sequence 1 比较。比较。 nSequence 2 正链与正链与Sequence 1 比较结果用黑色点比较结果用黑色点 表示，表示，Sequence 2 负链比对结果用红色点表示。负链比对结果用红色点表示。 nPlot box 点阵图表显示参数，点阵图表显示参数， nPosition（起点坐标）（起

15、点坐标） nWidth（宽度值）（宽度值） nHeight（高度值）（高度值） nFrame size（边框线粗度值）（边框线粗度值） nDot size（点粗度值）（点粗度值） nGridline（虚线框数）。（虚线框数）。 n参数设定好后，点击按钮执行操作。参数设定好后，点击按钮执行操作。 5序列同源性分析序列同源性分析 n（1）两序列同源性分析）两序列同源性分析 n通过通过Sequence/Two Sequence Alignment 命令打命令打 开对话框，如下所示：开对话框，如下所示： n参数说明如下：参数说明如下： nAlignment method 比对方法，比对方法， n通常可

16、选通常可选Quick(快速比对快速比对)或或Smith&Waterman(最最 佳比对佳比对)， n当选择快速比对时，设置较小的当选择快速比对时，设置较小的k-tuple 值，可以提值，可以提 高精确度，高精确度， n当序列较长时，一般要设置较大的当序列较长时，一般要设置较大的k-tuple 值。值。k- tuple 值可选范围值可选范围26； n蛋白质序列：蛋白质序列：k-tuple 值可选范围值可选范围13。 （2）多序列同源性分析）多序列同源性分析 n通过打开通过打开Sequence/Multiple Sequence Alignment 命令打开对话框，命令打开对话框， n参数说明如下

17、：参数说明如下： nFile 从文件中选择参加比对的序列从文件中选择参加比对的序列 nFolder 从文件夹中选择参加比对的序列从文件夹中选择参加比对的序列 nChannel 从从channel 中选择参加比对的序列中选择参加比对的序列 nDbase 从数据库中选择参加比对的序列从数据库中选择参加比对的序列 nRemove 清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的清除选择的序列（鼠标点击左边显示框中的 序列名选择）序列名选择） nClear 清除全部序列清除全部序列 n点击按钮，出现方法选择对话框：点击按钮，出现方法选择对话框： n选择其中一种方法，点击按钮，出现下列对话框：选择其中一种方法，点

18、击按钮，出现下列对话框： n如果在前一对话框选择的是如果在前一对话框选择的是Fast alignment,则在此对话框中选则在此对话框中选 择择Quick alignment,否则选择否则选择 Dynamic alignment 即可。其即可。其 它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。它参数不必改变，点击对话框中间的使其它参数取原始默认值。 n点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特点击左上角按钮，可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特 性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项：性选项。点击按钮下的按钮，出现下列选择项： 可以通过这些选项，绘制同源关系图（例

19、如可以通过这些选项，绘制同源关系图（例如Tree/homology tree 命令）。命令）。 n显示蛋白质二级结构（显示蛋白质二级结构（Protein Secondary Structure 命令），命令）， n绘制限制性酶切图（绘制限制性酶切图（Restriction Analysis 命令）等。命令）等。 6.PCR 引物设计引物设计 n首先，将目标首先，将目标DNA 片段装入片段装入Channel,并激活并激活Channel。 n点击主菜单栏中的点击主菜单栏中的Primer 主菜单，出现下拉菜单，主菜单，出现下拉菜单， n点击点击Design PCR Primers for DNA 命

20、令，出现下列对话框：命令，出现下列对话框： 参数说明如下：参数说明如下： nPrimer locations on target 引物定位引物定位 n其中包括下列选项：其中包括下列选项： nProduct size（扩增目的片段大小）（扩增目的片段大小） nSense primer (正向引物选择区正向引物选择区) nAntisense primer(反向引物选择区反向引物选择区) nPrimer 引物特性包括引物特性包括Length(引物长度引物长度)，Tm 值值, GC 含量等参含量等参 数；数； nReject primer 引物过滤（将符合引物过滤条件的引物过滤掉）引物过滤（将符合引物

21、过滤条件的引物过滤掉） n包括下列选项：包括下列选项： n3dimer(可形成可形成3端自我互补的碱基数端自我互补的碱基数) nHairpin stem(可形成发卡颈环结构的碱基数可形成发卡颈环结构的碱基数) nPolyN(多聚碱基多聚碱基) n3Uique(3端严格配对碱基数端严格配对碱基数) nAll matches(引物互补配对百分数引物互补配对百分数) nConsentrations 浓度设定浓度设定 nProduct for hybridyzat nPCR 产物用于产物用于Southern Blot 探针杂交探针杂交 7画质粒模式图画质粒模式图 n我们常常要用到各种质粒图，无论是制作

22、幻灯片，还是发表文章，我们常常要用到各种质粒图，无论是制作幻灯片，还是发表文章， 常常需要质粒图。常常需要质粒图。DNAMAN 提供强大的绘质粒图功能，能满足提供强大的绘质粒图功能，能满足 我们的需要。我们的需要。 n通过通过Restriction/Draw map 命令打开质粒绘图界面：命令打开质粒绘图界面： 将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成将鼠标移动到圆圈上，等鼠标变形成“I”时，单击鼠标左键，出时，单击鼠标左键，出 现如下菜单：现如下菜单： n菜单说明如下：菜单说明如下： nPosition 当前位置当前位置 nAdd Site 添加酶切位点添加酶切位点 nAdd Element 添加要

23、素添加要素 nAdd Text 添加文字添加文字 nInsert Fragment 插入片断插入片断 nCopy Fragment 复制片断复制片断 nCut Fragment 剪切片断剪切片断 nRemove Fragment 清除片断清除片断 nFrame Thickness 边框线粗细调节边框线粗细调节 n点击点击Add Site 选项，出现对话框：选项，出现对话框： n参数说明如下：参数说明如下： nName 要添加的酶切位点的名称要添加的酶切位点的名称(例如例如HindIII) nPosition 位置（以碱基数表示）位置（以碱基数表示） n点击点击Add Element 选项，出现

24、如下对话框：选项，出现如下对话框： 参数说明如下：参数说明如下： nType 要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换）要素类型（共有三种类型，鼠标点击即可切换） nColor/Pattern 填充色（共有填充色（共有16 种颜色供选择）种颜色供选择） nName 要素名称要素名称 nStart /End/Size 要素起点要素起点/终点终点/粗细度粗细度 核酸序列的一般分析流程核酸序列的一般分析流程 n1.1 核酸序列的检索核酸序列的检索 :80/entrez/quer y.fcgi?db=Nucleotide 1.2 核酸序列的同源性分析

25、核酸序列的同源性分析 n1.2.1 基于基于NCBI/Blast软件的核酸序列同源性分析软件的核酸序列同源性分析 /blast/blast.cgi 1.2.2 核酸序列的两两比较核酸序列的两两比较 /gorf/bl2.html n1.2.3 核酸序列的批量联网同源性分析核酸序列的批量联网同源性分析(方案方案) n1.3 核酸序列的电子延伸核酸序列的电子延伸 1.3.1 利用利用UniGene数据库进行电子延伸数据库进行电子延伸(方案方案) n1.3.2 利用利用Tigem的的EST Mach

26、ine进行电子延伸进行电子延伸 EST Extractor: http:/gcg.tigem.it/blastextract/estextract.ht ml | EST Assembly: http:/www.tigem/ESTmachine.html 1.3.3 利用利用THC数据库对核酸序列进行电子延伸数据库对核酸序列进行电子延伸 http:/gcg.tigem.it/UNIBLAST/uniblast.html n1.4 核酸序列的开放阅读框架分析核酸序列的开放阅读框架分析 1.4.1基于基于NCBI/ORF finder的的ORF分析分析 http:/www.ncbi.nlm.nih

27、.gov/gorf/gorf.html n1.5 基因的电子表达谱分析基因的电子表达谱分析 n1.5.1 利用利用UniGene数据库进行电子表达谱分析（方数据库进行电子表达谱分析（方 案）案） n1.5.2利用利用Tigem的电子原位杂交服务器进行电子表达的电子原位杂交服务器进行电子表达 谱分析谱分析 http:/gcg.tigem.it/INSITU/insitublast.html n1.6 核酸序列的电子基因定位分析核酸序列的电子基因定位分析 1.6.1 利用利用STS数据库进行电子基因定位数据库进行电子基因定位 /geno me/s

28、ts/epcr.cgi 1.6.2 利用利用UniGene数据库进行电子基因数据库进行电子基因 定位（方案）定位（方案） n1.7 cDNA的基因组序列分析的基因组序列分析 1.7.1 通过从通过从NCBI查询部分基因组数据库进行基因组查询部分基因组数据库进行基因组 序列的分析序列的分析(方案方案) 1.7.2 通过从通过从NCBI查询全部基因组数据库进行基因组查询全部基因组数据库进行基因组 序列的分析序列的分析 /genome/seq/pa ge.cgi?F=HsBlast.html&ORG=Hs 1.7.3 通过从通过从Sanger Ce

29、ntre查询基因组数据库进行查询基因组数据库进行 基因组序列的分析基因组序列的分析 http:/www.sanger.ac.uk/HGP/blast_server.s html n1.8 基因组序列的初步分析基因组序列的初步分析 1.8.1 基因组序列的内含子基因组序列的内含子/外显子分析外显子分析 /urllists/ genefind.htm 1.8.2 基因组序列的启动子分析基因组序列的启动子分析 http:/www- /projects/promoter.html n1.9核酸序列的注册 1.9.1 EST序列的注册

30、(方案) 1.9.2 较长或全长cDNA序列的注册(方案) n1.10待分析序列所对应的已知克隆的获取 引 物 设 计 n引物 n引物的重要性 n引物设计的原则 n引物与PCR n引物设计软件 n如何使用Primer Premier 5.0 n引物同源性分析 引物（primers) n引物是人工合成的两段 寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。 3 3 5 5 Sense primer Antisense primer 引物的重要性 n在整个PCR体系中, 引物占有

31、十分重要的 地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特 异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR 的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行 有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结 果密切相关。 引物设计原则 n引物长度 n碱基分布的均衡性 nTm值 n引物二级结构 n引物3端 n引物5端 n引物的内部稳定性 n引物的保守性与特异性 n扩增区域的二级结构 引物长度 n一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR 或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物， 但最多不超过50个核苷酸。 碱基分布的均衡性 n同一碱基连续出现不应超过5个 nGC含量一般40-60% nGC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低 的

32、退火温度不利于提高PCR的特异性 nGC含量太高也易于引发非特异扩增。 引物Tm值 n一般要求：55-65。 n计算： n对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据 Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 n对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学 参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这 也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 nTm = H/( S + R * ln (C/4) + 16.6 log (K+/(1 + 0.7 K+) - 273.15 引物二级结构 n引物二聚体 n尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多 碱基互补 n发夹结构 n尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则 将严重影

33、响DNA聚合酶的延伸。 引物3端 n引物的延伸从3端开始，因此3端的几个 碱基与模板DNA均需严格配对，不能进 行任何修饰，否则不能进行有效的延伸， 甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码 子的简并性，引物3端最后一个碱基最好 不与密码子第三个碱基配对。 引物5端 n引物5端可以有与模板DNA不配对碱基， 在5端引入一段非模板依赖性序列。 n5端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切 位点5端加上适当数量的保护碱基）。 n5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产 物中引入该位点的点突变以作研究。 n5端标记放射性元素或非放射性物质（如生 物素、地高辛等）。 引物的内部稳定性 n过去认为，引物3端应牢

34、牢结合在模板上才能 有效地进行延伸，故3端最好为G或C。 n现在的观点认为，引物的5端应是相对稳定结 构，而3端在碱基配对的情况下最好为低稳定 性结构，即3端尽可能选用A或T，少用G或C。 n仅仅3端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低 稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。 n如果3端为富含G、C的结构，只需3端几个碱基与 模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。 引物的保守性与特异性 n保守性：通用引物检测同一类病原微 生物尽可能多的型别 n特异性：避免非特异性扩增 扩增区域的二级结构 n模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构， 在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些 区域。 n扩增区域的自由能（G。）小于 58.61kJ/mol n引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30 nTm product = 81.5 + 16.6 log (K+/(1+0.7K+) + 0.41 (%G + %C) - 500/length 引物与PCR n引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L n引物浓度(uM)=n OD33/（A312C288 G328T303-61）/VH2O VH2O (单位：L) n退火温度 n最适退火温度（Ta Opt ） = 0.3 (Tm of primer) + 0.7 (Tm of produc