藻类生长抑制实验

1、藻类生长抑制实验藻类生长抑制实验 四、实验步骤四、实验步骤 三、实验材料与方法三、实验材料与方法 二、实验原理二、实验原理 一、实验目的与内容一、实验目的与内容 主要内容主要内容 五、实验结果五、实验结果 六、注意事项六、注意事项 七、讨论与思考七、讨论与思考 实验目的与内容实验目的与内容 一、实验目的一、实验目的 1. 1. 了解藻类的生长规律；了解藻类的生长规律； 2. 2. 掌握藻类的培养方法；掌握藻类的培养方法； 3. 3. 掌握化学物质对单细胞绿藻生长影响的掌握化学物质对单细胞绿藻生长影响的 评价方法。评价方法。 二、实验内容二、实验内容 1. 运用毒理学实验方法，观察藻类在含有化学

2、污运用毒理学实验方法，观察藻类在含有化学污 染物的水环境中的生长抑制情况；染物的水环境中的生长抑制情况； 2. 求出受试化合物对藻类生长抑制的求出受试化合物对藻类生长抑制的EC50； 3. 阐明受试化合物的剂量效应关系与生长抑制阐明受试化合物的剂量效应关系与生长抑制 特征。特征。 单细胞藻类个体小、世代时间短，是水体中的初级生产者。单细胞藻类个体小、世代时间短，是水体中的初级生产者。 因为可在短期内获得化学物质对其许多世代及种群水平上的影因为可在短期内获得化学物质对其许多世代及种群水平上的影 响，所以利用污染物对藻类生长的抑制作用，能反映污染物水响，所以利用污染物对藻类生长的抑制作用，能反映污

3、染物水 平对水体中的初级生产者的作用情况。平对水体中的初级生产者的作用情况。 通过将不同浓度的受试物加到属于对数生长期的藻类中，在通过将不同浓度的受试物加到属于对数生长期的藻类中，在 规定的实验条件下继续培养，每隔规定的实验条件下继续培养，每隔24 h测定藻类种群的浓度或测定藻类种群的浓度或 生物量，以观察受试物对藻类生长的抑制作用。经方差分析或生物量，以观察受试物对藻类生长的抑制作用。经方差分析或t 检验，显著低于对照检验，显著低于对照(P 0.05)的生长率表明藻类生长受到抑制。的生长率表明藻类生长受到抑制。 实验原理实验原理 实验仪器与试剂实验仪器与试剂 1. 受试物受试物 研究藻类生长

4、抑制实验的受试物应当是挥发性低、环境稳定研究藻类生长抑制实验的受试物应当是挥发性低、环境稳定 性好且可溶于水的物质。如果需要助溶剂，它在水中的浓度不能性好且可溶于水的物质。如果需要助溶剂，它在水中的浓度不能 超过超过0.1 mL/L。 2. 藻种藻种 斜生栅藻斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)或蛋白核小球藻或蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。 3. 培养基培养基 藻类的培养基很多，其成分和浓度各不相同，小球藻和栅藻藻类的培养基很多，其成分和浓度各不相同，小球藻和栅藻 可用可用“水生水生4号号”培养基培养。培养基培养。 配制培养基时可将营养盐类按所需浓

5、度直接加入无菌蒸配制培养基时可将营养盐类按所需浓度直接加入无菌蒸 馏水或去离子水中。应按顺序逐个加入，待一种盐类完全溶解馏水或去离子水中。应按顺序逐个加入，待一种盐类完全溶解 后再加另一种。亦可先配制各种营养盐类的浓度储液，经灭菌后再加另一种。亦可先配制各种营养盐类的浓度储液，经灭菌 后避光冷藏保存。当需要配制营养基时，将一定量的浓储备液后避光冷藏保存。当需要配制营养基时，将一定量的浓储备液 摇匀，依次加入到蒸馏水或去离子水中即可。摇匀，依次加入到蒸馏水或去离子水中即可。 表表1 1 水生水生4 4号小球藻和栅藻培养基号小球藻和栅藻培养基 营养盐营养盐 含量含量(mg)营养盐营养盐 含量含量(

6、mL) (NH4)2SO4 0.200FeCl3(1%) 0.015 Ca(H2PO4)2H2O 0.030土壤浸出液土壤浸出液* 0.500 NaHCO3 0.100水水 1000 KCl 0.025 MgSO47H2O 0.080 *取少量菜园土，加取少量菜园土，加23倍自来水，煮沸倍自来水，煮沸10余分钟，冷却后用滤纸余分钟，冷却后用滤纸 过滤即可使用。过滤即可使用。 4. 实验器材实验器材 电子天平电子天平(2台台)、立式压力蒸汽灭菌器、立式压力蒸汽灭菌器(2台台)、无菌操作台、无菌操作台(4 台台)、显微镜、显微镜(4台台)、生化培养箱、生化培养箱(2台台)、pH计计(4套套)、气浴

7、恒温摇、气浴恒温摇 床床(4台台)、可见分光光度计、可见分光光度计(4台台)、数字照度计、数字照度计(2台台)、血球计、血球计(4 套套)、血小球记数板、血小球记数板(200块块)、4到到7只只30W的普通白色荧光灯、的普通白色荧光灯、 60漏斗漏斗(4个个)、锥形瓶、温度计、滤纸和纱布等若干。、锥形瓶、温度计、滤纸和纱布等若干。 5. 实验药品实验药品 硫酸铵、磷酸二氢钙、碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯硫酸铵、磷酸二氢钙、碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯 化铁均为分析纯，土壤浸出液。化铁均为分析纯，土壤浸出液。 实验步骤实验步骤 1. 藻类培养藻类培养 培养温度为：培养温度为：242 ；白色荧光灯

8、均匀光照，光照强度为；白色荧光灯均匀光照，光照强度为 4000400 lux，连续光照或以，连续光照或以12：12或或14：10光暗比光照；机光暗比光照；机 械震荡械震荡(10010次次/min)；培养容器用棉塞、滤纸、纱布；培养容器用棉塞、滤纸、纱布(23层层) 或锡箔纸等封闭，对挥发性化学物质采用磨口玻璃瓶塞完全封或锡箔纸等封闭，对挥发性化学物质采用磨口玻璃瓶塞完全封 闭。闭。 可根据实验需要选择容量不同的实验容器，可根据实验需要选择容量不同的实验容器，125 mL锥形瓶锥形瓶 中测试液的体积为中测试液的体积为40-60 mL；250 mL锥形瓶中测试液体积为锥形瓶中测试液体积为 70-1

9、00 mL；500 mL锥形瓶中测试液的体积为锥形瓶中测试液的体积为100-150 mL。 2. 藻试液的配制藻试液的配制 从储备液中取出一定的藻液，接种到新鲜的无菌培养液中，从储备液中取出一定的藻液，接种到新鲜的无菌培养液中， 接种浓度约为接种浓度约为104个个/mL。在与试验要求相同的条件下进行预。在与试验要求相同的条件下进行预 培养，要求在培养，要求在23天内藻类能达到对数生长，然后再次转移到天内藻类能达到对数生长，然后再次转移到 新鲜的培养液中。如此反复转接培养新鲜的培养液中。如此反复转接培养23次，藻类生长健壮并次，藻类生长健壮并 开始处于对数生长期时即可用来制备实验中需要的藻类试验

10、开始处于对数生长期时即可用来制备实验中需要的藻类试验 液。液。 3. 受试物试验液的配制受试物试验液的配制 根据初步试验确定产生效应的浓度范围，至少设置五个构根据初步试验确定产生效应的浓度范围，至少设置五个构 成对数间距系列的浓度，浓度比不超过成对数间距系列的浓度，浓度比不超过2.2。最低测定的浓度。最低测定的浓度 必须对海藻生长没有影响。最高测定浓度必须抑制相对对照必须对海藻生长没有影响。最高测定浓度必须抑制相对对照 实验至少实验至少50%的绿藻生长，最好使绿藻生长完全停止。至少的绿藻生长，最好使绿藻生长完全停止。至少 设置设置3个平行样，每一系列设一个对照。实验前应测定受试液个平行样，每一

11、系列设一个对照。实验前应测定受试液 的的pH，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液将，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液将pH调到调到7.50.2。试。试 验结束时应测定被测物质的实际浓度。验结束时应测定被测物质的实际浓度。 4. 测试液的配制测试液的配制 先在每个试验锥形瓶中加入先在每个试验锥形瓶中加入50mL藻液，再加藻液，再加50mL受试物受试物 溶液。对照组只加溶液。对照组只加50mL培养液。将各瓶摇动混匀后，放入培养液。将各瓶摇动混匀后，放入 光照培养箱中培养。实验开始后，每隔光照培养箱中培养。实验开始后，每隔24h(即在即在24，48h)测测 定各组藻类的细胞密度。定各组藻类的细胞密度。 1.藻类生

12、长的测定藻类生长的测定 藻类生长是指在试验期间每毫升溶液中藻类细胞藻类生长是指在试验期间每毫升溶液中藻类细胞 数目的增加量。一般用以下三种方法测定藻类的生数目的增加量。一般用以下三种方法测定藻类的生 长：细胞计数；测光密度；测叶绿素含量。长：细胞计数；测光密度；测叶绿素含量。 推荐使用方法和。推荐使用方法和。 实验结果实验结果 2. 2. 数据处理数据处理 将不同浓度试验培养液和对照培养液的藻细胞浓度与测将不同浓度试验培养液和对照培养液的藻细胞浓度与测 试时间绘制成曲线图，再用下面方法确定浓度效应关系。试时间绘制成曲线图，再用下面方法确定浓度效应关系。 生长率是单位时间内生长率是单位时间内(t

13、n-t1)藻类细胞增长的量藻类细胞增长的量(Nn-Nt)。 对数生长期的藻类平均特定生长率可用下式计算：对数生长期的藻类平均特定生长率可用下式计算： 1 1 lnln n n NN tt （1） 式中：式中： 藻类平均生长率；藻类平均生长率； 1 1 lnln n n NN tt t培养时间，培养时间，t1为起始时间，为起始时间，tn为终了时间；为终了时间； N藻类细胞生长量，藻类细胞生长量，N1为起始细胞数，为起始细胞数，Nn为为 最终细胞数。最终细胞数。 以不同浓度组中藻类生长率的下降比例与对数浓度作图，以不同浓度组中藻类生长率的下降比例与对数浓度作图， 可直接从图上读出可直接从图上读出E

14、C50，再标明测定时间，如，再标明测定时间，如24 h EC50。也。也 可求出回归关系式，再算出可求出回归关系式，再算出EC50。 表表 2 2 实验记录表格实验记录表格 时间时间 藻类平均藻类平均 生长率生长率 对照对照浓度浓度1浓度浓度2浓度浓度3浓度浓度4浓度浓度5 24 h 48 h 根据直线内插法或概率单位图解法估算根据直线内插法或概率单位图解法估算24h和和48h藻类生长藻类生长 受到抑制的受到抑制的EC50。 注意事项注意事项 1.在正式试验前必须进行必要的预试验。在正式试验前必须进行必要的预试验。 2. 实验藻种的选择和预培养应注意：藻细胞大小均匀，颜色实验藻种的选择和预培养应注意：藻细胞大小均匀，颜色 鲜绿，处于对数生长期。试验开始鲜绿，