第七章 哺乳动物胚胎干细胞技术

1、韩韩 雪雪 蕾蕾 哺乳动物胚胎干细胞技术哺乳动物胚胎干细胞技术 主要内容主要内容 一、胚胎干细胞的生物学特点一、胚胎干细胞的生物学特点 二、胚胎干细胞研究的意义二、胚胎干细胞研究的意义 三、胚胎干细胞研究的历史与进展三、胚胎干细胞研究的历史与进展 四四 .胚胎干细胞的分离培养基本程序胚胎干细胞的分离培养基本程序 五五.ES细胞的保存细胞的保存 六六.ES细胞的鉴定细胞的鉴定 七七.ES细胞技术目前存在的问题细胞技术目前存在的问题 八八.ES细胞技术的发展方向细胞技术的发展方向 干细胞 功功 能能 组织发生组织发生 全能干细胞全能干细胞 多能干细胞多能干细胞 专能干细胞专能干细胞 胚胎干细胞胚胎

2、干细胞 组织干细胞组织干细胞 干细胞分类干细胞分类 全能干细胞 Totipotent stem cells 具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各具有无限分化潜能的细胞。可以分化成人体的各 种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官，如种细胞，这些细胞构成人体的各种组织器官，如胚胎胚胎 干细胞干细胞。 多能干细胞 Multipotent stem cells 具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞，具有可分化出一种器官的多种组织潜能的干细胞， 即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有即能够形成两种或两种以上类型细胞的干细胞。具有 自我增殖和分化两种功能。自我增殖和分化两种功能。 骨髓

3、造血干细胞骨髓造血干细胞就是典型的多能干细胞，移植造血就是典型的多能干细胞，移植造血 干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。干细胞治疗白血病、再生障碍性贫血等血液疾病。 专能干细胞 多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化多能干细胞进一步分化成专能干细胞，只能分化 成某一类型的细胞。又称单能干细胞。成某一类型的细胞。又称单能干细胞。 如如表皮干细胞表皮干细胞只能分化产生角化表皮细胞。只能分化产生角化表皮细胞。 胚胎性干细胞 来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于来自早期胚胎、原始生殖细胞或畸胎瘤组织等源于 胚胎的干细胞，其基本特性是具有稳定地在体外自我更胚胎的干细胞，其基本特性是

4、具有稳定地在体外自我更 新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分新、并稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能分 化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化化为属于外胚层、中胚层和内胚层范畴的各种类型分化 细胞，甚至参与个体发育，又称为万能细胞细胞，甚至参与个体发育，又称为万能细胞 ( (Multipotent stem cells ) )。 组织干细胞 指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某指分布在成年生物体组织中负有构建和补充某 种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞种组织细胞功能的干细胞。又称为成体干细胞(Adult stem cells)。 一、胚胎干细胞的生物学特点

5、一、胚胎干细胞的生物学特点 1.定义定义 哺乳动物胚胎干细胞（哺乳动物胚胎干细胞（Embryo Derived Stem Cells）又称）又称ES或或EK细胞细胞，是从早期胚，是从早期胚 胎或胎儿中分离出来的具有发育全能性的细胎或胎儿中分离出来的具有发育全能性的细 胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面胞系。一方面具有自我更新能力，另一方面 具有分化潜能。具有分化潜能。 2.来源：来源： 囊胚的内细胞团（囊胚的内细胞团（ICM） 早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。早期胚胎的种细胞或胎儿的原始生殖细胞。 ICM在胚胎着床前：分化出原始内胚层，紧贴着囊胚在胚胎着床前：分化出原始内胚层，紧贴着

6、囊胚 腔的内层生长，最后发育为卵黄膜；腔的内层生长，最后发育为卵黄膜； ICM在胚胎着床后：分化为原始外胚层，进一步分化在胚胎着床后：分化为原始外胚层，进一步分化 为胚胎的为胚胎的3个种细胞层，进一步发育为胎儿。个种细胞层，进一步发育为胎儿。 内消呼肝胰内消呼肝胰（内胚层发育为消化系统，呼吸系统，（内胚层发育为消化系统，呼吸系统， 肝脏，胰脏）肝脏，胰脏） 外表感神仙外表感神仙（外胚层发育为表皮，感觉，神经系）（外胚层发育为表皮，感觉，神经系） 其余的是中胚层其余的是中胚层 3.细胞学特点细胞学特点 具有胚胎细胞的特性：形态上细胞体积较小，但具有胚胎细胞的特性：形态上细胞体积较小，但 是细胞核

7、较大，核质比高，核仁较大，培育时呈是细胞核较大，核质比高，核仁较大，培育时呈 克隆状生长，在功能上具有发育全能型，能进行克隆状生长，在功能上具有发育全能型，能进行 人为定向分化。人为定向分化。 普通细胞系的特性：在体外培养传代而不发生分普通细胞系的特性：在体外培养传代而不发生分 化，能进行冷冻保存和遗传改造。化，能进行冷冻保存和遗传改造。 发育全能性：发育全能性： 1）形成畸胎瘤：将）形成畸胎瘤：将ES细胞接种同源动物皮下细胞接种同源动物皮下 可形成内、中、外三种胚层细胞。可形成内、中、外三种胚层细胞。 2）形成类胚体：将）形成类胚体：将ES细胞在非黏附底物中悬细胞在非黏附底物中悬 浮培养生长

8、，或控制增殖细胞数目，形成多种浮培养生长，或控制增殖细胞数目，形成多种 系混杂的集合体系混杂的集合体 ES 细胞全能性体现在：细胞全能性体现在： 3）直系分化：通过控制）直系分化：通过控制ES细胞生长环境或遗细胞生长环境或遗 传操纵特定基因表达，传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化为某细胞可直接分化为某 特定种系细胞。新的特定种系细胞。新的ES细胞建系后在体外生长细胞建系后在体外生长 时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。时间越短，产生所有类型组织的可能性就越大。 4）形成嵌合体：组织和器官的细胞含有两个）形成嵌合体：组织和器官的细胞含有两个 或两个以上基因型构建而成的完整个体，称为或两

9、个以上基因型构建而成的完整个体，称为 基因嵌合体或嵌合体动物。将基因嵌合体或嵌合体动物。将ES细胞注射到同细胞注射到同 种动物囊胚腔中，可形成嵌合体。种动物囊胚腔中，可形成嵌合体。ES细胞或细胞或 EG细胞一旦分化即丧失全能性，难以参与胚细胞一旦分化即丧失全能性，难以参与胚 胎发育，形成嵌合体。胎发育，形成嵌合体。 4.功能功能 在滋养层细胞上或在含有分化移植因子在滋养层细胞上或在含有分化移植因子 的介质中，能维持未分化状态，并实现的介质中，能维持未分化状态，并实现 自我更新，因此可以无限增殖；自我更新，因此可以无限增殖； 在体外，在诱导因子的作用下，可以定在体外，在诱导因子的作用下，可以定

10、向分化；泌乳小鼠胚胎干细胞已经在体向分化；泌乳小鼠胚胎干细胞已经在体 外诱导分化为神经元细胞、肝细胞、脂外诱导分化为神经元细胞、肝细胞、脂 肪细胞、骨骼肌细胞黑色素细胞等。肪细胞、骨骼肌细胞黑色素细胞等。 ES细胞具有种系传递（细胞具有种系传递（germline transmission） 能力，能够形成嵌合体动物（能力，能够形成嵌合体动物（chimeric animal）。）。 若在体外把若在体外把ES细胞注射至另一胚泡细胞注射至另一胚泡 内，使之与受体胚胎细胞混合，再移植入假孕内，使之与受体胚胎细胞混合，再移植入假孕 受体子宫，可发育获得嵌合体（受体子宫，可发育获得嵌合体（chimeric

11、）。）。 ES细胞可参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发细胞可参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发 育。通过交配可以分离出带有育。通过交配可以分离出带有ES细胞遗传性状细胞遗传性状 的个体，这是的个体，这是ES细胞具有种系传递能力的一种细胞具有种系传递能力的一种 证明。证明。 5、ES细胞自我更新的分细胞自我更新的分 子机理子机理 1、LIF（白血病抑制因（白血病抑制因 子）子）:ES细胞表面的有一细胞表面的有一 复合受体，由低亲和性复合受体，由低亲和性 的的LIF受体和普通亚基受体和普通亚基 gp130构成异源二聚体，构成异源二聚体， LIF与受体结合后激活与受体结合后激活 Jak酶，通过对酶，通过

12、对STAT3的的 磷酸化激活维持细胞自磷酸化激活维持细胞自 我更新的基因。我更新的基因。 （2）转录调控因子）转录调控因子oct-4： oct-4是是ES细细 胞维持多能性和进入分化的开关，是胞维持多能性和进入分化的开关，是 DNA特异结合蛋白，通过激活或者移植特异结合蛋白，通过激活或者移植 靶基因的转录活性，维持靶基因的转录活性，维持ES细胞的自我细胞的自我 更新。在更新。在ES细胞中始终保持一定的水平，细胞中始终保持一定的水平， 表达量在表达量在50150%，才能实现自我更新，才能实现自我更新 和维持多能性。和维持多能性。 Ni Wa等（等（2000）研究表明：）研究表明：STAT3和和

13、oct-4可能作用于相同的靶基因而相互协可能作用于相同的靶基因而相互协 调维持调维持ES细胞的功能。细胞的功能。 （3）通过移植酪氨酸磷酸酶）通过移植酪氨酸磷酸酶SHP-2和细和细 胞外调节激酶胞外调节激酶ERK，维持，维持ES的正常功能：的正常功能： SHP-2能除去酪氨酸上磷酸基团，作用能除去酪氨酸上磷酸基团，作用 于于gp130受体的胞内区，使受体的胞内区，使gp130和其他和其他 的膜受体收到刺激后的膜受体收到刺激后ERK被激活。被激活。 SHP-2和和ERK对对STAT3功能有负调控作功能有负调控作 用，抑制其信号传导。用，抑制其信号传导。 二、胚胎干细胞研究的意义二、胚胎干细胞研究

14、的意义 1.ES细胞是研究哺乳动物个体发生发育规细胞是研究哺乳动物个体发生发育规 律极有价值的工具律极有价值的工具 2.是研究细胞分化的理想手段是研究细胞分化的理想手段 ES细胞仅在饲养层细胞上或添加白血病细胞仅在饲养层细胞上或添加白血病 抑制因子或白细胞介素抑制因子或白细胞介素-6家族的培养液中家族的培养液中 维持不分化状态，当培养液中添加分化维持不分化状态，当培养液中添加分化 诱导剂时可以出现定向分化，如视黄酸诱导剂时可以出现定向分化，如视黄酸 诱导分化为神经元和神经胶质细胞，诱导分化为神经元和神经胶质细胞， DMSO诱导分化为平滑肌细胞等。诱导分化为平滑肌细胞等。 通过研究通过研究ES细

15、胞的分化特点，可揭示细细胞的分化特点，可揭示细 胞内信号转导的路径，发现新的信号受胞内信号转导的路径，发现新的信号受 体，揭示细胞分化和调亡的机理。体，揭示细胞分化和调亡的机理。 3.研究基因功能的首选细胞研究基因功能的首选细胞 由于由于ES细胞具有稳定的核型，并易于诱细胞具有稳定的核型，并易于诱 捕外源基因，因此进行基因敲除或定向捕外源基因，因此进行基因敲除或定向 插入外源基因的理想细胞。插入外源基因的理想细胞。 用遗传修饰的用遗传修饰的ES细胞生产嵌合体或用细细胞生产嵌合体或用细 胞核移植技术获得的克隆后代，通过观胞核移植技术获得的克隆后代，通过观 察后代的表型变化，可探明未知基因的察后代

16、的表型变化，可探明未知基因的 生物学功能和表达调控规律。生物学功能和表达调控规律。 4.是生产转基因动物的主要方法之一是生产转基因动物的主要方法之一 用外源基因转染后，筛选阳性细胞，然用外源基因转染后，筛选阳性细胞，然 后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合获得后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合获得 嵌合体后代，用转染的嵌合体后代，用转染的ES细胞分化为生细胞分化为生 殖干细胞，生产转基因阳性动物。殖干细胞，生产转基因阳性动物。 也可把转化后的也可把转化后的ES细胞作为供体核，用细胞作为供体核，用 细胞核移植技术直接获得转基因动物。细胞核移植技术直接获得转基因动物。 5.ES细胞治疗技术将引起一场医学革命

17、细胞治疗技术将引起一场医学革命 人类面临的大多数医学难题人类面临的大多数医学难题, ,如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松、如心血管疾病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松、 癌症、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病癌症、老年性痴呆、帕金森病、严重烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等疾病 组织工程学、功能基因组学和组织工程学、功能基因组学和 蛋白质组学、发育生物学蛋白质组学、发育生物学 新药开发与药效、毒性评估等新药开发与药效、毒性评估等 6.可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选可用于研究细胞癌变机理和新药物的筛选 细胞癌变主要是由于正常的细胞周期发生紊细胞癌变主要是由

18、于正常的细胞周期发生紊 乱，细胞无序增殖所致。乱，细胞无序增殖所致。ES细胞在正常的细胞在正常的 培养环境中能维持稳定的核型，是研究致癌培养环境中能维持稳定的核型，是研究致癌 物质诱发细胞癌变机理的理想材料；物质诱发细胞癌变机理的理想材料； 在研究新药过程中，需要对药物的作用机理在研究新药过程中，需要对药物的作用机理 和药效进行研究，和药效进行研究，ES细胞在体外能分化多细胞在体外能分化多 种体细胞，可以直接作为实验材料来筛选新种体细胞，可以直接作为实验材料来筛选新 药，可缩短新药开发周期，且治疗的针对性药，可缩短新药开发周期，且治疗的针对性 强。强。 三、胚胎干细胞研究的历史与进展三、胚胎干

19、细胞研究的历史与进展 干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后 最具活力、最有影响和最有应用前景的生命科最具活力、最有影响和最有应用前景的生命科 学科研究领域；学科研究领域； 1999年干细胞研究被美国年干细胞研究被美国SCIENCE杂志评杂志评 为为1999年度世界十大科学之冠；年度世界十大科学之冠； 2000年干细胞研究再次被年干细胞研究再次被SCIENCE杂志评杂志评 为该年度世界十大科学成就之一。为该年度世界十大科学成就之一。 1981年英国剑桥大学的年英国剑桥大学的Evans和和Kaufman用延用延 缓着床的胚泡的胚胎内细胞团缓着床的胚泡的胚

20、胎内细胞团ICM （inner cells mass)获得鼠的获得鼠的ES细胞；细胞； 同年美国的同年美国的Maryin用条件培养基获得鼠的用条件培养基获得鼠的ES细细 胞。胞。Roberston用不同品系的鼠胚和具有不同遗用不同品系的鼠胚和具有不同遗 传疾病的胚胎建立了细胞系并进行了多能性和传疾病的胚胎建立了细胞系并进行了多能性和 嵌合特性的分析。嵌合特性的分析。 1998年年11月，美国威斯康星大学的科学家月，美国威斯康星大学的科学家 James Thomson等从人囊胚的内层细胞团中取等从人囊胚的内层细胞团中取 得胚胎干细胞。得胚胎干细胞。 他们把胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行他们把

21、胚胎干细胞与小鼠的骨髓间质细胞进行 了共培养。结果表明胚胎干细胞可以进行长达了共培养。结果表明胚胎干细胞可以进行长达 5个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋个月的非分化增殖，同时还保持着分化为滋 养层组织及三种胚层组织的能力。这为胚胎干养层组织及三种胚层组织的能力。这为胚胎干 细胞的临床应用奠定了基础。细胞的临床应用奠定了基础。 1999年年12月，美国科学家在月，美国科学家在美国科学院院刊美国科学院院刊 报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横横 向分化向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学为血液细胞。随后，世界各国的科学 家相继证实，成体干细胞包括人

22、类的成体干细家相继证实，成体干细胞包括人类的成体干细 胞具有可塑性。胞具有可塑性。 2000年年5月，日本启动月，日本启动“千年世纪工程千年世纪工程”，以，以 干细胞工程为核心技术的再生医疗成为这项工干细胞工程为核心技术的再生医疗成为这项工 程的四大重点之一，第一年度投资金额达程的四大重点之一，第一年度投资金额达108 亿日元。亿日元。 2001年年1月，英国议会上院通过法案，允许科月，英国议会上院通过法案，允许科 学家克隆人类早期胚胎，并利用它进行医疗研学家克隆人类早期胚胎，并利用它进行医疗研 究。究。 2001年年4月，美国科学家发现，从病人臀部和月，美国科学家发现，从病人臀部和 大腿处抽

23、取的脂肪中，含有大量类似干细胞的大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的 细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉 等。等。 l2003年，美国卫生独立研究院（年，美国卫生独立研究院（National Institutes of Health，NIH）华裔科学家施松涛）华裔科学家施松涛 等人首次发现牙齿间质存在干细胞。等人首次发现牙齿间质存在干细胞。 l2005年报出干细胞研究领域乃至全球学术界一年报出干细胞研究领域乃至全球学术界一 大学术丑闻：大学术丑闻：2004及及2005年韩国汉城大学教授年韩国汉城大学教授 黄禹锡有关干细胞研究的论文两次荣登黄禹锡

24、有关干细胞研究的论文两次荣登Science 杂志，结果经各方查证证实其论文数据存在造杂志，结果经各方查证证实其论文数据存在造 假现象，假现象，2006年年Science杂志宣布撤回这两篇论杂志宣布撤回这两篇论 文。文。 l2006年，日本科学家山中亚弥等成功诱导出鼠年，日本科学家山中亚弥等成功诱导出鼠 诱导性多能干细胞（诱导性多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cell， iPS细胞），此项研究成功将干细胞研究细胞），此项研究成功将干细胞研究 扩充到一个新的领域：重编程！扩充到一个新的领域：重编程！ l2007年，年，iPS研究取得巨大进展：山中亚弥等人研究取得巨大进

25、展：山中亚弥等人 和汤姆森带领下的华裔科学家俞君英等人分别和汤姆森带领下的华裔科学家俞君英等人分别 在在Cell及及Science发表论文宣布成功利用人类上发表论文宣布成功利用人类上 皮细胞诱导出皮细胞诱导出iPS细胞。细胞。 l2008年，美国科学家解析了年，美国科学家解析了microRNAs在干细胞发在干细胞发 育及分化中的调控作用，为干细胞日后的研究提供育及分化中的调控作用，为干细胞日后的研究提供 了非常重要的参考资料。了非常重要的参考资料。 l2009年年3月，美国白头研究所（月，美国白头研究所（Whitehead Institute） 科学家在成功诱导科学家在成功诱导iPS细胞后，巧

26、妙的将诱导细胞后，巧妙的将诱导iPS时时 带入细胞的基因去除，大大降低了细胞癌变风险。带入细胞的基因去除，大大降低了细胞癌变风险。 l2009年年3月，汤姆森和俞君英带领的研究小组在月，汤姆森和俞君英带领的研究小组在iPS 研究方面又迈进一大步，他们利用质粒作为诱导研究方面又迈进一大步，他们利用质粒作为诱导iPS 基因的载体进行诱导基因的载体进行诱导iPS细胞后，随着细胞分裂丢失细胞后，随着细胞分裂丢失 质粒，可以得到纯净无外源质粒，可以得到纯净无外源DNA的的iPS细胞，在细胞，在iPS 细胞应用安全性方面又进一步。细胞应用安全性方面又进一步。 四四 . .胚胎干细胞的分离培养基本程序胚胎干

27、细胞的分离培养基本程序 1.胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的分离 目前目前ES细胞主要有两个来源，即细胞主要有两个来源，即胚泡内细胞胚泡内细胞 团团和和生殖嵴中的原始生殖细胞生殖嵴中的原始生殖细胞，前者更为常，前者更为常 用。用。 囊胚：尽量选择体内受精的胚胎分离囊胚：尽量选择体内受精的胚胎分离ES细胞；细胞； 对于相同来源的胚胎选择色泽透亮，对于相同来源的胚胎选择色泽透亮，ICM明明 显的胚胎。显的胚胎。 胎儿性腺脊：经酶消化后，可直接培养在分胎儿性腺脊：经酶消化后，可直接培养在分 化抑制培养体系中，一般化抑制培养体系中，一般7d传代一次，直至传代一次，直至 出现细胞形态均一的克隆细胞团，挑选后

28、进出现细胞形态均一的克隆细胞团，挑选后进 行扩大培养。行扩大培养。 小鼠多用小鼠多用34天的胚泡或天的胚泡或23天的桑椹胚，天的桑椹胚， 猪取猪取810天的胚泡，天的胚泡， 绵羊取绵羊取89天的胚泡，天的胚泡， 人和牛取人和牛取78天的胚泡。天的胚泡。 原始生原始生 殖细胞殖细胞 从胚泡中分离出细胞团的方法从胚泡中分离出细胞团的方法主要免疫主要免疫 外科学方法，显微外科学方法外科学方法，显微外科学方法和和组织培组织培 养法养法等。等。 其中其中组织培养法组织培养法是将胚泡接种在饲养层是将胚泡接种在饲养层 上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然 发育过程，较易获得胚

29、胎干细胞集落。发育过程，较易获得胚胎干细胞集落。 （1）免疫外科学方法）免疫外科学方法：该法的原理是利用：该法的原理是利用 囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体 结合对细胞的作用，去除滋养层细胞，保留结合对细胞的作用，去除滋养层细胞，保留 ICM细胞进行培养。细胞进行培养。 以小鼠为例，将体外培养的小鼠胚泡去除透以小鼠为例，将体外培养的小鼠胚泡去除透 明带后，经抗小鼠脾细胞抗血清作用一定时明带后，经抗小鼠脾细胞抗血清作用一定时 间后再移入含新鲜豚鼠血清的培养液中处理，间后再移入含新鲜豚鼠血清的培养液中处理， 这样滋养层细胞即被破坏，去除死去的滋养这样滋养

30、层细胞即被破坏，去除死去的滋养 层细胞即得层细胞即得ICM，将，将ICM离散成卵裂球即可离散成卵裂球即可 接种培养。接种培养。 此法较为简单，且去除滋养层细胞较彻底，此法较为简单，且去除滋养层细胞较彻底， 最为常用。最为常用。 （2）显微外科学方法：）显微外科学方法：小鼠受精后小鼠受精后3-4天，天， 由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直 接从胚泡中吸出接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养细胞进行培养. （3）组织培养法）组织培养法:在小鼠受精在小鼠受精2.5天天后切后切 除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发 育，但延缓着床，育，但延

31、缓着床，4-6天后，从子宫中取天后，从子宫中取 胚泡进行培养。滋养层细胞生长并在培胚泡进行培养。滋养层细胞生长并在培 养皿底壁上铺展，而养皿底壁上铺展，而ICM细胞增殖，垂细胞增殖，垂 直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显 微镜下用玻璃针挑出这种柱状结构，消微镜下用玻璃针挑出这种柱状结构，消 化传代。化传代。 2.选择抑制细胞分化的培养体系选择抑制细胞分化的培养体系 由于由于ES细胞在体外培养过程中极易分化和失去正细胞在体外培养过程中极易分化和失去正 常二倍体核型，进而失去全能性或多能性和丧失常二倍体核型，进而失去全能性或多能性和丧失 形成嵌合体动物的能力，因此

32、需特殊的培养条件形成嵌合体动物的能力，因此需特殊的培养条件 阻止其分化，以确保维持其全能性或多能性。目阻止其分化，以确保维持其全能性或多能性。目 前常用的抑制细胞分化的培养体系有前常用的抑制细胞分化的培养体系有: 1、饲养层培养体系：、饲养层培养体系：先用常规的培养液如先用常规的培养液如DMEM 对体细胞进行培养，等细胞铺满低壁后，用对体细胞进行培养，等细胞铺满低壁后，用射线射线 照射，使细胞分裂停止，形成特殊的细胞层，即照射，使细胞分裂停止，形成特殊的细胞层，即 饲养层。然后将囊胚或饲养层。然后将囊胚或PGCs与饲养层细胞共培养与饲养层细胞共培养 就可抑制就可抑制ICM细胞或细胞或PGCs的

33、分化，并促进其分裂，的分化，并促进其分裂， 进一步分离获得进一步分离获得ES细胞。细胞。 此种方法效率高，结果稳定，较为常用。此种方法效率高，结果稳定，较为常用。 2、条件培养体系：直接放入到特殊的培养、条件培养体系：直接放入到特殊的培养 液中。这种培养液来源于某些细胞如豚鼠液中。这种培养液来源于某些细胞如豚鼠 肝脏细胞，人膀胱癌细胞和小鼠血管内皮肝脏细胞，人膀胱癌细胞和小鼠血管内皮 细胞等饲养一段时间后回收的液体。细胞等饲养一段时间后回收的液体。 这些细胞在生长过程中不仅能分泌这些细胞在生长过程中不仅能分泌LIF， 同时同时IGF-II等生长因子，能促进等生长因子，能促进ES细胞的细胞的 生

34、长。生长。 3、培养液中添加分化抑制因子体系：将、培养液中添加分化抑制因子体系：将 分化抑制因子分化抑制因子LIF或白介素或白介素6（IL-6）家）家 族按照一定浓度直接添加到囊胚或族按照一定浓度直接添加到囊胚或PGCs 的培养液中，分离的培养液中，分离ES细胞。细胞。 方法简单，且能避免饲养层细胞的干扰。方法简单，且能避免饲养层细胞的干扰。 目前只在小鼠目前只在小鼠ES细胞取得成功。细胞取得成功。 v小鼠采用超排卵途径收集胚胎小鼠采用超排卵途径收集胚胎 雌性成年小鼠注射雌性成年小鼠注射5U孕马血清促性腺激素（孕马血清促性腺激素（MPS），）， 48h后再注射后再注射5U人绒毛膜促性腺激素（人

35、绒毛膜促性腺激素（HCG）；）； 与雄鼠合笼，自然交配，阳性者为与雄鼠合笼，自然交配，阳性者为0天（即天（即0.5dpc）；）； 第三天至第四天中午（即第三天至第四天中午（即3.5 dpc4.5 dpc）分别剖取孕鼠子）分别剖取孕鼠子 宫，冲出早期胚泡，进一步分离培养建立宫，冲出早期胚泡，进一步分离培养建立ES细胞系；细胞系； 剖取发育至剖取发育至8.5 dpc10.5 dpc时的胚胎，可建立小鼠时的胚胎，可建立小鼠 EG细胞系。细胞系。 四、四、ES细胞和细胞和EG细胞的培养过程细胞的培养过程 vES细胞的培养过程细胞的培养过程 基本培养液 DMEM液液 15%20% FCS 0.1mmol

36、/L巯基乙醇巯基乙醇 50U/ml青霉素、青霉素、50ug/ml链霉素链霉素 -巯基乙醇是一种还原剂，其主要作用是降低氧对细胞产生的氧化损伤，体 外培养必须抑制自由基的氧化，所以-巯基乙醇是保护蛋白不被自由基氧化 的很好的高效的物质。 将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的将胚泡接种于预先铺有作为滋养层而无有丝分裂活性的 单层单层MEF细胞的培养皿中细胞的培养皿中 用免疫手术法分离胚泡的用免疫手术法分离胚泡的ICM细胞，或用常规培养法分离细胞，或用常规培养法分离 出出ICM细胞进一步培养。细胞进一步培养。 培养培养23天天 免疫手术法免疫手术法 44.5dpc的小鼠胚泡主要由已分化的

37、滋养外层胚层和未分的小鼠胚泡主要由已分化的滋养外层胚层和未分 化的化的ICM细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容细胞组成，前者细胞表面一般已表达主要组织相容 性复合体（性复合体（MHC），能识别其相应抗体和形成免疫复合物，），能识别其相应抗体和形成免疫复合物， 在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。在补体存在时可导致细胞发生免疫溶解。 具体操作如下：具体操作如下： 体外培养的胚泡，用酸性体外培养的胚泡，用酸性Tyrodes液（液（pH2.5）处理，去除透明带；）处理，去除透明带； Hanks洗涤，加入兔抗洗涤，加入兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清（抗小鼠脾脏细胞抗血清（抗H2b）；）； 移至

38、含新鲜豚鼠血清的培养液，移至含新鲜豚鼠血清的培养液， Hanks液洗涤后，移至液洗涤后，移至96孔铺有孔铺有MEF或或STO饲养层细胞和饲养层细胞和 DMEM基本培养液的板内进一步培养。基本培养液的板内进一步培养。 30min 胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而胚泡的滋养外胚层细胞呈泡状，发生免疫溶解；而ICM细胞不具细胞不具 H2b抗原，细胞完整；抗原，细胞完整； 30min 常规培养法常规培养法 未去透明带的胚泡培养未去透明带的胚泡培养34天，天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来；细胞团从贴壁胚泡内长出来； 胰蛋白酶和胰蛋白酶和EDTA混合消化液在混合消化液在37消化消化5min；

39、 解离的细胞团移至滋养层的解离的细胞团移至滋养层的24孔培养板，继续培养孔培养板，继续培养4天，可在天，可在 一些孔内见到巢状胚胎干细胞团；一些孔内见到巢状胚胎干细胞团； 胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，克隆和纯化ES细胞。细胞。 视视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。 五五.ES.ES细胞的保存细胞的保存 1.常规保存：通过不断的更换分化抑制培常规保存：通过不断的更换分化抑制培 养液，以传代培养方式维持养液，以传代培养方式维持ES的不分化的不分化 状态。如人的状态。如人的ES细胞在

40、体外培养传代细胞在体外培养传代2年年 仍维持不分化状态。仍维持不分化状态。 2.冷冻保存：通过超低温冷冻保存使细胞冷冻保存：通过超低温冷冻保存使细胞 的代谢活动完全停止，达到长期保存的的代谢活动完全停止，达到长期保存的 目的。目的。 六六.ES.ES细胞的鉴定细胞的鉴定 通过分离培养获得的通过分离培养获得的ICM或或PGCs细胞在传细胞在传 到到812代时，需要通过生化或细胞生物学指代时，需要通过生化或细胞生物学指 标的鉴定最终确认为标的鉴定最终确认为ES细胞系。细胞系。 1.形态：呈克隆状生长，即单个形态：呈克隆状生长，即单个ES细胞能繁细胞能繁 殖呈形态、功能和遗传基础完全相同的一簇殖呈形

41、态、功能和遗传基础完全相同的一簇 细胞，并凝聚成团，外观形似鸟巢。细胞，并凝聚成团，外观形似鸟巢。 2.阶段特异性胚胎抗原阶段特异性胚胎抗原(SSEA)：对细胞表面：对细胞表面 的的SSEA通过化学方法检测，先将细胞用多通过化学方法检测，先将细胞用多 聚甲醛固定，在用生物素标记的二抗和辣根聚甲醛固定，在用生物素标记的二抗和辣根 过氧化物的底物处理，来鉴定细胞表面的特过氧化物的底物处理，来鉴定细胞表面的特 异性糖蛋白。异性糖蛋白。 3.端粒酶检测：通常端粒酶检测：通常ES细胞端粒酶水平远高细胞端粒酶水平远高 于其他分化的体细胞，可用正常体细胞或癌于其他分化的体细胞，可用正常体细胞或癌 细胞做对照

42、，用专用试剂盒检测。细胞做对照，用专用试剂盒检测。 4.Apase（碱性磷酸酶）：可通过组织化学方（碱性磷酸酶）：可通过组织化学方 法鉴定，细胞经乙醇或病痛甲醛固定后，直法鉴定，细胞经乙醇或病痛甲醛固定后，直 接加入底物，即可鉴定接加入底物，即可鉴定Apase的表达水平，都的表达水平，都 应该为阳性。应该为阳性。 5.核型分析：传到核型分析：传到25代时需要进行核型分析，代时需要进行核型分析， 分析时先在细胞培养液中加入一定浓度的秋分析时先在细胞培养液中加入一定浓度的秋 水酰胺，使细胞同步在水酰胺，使细胞同步在M期，然后用低渗溶期，然后用低渗溶 液处理，经乙醇冰醋酸溶液固定后染色和显液处理，经

43、乙醇冰醋酸溶液固定后染色和显 微照相，最后进行核型分析，检测细胞是否微照相，最后进行核型分析，检测细胞是否 维持在二倍体状态。维持在二倍体状态。 6.发育分化潜力：发育分化潜力： （1）体外诱导分化：是把）体外诱导分化：是把ES细胞培养在细胞培养在 无分化抑制物的普通培养液中，如果无分化抑制物的普通培养液中，如果ES 细胞能自动聚合并分化形成胚状体，可细胞能自动聚合并分化形成胚状体，可 初步确认具有发育多能性；初步确认具有发育多能性； （2）畸胎瘤实验：把）畸胎瘤实验：把ES细胞注射到有免细胞注射到有免 疫缺陷成年小鼠或遗传同质动物的皮下疫缺陷成年小鼠或遗传同质动物的皮下 或肾脏、睾丸的被膜下

44、，如果能形成畸或肾脏、睾丸的被膜下，如果能形成畸 胎瘤，可初步判定为细胞具有多能性。胎瘤，可初步判定为细胞具有多能性。 （3）嵌合体实验：把培养的）嵌合体实验：把培养的ES细胞与早细胞与早 期胚胎的卵裂球聚合，或直接把期胚胎的卵裂球聚合，或直接把ES细胞细胞 注入囊胚腔，然后让重组胚在体内继续注入囊胚腔，然后让重组胚在体内继续 发育，通过检测后代的嵌合状况，分析发育，通过检测后代的嵌合状况，分析 ES细胞的分化潜力。只有当操作后的胚细胞的分化潜力。只有当操作后的胚 胎发育为嵌合体，注入的细胞能分化为胎发育为嵌合体，注入的细胞能分化为 内、中和外三胚层细胞，并参与细胞生内、中和外三胚层细胞，并参

45、与细胞生 殖干细胞形成时，才能确认为殖干细胞形成时，才能确认为ES细胞。细胞。 目前，只有小鼠、猴和人能到达以上指目前，只有小鼠、猴和人能到达以上指 标。标。 1 如何维持体外扩增时不分化？如何维持体外扩增时不分化？ 2 分化细胞的增殖是一个瓶颈问题：数量和纯度分化细胞的增殖是一个瓶颈问题：数量和纯度 3 如何定向诱导干细胞的分化？明确干细胞发育的如何定向诱导干细胞的分化？明确干细胞发育的 调控机制调控机制 4 胚胎干细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术胚胎干细胞真正用于器官克隆与移植仍需要技术 上的突破上的突破 5 如何克服移植排斥问题？破坏或改变细胞许多基如何克服移植排斥问题？破坏或改变细胞许多基 因的可行性，核移植是否激活卵细胞的沉默基因，因的可行性，核移植是否激活卵细胞的沉默基因， 是否改变染色体结构？是否改变染色体结构？ 6 胚胎干细胞的安全性如何？畸胎瘤，肿瘤形成？胚胎干细胞的安全性如何？畸胎瘤，肿瘤形成？ 7 伦理之争伦理之争 七七.ES.ES细胞技术目前存在的问题细胞技术目前存在的问题 1.ES细胞系的分裂效率低细胞系的分裂效率低 主要原因是缺乏理想的分离培养体